腈水合酶及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種腈水合酶及其應用，該腈水合酶由α亞基和β亞基組成，所述α亞基的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，β亞基的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。本發明從博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM 12804)中克隆到腈水合酶基因，該基因表達后成功獲得具有高表達量和高活性而且底物譜廣、具手性選擇性的腈水合酶。現有腈水合酶一般對脂肪族腈化合物有較高活力，對芳香族的腈化合物一般活力很低。本發明所述的腈水合酶對芳香族腈化合物，尤其是2-異丙基對氯苯乙腈，有較高的催化活力。
【專利說明】腈水合酶及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一種腈水合酶及其應用。
【背景技術】
[0002] 腈是一種重要的化合物，在自然界中廣泛存在。腈水解的方法主要有化學水解法 和生物轉化法，其中，生物轉化法主要涉及腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶。腈水合酶是以硫 原子和半胱氨酸亞磺酸殘基為絕對中心的一類可催化腈水解的酶，可以催化腈水合生成酰 胺，酰胺酶進一步將酰胺催化水解成羧酸化合物，而腈水解酶可以直接催化腈生成羧酸化 合物。通過這些酶的酶促反應可以將腈類物質轉化為酰胺、酸、氨基化合物、酯、醇、烯胺等 價值更高、應用范圍更廣的一些化合物。因此，腈的生物催化水解反應在精細化工產品、醫 藥中間體、手性化合物的合成以及環境治理等方面具有廣泛的應用前景。
[0003] 微生物的腈水合酶作為生物催化劑來應用在有機合成工藝上擁有巨大的潛力，有 著化學方法無法替代的優越性，如：反應條件溫和、環境友好、成本低、具有區域和立體選擇 性，從而促進了腈水合酶在工業應用中的研制和開發。產腈水合酶微生物的分布是相當廣 泛的，如紅球菌、假單胞菌、諾卡氏菌、假諾卡氏菌、產堿桿菌、棒狀桿菌等，不同來源的腈水 合酶往往有著不同的特性。其中，一些產腈水合酶的微生物已用于丙烯酰胺、煙酰胺、2-氨 基-2,3-二甲基丁酰胺等的生產中。如專利號為US007405064B2的專利文獻公開了一種 睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D ;專利號為ZL88106735的專利文獻公開了一種玫瑰色紅球 菌J-I ;專利號為ZL86100062的專利文獻公開了一種紅球菌S-6、氧化節桿菌和黃色微桿 菌；專利號為ZL99106291. 4的專利文獻公開了一種嗜熱假諾卡氏菌JCM3095 ;專利號為 ZL03115536. 7的專利文獻公開了一種丙酸棒桿菌；專利號為ZL103834600的專利文獻公開 了一株惡臭假單胞菌，這些野生菌株都用于丙烯酰胺的生產中。
[0004] 丙烯酰胺作為一種重要的基礎化工原料，廣泛應用于造紙，裝璜以及石油開采等 方面。用生物法生產的丙烯酰胺年產量已經達到了 60萬噸以上。在我國，用腈水合酶合成 丙烯酰胺的生物技術雖然起步較晚，但發展很快，2012年統計數據顯示，我國生物法生產的 丙烯酰胺占整個丙烯酰胺產量的52%，且逐年增加。專利號為ZL01822031. 2的專利公開了 一系列微生物包括芽孢桿菌屬、微球菌屬、短桿菌屬、假單胞菌屬、假若卡氏菌屬及紅球菌 屬微生物在反應溫度為KTC條件下催化生產煙酰胺。煙酰胺屬于B族維生素，在體內以輔 酶I及輔酶II的形式參與機體代謝，被廣泛應用在醫藥，食品添加劑及飼料生產上。專利 號為ZL201210239547. 8的專利公開了一株野生菌株慶笙紅球菌CCTCC No :M2010050用于 催化水合制備2-氨基-2, 3-二甲基丁酰胺，其是咪唑啉酮類超高效除草劑的中間體。
[0005] 雖然利用野生菌株工業化生產酰胺類化合物的工藝已得到了廣泛的應用，但是， 上述工藝普遍存在野生菌株的腈水合酶的酶活穩定性差，對底物和產物的耐受性不高，以 及間歇化生產，產品質量不夠穩定等問題。此外，在野生菌株中除腈水合酶外，還存在酰胺 酶和腈水解酶，其可以造成副產物羧酸類化合物的積累，從而降低了酰胺類化合物的產率 和純度，同時也增加分離純化的難度和生產成本。隨著分子生物學的迅猛發展，利用基因重 組技術，構造具有腈水合酶活性的新型基因工程菌株并進行蛋白質工程改造，有望可以在 不同程度上解決實際生產問題，比如提高酶的表達水平、增強酶的熱穩定性以及對底物和 產物的耐受性、阻斷副反應的發生；另外，基因工程菌的適應性強、發酵周期短，有利于實現 大規模培養和工業化生產，也有助于與后續新工藝配合降低酶的生產和分離成本等。
【發明內容】
[0006] 本發明提供了一種具有R-異構體立體選擇性的、活力高、底物譜廣的腈水合酶。
[0007] 一種腈水合酶，由α亞基和β亞基組成，所述α亞基的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所不，β亞基的氣基酸序列如SEQ ID NO. 7所不。
[0008] 編碼所述腈水合酶的基因包含堿基序列如SEQ ID NO. 1所示的編碼α亞基的 基因和如SEQ ID NO. 2所示的編碼β亞基的基因。該堿基序列來源于博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM 12804)，由 1429 個堿基組成，自 5'端第 1 位到 762 位堿基 編碼腈水合酶α亞基；自5'端第773位到1429位堿基編碼腈水合酶β亞基，堿基序列如 SEQ ID NO. 3 所示。
[0009] 所述的腈水合酶的基因還包含編碼腈水合酶激活子的堿基序列。所述的腈水合酶 激活子的堿基序列如SEQ ID NO. 4所示，該激活子基因對于腈水合酶基因的高效表達至關 重要。
[0010] 為了提高表達活性，所述的腈水合酶基因 （SEQ ID NO. 3)經修飾后連接有激活子 基因 （SEQ ID NO. 4)，得到如SEQ ID NO. 5所示的堿基序列。
[0011] 本發明提供了一種腈水合酶激活子，氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
[0012] 本發明還提供了一種編碼所述腈水合酶的基因的表達盒、重組載體和轉化子。
[0013] 本發明所述的載體可以是 pET-30a(+)，pET-21a(+)，pET-22b(+)，pET-28a(+)， pETDuet-1，pACYQ)uet_l，pQ)FDuet_l和RSFDuet-1，但不僅限于所述的這些載體。較佳的 是將PCR擴增到的經修飾后的腈水合酶基因連接在表達載體pET-30a (+)上，形成重組表達 載體 pET_30a (+) -NHaseP。
[0014] 本發明所采用的宿主細胞為大腸桿菌，優選為E.coli BL21(DE3)菌株。將 上述重組表達載體pET-30a(+)-NHaseP轉化E. coli BL21 (DE3)感受態細胞，其中 含有pET-30a(+)-NHaseP重組質粒的菌株，即為基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/ pET-30a(+)-NHaseP。此菌株可在常規的IPTG誘導條件下高效表達腈水合酶蛋白。該基 因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET-30a(+)-NHaseP的液體培養基配方為：蛋白胨10g/L，酵 母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH為7. 0。培養工程菌的溫度為35?40 °C，轉速為180? 220rpm〇
[0015] 本發明又提供了一種所述的腈水合酶在催化腈化合物水合反應生成酰胺中的應 用。
[0016] 所述的腈化合物如式（I)或（II)所示：
[0017]
【權利要求】
1. 一種腈水合酶，由a亞基和e亞基組成，其特征在于，所述a亞基的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 6所示，0亞基的氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
2. -種腈水合酶激活子，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
3. 如權利要求1所述的腈水合酶在催化腈化合物水合反應生成酰胺中的應用。
4. 如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的腈化合物如式⑴或（II)所示：
式⑴中： X為OH，H，NH2或者烷基； R'為H或具有1-3個C原子的烷基； R為H或任選地H被NH2取代的具有1-12個C原子的烷基； 式（II)中： R"為單核或雙核的不飽和環，其具有6-12個C原子，且其任選地H被1個或2個Cl、 Br或F取代。
5. 如權利要求4所述的應用，其特征在于， 式⑴中： X為OH，H，順2或者具有1-3個C原子烷基； R'為H或具有1-3個C原子的烷基； R為H或任選地H被NH2取代的具有1-6個C原子的烷基； 式（II)中： R"為單核或雙核的不飽和環，其具有6-12個C原子，且其任選地H被1個或2個的 Cl、fo或F取代。
6. 如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的腈化合物為丙烯腈、3-氰基吡啶、 2-異丙基對氯苯乙腈和a -甲基苯乙腈中的一種。
7. 如權利要求6所述的應用，其特征在于，所述的腈化合物為2-異丙基對氯苯乙腈。
【文檔編號】C12N9/88GK104498466SQ201410758150
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月11日 優先權日:2014年12月11日
【發明者】楊立榮, 郭法謀, 王麗燕, 吳堅平, 徐剛 申請人:浙江大學