檢測fgf13基因第2外顯子突變位點的方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測FGF13基因第2外顯子突變位點的方法及其試劑盒，該方法包括步驟：1)提取樣本DNA，作為DNA模板；2)利用如SEQ ID NO.1-3所示的ARMS引物和如SEQ ID NO.11所示的探針，對DNA模板進行熒光PCR擴增；3)檢測熒光PCR擴增中的反應體系的熒光強度，并根據熒光強度達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值來判斷FGF13基因第2外顯子突變位點的突變。該試劑盒包括：SEQ ID NO.1-3所示的ARMS引物和一個如SEQ ID NO.11所示的探針。本發明能克服現有測序技術低通量、耗時長、檢測能力有限等缺點，且具有快速、通量高、靈敏度高等優點。
【專利說明】檢測FGF13基因第2外顯子突變位點的方法及其試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測基因突變的方法及其試劑盒，特別是涉及一種檢測 FGF13(成纖維細胞生長因子13)基因第2外顯子（EX0N 2)突變位點的方法及其試劑盒。
【背景技術】
[0002] FGF13是FGF11亞家族成員，這類FGF分子因缺乏信號肽而無法分泌，只在細胞內 發揮功能。研究發現，FGF13與X-連鎖智力障礙有關，在人類和小鼠上FGF13基因定位在X 染色體q26區段，該區域的遺傳變異可能導致Bor jeson-Forssman-Lehmann (BFLS)綜合征。 小鼠的神經發育研究發現，FGF13是微管穩定蛋白，可以聚合和穩定微管。FGF13調節大腦 皮層和海馬神經元發育和遷移，FGF13缺失會阻礙神經元從多極性向雙極性轉化，還導致軸 突或前導突起的過度分支，從而減緩神經元的遷移，造成大腦皮層和海馬結構異常，皮層丘 腦神經束的軸突分支增多。FGF13敲除小鼠的學習記憶能力受到明顯損害。臨床病例研究 發現，FGF13基因突變與兒童智力障礙密切相關。這些發現提示FGF13是一種重要的調控 神經發育和影響智力障礙綜合征的關鍵分子。
[0003] 研究顯示FGF13基因5' UTR的一個點突變在293T細胞系中導致FGF13蛋白水平 表達量下降，而相應的mRNA水平沒有發生改變。該位點位于FGF13基因2號外顯子中，基 因組物理位置為chrX: 138286301，突變為一 C>G點突變。大樣本量人群篩查發現，在302例 智力發育障礙患兒中，有3位男性患兒在該位點存在突變。3位患兒的父親均沒有攜帶這一 突變位點，而3個母親則均為攜帶突變位點的雜合體，這說明了這一位點的遺傳性。另外， 在對照組的1245位樣本中，只有2位女性為攜帶這一位點的雜合體，其頻率遠遠小于智力 障礙組。這些數據證明該突變位點對于智力發育障礙的發生起著重要的作用。
[0004]擴增阻滯突變系統（amplification refractory mutation system, ARMS)是在 PCR的基礎上發展起來的識別突變位點或多態性的技術。ARMS已成功用于基因多態性分 析，包括體細胞突變和生殖細胞突變。該技術的優點是可在大量野生DNA背景下成功分辨 出低含量的突變。
[0005] ARMS系統是基于3'端錯配原則，即在擴增反應時，若3'端堿基對形成錯配，在無 3' -5'外切酶活性的PCR系統中，鏈延伸反應會因3' -5'磷酸二酯鍵形成的障礙而受阻，因 此，只有模板鏈是特定的等位基因時，才會產生特異的擴增產物。為避免引物同靶DNA錯配 時存在錯配延伸，可在引物的3'端第2-3位引入錯配堿基，使同模板之間形成多重錯配從 而阻止錯配延伸。
[0006] 而ARMS-qPCR系統在ARMS系統上添加特異熒光探針，可提高檢測結果的特異性和 靈敏度。因而，基于ARMS-qPCR系統，對FGF13基因第2外顯子突變位點進行檢測的方法具 有進一步研究和應用的價值，以便能簡單、快捷地檢測FGF13基因第2外顯子突變位點。
【發明內容】
[0007] 本發明要解決的技術問題是提供一種檢測FGF13基因第2外顯子突變位點的方法 及其試劑盒。該方法是基于ARMS-qPCR系統的熒光PCR檢測方法，其能克服現有測序技術 低通量、耗時長、檢測能力有限等缺點，且具有快速、通量高、靈敏度高等優點。
[0008] 為解決上述技術問題，本發明的檢測FGF13基因第2外顯子突變位點的方法，包括 以下步驟：
[0009] 1)提取樣本DNA，將其作為DNA模板；
[0010] 2)利用一組如SEQ ID N0. 1-3所示的ARMS引物和一個如SEQ ID N0. 11所示的探 針（特異性雙環探針），對步驟1)的DNA模板進行熒光PCR擴增（即進行熒光PCR擴增突 變基因序列）；
[0011] 3)檢測熒光PCR擴增中的反應體系的熒光強度，并根據熒光強度達到設定的閾值 時所需要的循環次數Ct值來判斷FGF13基因第2外顯子突變位點的突變。
[0012] 所述步驟1)中，樣本包括：血液或唾液。
[0013] 所述步驟2)中，所述特異性雙環探針的5'端和3'端分別連接有熒光基團和淬滅 基團；其中，5'端的熒光基團包括：FAM、HEX、CY5或R0X，優選FAM、HEX或R0X ;3'端的淬滅 基團可包括：BHQ (如BHQ 1等）；
[0014] 所述熒光PCR擴增的總體積為20 ill的反應體系如下：
[0015]
【權利要求】
1. 一種檢測FGF13基因第2外顯子突變位點的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提取樣本DNA，將其作為DNA模板； 2) 利用一組如SEQIDNO. 1-3所示的ARMS引物和一個如SEQIDNO. 11所示的探針， 對步驟1)的DNA模板進行熒光PCR擴增； 3) 檢測熒光PCR擴增中的反應體系的熒光強度，并根據熒光強度達到設定的閾值時所 需要的循環次數Ct值來判斷FGF13基因第2外顯子突變位點的突變。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟1)中，樣本包括：血液或唾液； 步驟2)中，探針的5'端和3'端分別連接有熒光基團和淬滅基團；其中，熒光基團包 括：FAM、HEX、CY5或ROX;淬滅基團包括：BHQ。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于：所述熒光基團為FAM、HEX或ROX;淬滅基團 為BHQl。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟2)中，熒光PCR擴增的總體積為 20μ1的反應體系如下： PCR緩沖液 IxPCR緩沖液 MgClo 5.0?10.Ommol AdNTP 0.8?1.5mmol 各條引物 0.1?Ι.ΟμηιοΙ 探針 0.5?Ι.ΟμηιοΙ Taq i1^ 2.0?3.0U 2. g/μ I DNA 4.0?6·0μ1 加水補足至20 μ?: 步驟2)中，熒光PCR擴增的反應條件如下： 95°C預變性10分鐘，15個循環，94°C變性30秒，60°C退火延伸1分鐘；35個循環，94°C變性30秒，60°C退火延伸1分鐘；并且在后35個循環的退火階段檢測FAM和HEX的熒光信 號，或者檢測FAM和ROX的熒光信號。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于：所述熒光PCR擴增中的IXPCR緩沖液、 MgCl2、各dNTP和Taq酶和水均來自LIFETECH公司。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟2)中，還包括：利用如SEQID NO. 13-14所示的質控基因引物和SEQIDNO. 15所示的質控基因探針對步驟1)的DNA模板 進行熒光PCR擴增。
7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟3)中，判斷FGF13基因第2外顯 子突變位點的突變的標準為： 檢測熒光PCR擴增中的反應體系的FAM與HEX的熒光信號，或者FAM與ROX的熒光信 號，以HEX或ROX信號達到設定閾值時，表明上樣DNA量在允許范圍內，FAM信號結果可信； 以FAM達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為突變陰陽性判斷的標準，Ct值>20 : 陰性；Ct值〈20 :陽性。
8. -種用于如權利要求1?7任一項所述的方法的檢測試劑盒，其特征在于，包括：SEQ IDNO. 1-3所示的ARMS引物和一個如SEQIDNO. 11所示的探針。
9. 如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括：如SEQIDNO. 13-14 所不的質控基因引物和SEQIDNO. 15所不的質控基因探針。
10. 如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括：PCR緩沖液、MgCl2、 dNTPs和Taq酶。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450918SQ201410765797
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月11日 優先權日:2014年12月11日
【發明者】孫冰玉, 楊振興, 肖華勝 申請人:上海伯豪生物技術有限公司