大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞株腫瘤干細胞樣細胞的培養方法
【專利摘要】本發明公開了一種大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞株腫瘤干細胞樣細胞的培養方法：1)取狀態良好的對數生長期細胞；2)以10-30萬細胞/ml培養基的比例接種于培養板內；3)間隔培養一天后，以4℃1000 rpm離心5min，棄一半上清液，重新加入等量的新干細胞培養基；4)干細胞培養2-3天后，培養基出現細胞碎片，繼續隔天半量換液；5)培養一周，可見狀態好的小細胞球出現；6)培養一周，待干細胞球初步形成，細胞增殖停滯；7)繼續培養二周，使干細胞球基本形成。本發明從大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞株中分離出來腫瘤干細胞樣細胞，從而解決了腫瘤干細胞樣細胞來源少的問題，能大量提供用于進一步研究。
【專利說明】大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞株腫瘤干細胞樣細胞的培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種腫瘤干細胞樣細胞的培養方法，尤其涉及一種大鼠垂體泌乳素腺 瘤細胞株腫瘤干細胞樣細胞的培養方法。
【背景技術】
[0002] 垂體腺瘤為顱內良性腫瘤，按照內分泌激素水平分為：泌乳素腺瘤 (prolactinoma)，生長激素腺瘤（GH adenoma)，促腎上腺皮質激素釋放激素腺瘤（ACTH adenoma)，促甲狀腺激素腺瘤（TSH adenoma)，促性腺激素腺瘤（LH/FSH adenoma)和無功能 腺瘤（NFPA)。
[0003] 腫瘤干細胞報道主要關注惡性腫瘤，對于良性腫瘤干細胞樣細胞（tumor stem-like cell)報道很少。
[0004] 目前SCI收錄論文關于垂體腺瘤干細胞樣細胞培養的報道有4篇，3篇從人垂體腺 瘤標本中分離培養，其中2篇為同一個課題組發表的類似結果，另一篇是從小鼠垂體腺瘤 中分離培養，但上述報道均未區分或考慮垂體腺瘤的類型。國內論文報道有2篇，但按照目 前腫瘤干細胞鑒定標準來看并不完全符合規范，均未做裸鼠種植成瘤實驗。目前尚未有從 垂體腺瘤細胞株中成功分離培養腫瘤干細胞樣細胞的報道。
[0005] 垂體泌乳素腺瘤約占垂體瘤的30%，大部分首選藥物治療（國際垂體協會泌 乳素腺瘤診療指南，Guidelines of the Pituitary Society for the diagnosis and management of prolactinomas. Cl in Endocrinol (Oxf), 2006, 65:265-273.)，接受手術的 病例相對少，同時垂體泌乳素腺瘤為良性腫瘤，手術中獲取的標本體外培養，細胞生長緩 慢，且一般傳3-4代后就出現生長停滯，而垂體泌乳素腺瘤干細胞樣細胞需從腫瘤細胞分 離培養，這樣就出現標本來源少且培養困難的問題。
【發明內容】
[0006] 本發明就是針對上述問題，提出一種大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞株腫瘤干細胞樣細 胞的培養方法，該方法從垂體泌乳素腺瘤細胞株中分離出腫瘤干細胞樣細胞，從而為腫瘤 干細胞樣細胞的進一步大量研宄奠定基礎。
[0007] 為達到上述技術目的，本發明采用了大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞株腫瘤干細胞樣細 胞的培養方法，具體包含下列步驟：
[0008] 1)取狀態良好的對數生長期細胞，用PBS洗滌2-3次，用上述干細胞培養基重懸；
[0009] 2)以10-30萬細胞/ml培養基的比例接種于培養板內，使用24孔板培養；
[0010] 3)間隔培養一天后，以4°C lOOOrpm離心5min，棄一半上清液，重新加入等量的新 干細胞培養基；
[0011] 4)干細胞培養2-3天后，培養基出現細胞碎片，繼續隔天半量換液；
[0012] 5)培養一周，使狀態好的小細胞球出現；
[0013] 6)繼續培養一周，等干細胞球初步形成，細胞增殖停滯；
[0014] 7)繼續培養二周，使干細胞球基本形成。
[0015] 在本發明的步驟2)中，以10-30萬細胞/ml培養基的比例接種于培養板內，使用 6孔板培養。
[0016] 在本發明的一個優選實施方式中，所述的培養基以去內毒素型DMEM/F-12培養基 為基礎培養基，含有無維生素A型B-27添加劑、青霉素-鏈霉素抗生素、堿性重組大鼠成纖 維細胞生長因子以及重組大鼠表皮細胞生長因子。
[0017] 在一個優選的實施方式中，其特征在于每500mL基礎培養基中加入8-12mL無維生 素A型B-27添加劑、20000-3000U青霉素-鏈霉素抗生素、5000-15000ng堿性重組大鼠成 纖維細胞生長因子以及5000-15000ng重組大鼠表皮細胞生長因子。
[0018] 本發明從垂體泌乳素腺瘤細胞株中分離出來腫瘤干細胞樣細胞，解決了來源的問 題，能大量提供用于進一步研宄。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019] 圖1 :大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞株腫瘤干細胞樣細胞培養過程中細胞形態變化
[0020] (圖A)狀態良好的對數生長期細胞；（圖B)細胞行干細胞培養2-3天后；（圖C) 細胞行干細胞培養1周后；（圖D)細胞行干細胞培養2周后；（圖E)細胞行干細胞培養4 周后。
[0021] 圖片2大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞株腫瘤干細胞樣細胞鑒定
[0022] (圖A)細胞行干細胞培養后，流式鑒定結果顯示，-SC細胞⑶133干細胞標志物陽 性比例較細胞增加；（圖B)蛋白免疫印跡法結果顯示，-SC細胞⑶133以及NESTIN干細胞 標志物蛋白表達水平較細胞有所增加；（圖C)免疫熒光染色結果顯示，-SC細胞CD133蛋白 主要表達在細胞膜上，且表達量較細胞有所增加。
【具體實施方式】
[0023] 下面采用【具體實施方式】對本發明作進一步詳細地說明。
[0024] 實施例1
[0025] 1、干細胞培養基配方：
[0026]
【權利要求】
1. 一種大鼠垂體泌乳素腺瘤細胞株腫瘤干細胞樣細胞的培養方法，其特征在于，包括 如下步驟：1)取狀態良好的對數生長期細胞；2)以10-30萬細胞/ml培養基的比例接種于 培養板內；3)間隔培養一天后，以4°C lOOOrpm離心5min，棄一半上清液，重新加入等量的 新干細胞培養基；4)干細胞培養2-3天后，培養基出現細胞碎片，繼續隔天半量換液；5)培 養一周，可見狀態好的小細胞球出現；6)培養一周，待干細胞球初步形成，細胞增殖停滯； 7)繼續培養二周，使干細胞球基本形成。
2. 根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于，步驟2)中，以10-30萬細胞/ml培養 基的比例接種于培養板內，使用6孔板培養。
3. 根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于，所述的培養基以去內毒素型DMEM/ F-12培養基為基礎培養基，含有無維生素 A型B-27添加劑、青霉素-鏈霉素抗生素、堿性重 組大鼠成纖維細胞生長因子以及重組大鼠表皮細胞生長因子。
4. 根據權利要求3所述的培養方法，其特征在于，每500mL基礎培養基中加入8-12mL 無維生素 A型B-27添加劑、20000-3000U青霉素-鏈霉素抗生素、5000-15000ng堿性重組 大鼠成纖維細胞生長因子以及5000-15000ng重組大鼠表皮細胞生長因子。
【文檔編號】C12N5/095GK104450619SQ201410759556
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月11日 優先權日:2014年12月11日
【發明者】蘇志鵬, 蔡霖, 陳賢斌, 陳健, 盧江龍, 王成德, 李群 申請人:溫州醫科大學附屬第一醫院