一種從釀酒酵母中提取純化sod的方法
【專利摘要】本發明涉及一種提取純化SOD的方法，尤其涉及一種從釀酒酵母中提取純化SOD的方法，其包括下述操作步驟：菌體收集，菌體勻漿，粗酶液制備，超濾以及層析。本發明可有效純化非修飾的SOD蛋白，保持SOD的原始活性。且純化出的高純度SOD用鄰苯三酚氧化法測得的比活高達15000U/g，整個過程收率較高；操作簡單、可實現工業化大生產。
【專利說明】一種從釀酒酵母中提取純化SOD的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種提取純化SOD的方法，尤其涉及一種從釀酒酵母中提取純化SOD的方法。
【背景技術】
[0002]O廠稱為超氧陰離子自由基，是生物體多種生理反應中自然生成的中間產物。超氧陰離子既是陰離子又是自由基，既是氧化劑，又是還原劑。現已證實，由氧自由基引發的疾病多達60多種。在體內，超氧陰離子主要通過超氧歧化酶清除。
[0003]超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, S0D)在生物界的分布極廣，幾乎從動物到植物，甚至從人到單細胞生物，都有它的存在。SOD是生物體內重要的抗氧化酶，具有特殊的生理活性，是生物體內清除超氧陰離子的首要酶。SOD催化如下的反應:
202>2H+— H 202+02
SOD通過上述反應可以把有害的超氧自由基轉化為過氧化氫。盡管過氧化氫仍是對機體有害的活性氧，但體內的過氧化氫酶和過氧化物酶會立即將其分解為完全無害的水。
[0004]超氧化物歧化酶根據其活性中心所含金屬輔基不同可分為三種，第一種是含銅(Cu)鋅(Zn)金屬輔基，稱(Cu-Zn型S0D)，這是最為常見的一種S0D，呈綠色或藍色，主要存在于細胞質中；第二種是是含錳(Mn)金屬輔基的稱(Mn型S0D)，存在于真核細胞的線粒體和一些原核細胞內；第三種是含鐵(Fe)金屬輔基的稱(Fe型S0D)，呈黃褐色，存在于原核細胞中。
[0005]目前，應用最廣泛的是Cu-Zn型SOD。SOD是生物體內氧自由基的天然清除劑，具有廣泛的醫用價值，可作為藥品、食品及日化產品的添加劑。例如SOD對一些由于年齡、疾病或傷害造成的組織硬化以及纖維化顯示出較強的再生修復能力。SOD也已被成功地應用于放療后的輔助治療、貝切特氏癥的治療、控制心臟病人的進展、嚴重的風濕性關節炎的治療等領域。
[0006]目前，國內外商品化的SOD主要從動物的血液(例如豬血或牛血)或者肝臟中提取得來，然而一些人畜共患病的原因使得許多國家禁止在食品、化妝品、醫療等領域使用動物來源的S0D。因此，從植物和微生物中提取SOD成為了人們的主要研宄方向。然而植物來源的SOD存在含量低、比活低、純化過程復雜等缺陷，而用微生物生產SOD除了不存在上述缺陷之外，還存在生長速率快的優勢，因此微生物逐漸成為SOD的主要的來源。例如，專利號為2011100503115報道了一種用釀酒酵母生產重組人源SOD的方法，但是這個專利集中在重組釀酒酵母的構建，并未公開SOD純化方法，而從細胞內獲取SOD時更是采用超聲法，不適合大規模工業化生產；專利號為201310103919.9報道了一種釀酒酵母菌株及其在制備耐熱超氧化物歧化酶中的應用，這項專利主要集中在釀酒酵母菌種的篩選以及發酵上，對于SOD的純化并未深入研宄；專利號為2011103369936的專利中，公布了一種從釀酒酵母中同時提取S-腺苷-L-甲硫氨酸和SOD的方法，然而這種方法純化的SOD純度較低，而且在破壁時采用有機溶劑法，純化時也采用丙酮沉淀法，這對于環境有一定的污染，也使得SOD酶活有一定得損失；專利號為200810061168.8的專利中，報道了從重組釀酒酵母中提取耐高溫超氧化物歧化酶的方法，然而這種方法需要用80°C水浴，這會使得釀酒酵母中SOD失活，此外該專利需要用有機溶劑一一乙醇沉淀，這對釀酒酵母SOD的酶活也有損害，最后透析也會影響工藝工業化時的放大。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于提供一種操作簡單、可實現工業化大生產的從釀酒酵母中提取純化SOD的方法，并且所提取純化的SOD具有較高活性。
[0008]為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是:
本發明從釀酒酵母中提取純化SOD的方法包括下述操作步驟:
O菌體收集:用板框過濾器收集濕釀酒酵母細胞；
2)菌體勻漿:將上述釀酒酵母細胞中加入2~30倍體積的水，攪拌使釀酒酵母均勻分散為懸浮液，用高壓均質機在300~1500bar勻漿2~8次；
3)粗酶液制備:向勻漿后產物加入pH7~9的聚醚酰亞胺溶液，使聚醚酰亞胺的終濃度為l~25g/L ;攪拌均勻后加入硅藻土，硅藻土的加入量為每升100~300克；混合均勻后用板框過濾器過濾收集濾液，即為SOD粗酶液；
或將勻漿后產物以10000~16000rpm離心，上清液用陶瓷膜微濾系統過濾得到SOD粗酶液；
4)超濾:將上述SOD粗酶液用1000~40000Da超濾膜處理，超濾膜兩側壓力不大于0.4MPa ；
5)層析:將上述超濾后所得濾液通過陽離子層析柱層析，用去離子水沖洗后用5~100mM的pH4.0-7.0乙酸緩沖液進行洗脫，收集富含SOD的洗脫液；所述陽離子層析柱選自 Q-sepharose 或 DEAE-sepharose 層析柱。
[0009]進一步的，本發明向步驟5)中的超濾后所得濾液中加入pH 5.0-7.0的乙酸緩沖液，使乙酸的終濃度為5~30mM的后進行層析。
[0010]進一步的，本發明所述乙酸緩沖液為乙酸-乙酸鈉緩沖液。
[0011]進一步的，本發明層析后將所得富含SOD的洗脫液通過超濾或凝膠排阻層析脫土卜
ΠΤΤ.0
[0012]進一步的，本發明重復步驟4)和5) 2~5次獲得高純度的富含SOD的洗脫液。
[0013]進一步的，本發明步驟2)中所述水的溫度為4~15°C。
[0014]采用上述技術方案所產生的有益效果在于:
本發明提供了一種從釀酒酵母細胞中提取Cu-Zn型SOD的方法。無論從微生物中，還是從植物細胞中提取高純度的S0D，都具有一定得困難。因為細胞內含有數千種蛋白且酶蛋白較容易失去生物學活力。如今，人們可以通過分子生物學手段在酶基因上連接上一段標簽，而后用特殊的層析柱純化S0D，然而這種方法的純化成本極高，而且信號肽可能會影響酶活力。本發明公開的方法有效地解決了上述的問題，可有效純化非修飾的SOD蛋白，保持SOD的原始活性；且純化出的高純度SOD用鄰苯三酚氧化法測得的比活高達15000U/g，整個過程收率較高；操作簡單、可實現工業化大生產。
[0015]本發明的工藝流程用高壓均質機對釀酒酵母進行破碎。相對有機溶劑法破壞細胞壁以及細胞膜，具有環保以及酶活損失小等優點；相對超聲破碎法，具有破壁率高、處理量大、易于工業化的優點。
[0016]本發明通過合適的層析法以及合理的層析工藝純化SOD，相較于用高溫、有機溶劑、鹽析和透析等方法純化SOD，具有酶活損失小以及SOD產品純度高的優勢。
[0017]本發明中的層析方法可以重復數次，逐步提高SOD產品的純度，也可根據要求生產不同純度的SOD凍干粉及溶液。
【具體實施方式】
[0018]下面結合【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的說明。
[0019]為使本發明的上述目的，特征和優點能夠更加明顯易懂，下面將結合本發明的實施例對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0020]本發明所選用的釀酒酵母為商業化銷售的野生酵母菌，例如安琪干酵母。本發明的方法對所選用的釀酒酵母沒有具體的限制，原則上只要表達SOD的菌株均可以使用本發明的方法進行SOD的提取和純化。
[0021]本發明適用于離子型的SOD的提取，尤其適用于陽離子型的SODjn Cu-Zn型的rhSOD的提取，對于不同離子型的S0D，可以通過變換層析柱、洗脫液、洗脫順序等實施，原則上屬于與本發明方法相同或相近的方法，亦屬于本發明保護的范圍。
[0022]下述實施例中所使用的板框過濾器的廠家為大張過濾有限公司，型號為BMY4/450-30U ;醋酸纖維素超濾膜的廠家為賽多利斯(Sartorius )公司，型號為SartoconHydrosart，截留分子量為 1KDa ；Q-sepharose 層析柱的廠家為 GE HealthcareLife Sciences，型號為 Q Sepharose Fast Flow ;DEAE_sepharose 層析柱的廠家為 GEHealthcare Life Sciences，型號為 DEAE-sepharose Fast Flow ;陶瓷膜的廠家為南京艾宇琦膜科技有限公司，型號為AYQ-3019-1040。
[0023]實施例1
將200L發酵罐中發酵得到的釀酒酵母發酵液用板框過濾器過濾后，將得到約24kg菌泥加入到攪拌罐中，向其中加入60升4~15°C去離子水并攪拌使得酵母細胞均勻分散，加入去離子水至終體積為90L。將上述釀酒酵母懸濁液用100bar壓力進行勻漿，勻漿產物用100bar再次勻漿，反復3次后，酵母細胞破碎率大于95%。
[0024]在勻漿產物中加入10升250g/L的pH7.9的聚醚酰亞胺(PEI)溶液，使PEI在勻楽產物中的終濃度為25g/L，用約50rpm的速度攪拌lOmin，在其中加入30kg娃藻土混合均勻，而后用板框過濾器再次過濾收集濾液。為了提高SOD收率，濾餅可以用100升去離子水洗滌。
[0025]將濾液用分離效率為10000 Da醋酸纖維素超濾膜系統將上述粗酶液濃縮到5L后，向其中加入20L去離子水繼續濃縮，反復加水3次后，濃縮到5L。將粗酶液通過裝有GEhealth care的Q-sepharose Fast Flow (Q_瓊脂糖凝膠)層析柱，先后用10倍柱床體積的pH 6.0濃度為20 mM乙酸-乙酸鈉緩沖溶液沖洗，而后用25mM的pH 5.4乙酸-乙酸鈉緩沖溶液進行洗脫，收集SOD活力組分。
[0026]將收集的SOD可以用分離效率為10000 Da的醋酸纖維素系統濃縮以后，加入10倍體積的水繼續濃縮，反復5次。隨后，將SOD溶液再次通過裝有GE health care的Q-sepharose Fast Flow (Q_瓊脂糖凝膠)層析柱，先后用10倍柱床體積的pH 6.0濃度為20 mM乙酸-乙酸鈉緩沖溶液沖洗，而后用25mM的pH 5.4乙酸-乙酸鈉緩沖溶液進行洗脫，收集SOD活力組分。
[0027]上述高純度SOD溶液用超濾膜系統處理；將得到的SOD溶液冷凍干燥可以得到顏色為淺藍綠色的凍干粉。用GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性測定第一法(鄰苯三酚法)測定，SOD的純度約13840 U/mgo經一次層析處理得到的SOD產品純度為4320 U/mgo
[0028]實施例2
將200L發酵罐中發酵得到的釀酒酵母發酵液用板框過濾器過濾后，將得到約24kg菌泥加入到攪拌罐中，向其中加入48升4~15°C去離子水并攪拌使得酵母細胞均勻分散。將上述釀酒酵母懸池液用500bar壓力進行勾楽，勾楽產物用500bar再次勾楽，反復8次后，酵母細胞破碎率大于95%。勻漿壓力低時，勻漿速率較快，通量大，且勻漿產物溫度較低，當不具備冷卻設備時，可以采用低壓力多次勻漿法。
[0029]將勻漿產物用管式離心機在HOOOrpm離心，出料口速率約30L/h條件下離心。離心后的液體用南京艾宇琦膜科技有限公司的陶瓷膜進行過濾。將濾液用分離效率為40000Da的醋酸纖維素超濾膜將上述粗酶液濃縮到5L后，向其中加入20L去離子水繼續濃縮，反復加水3次后，濃縮到5L。將粗酶液通過裝有GE health care的DEAE-sepharose層析柱，先后用10倍柱床體積的pH 6.0濃度為20 mM乙酸-乙酸鈉緩沖溶液沖洗，而后用25mM的pH 5.4乙酸-乙酸鈉緩沖溶液進行洗脫，收集SOD活力組分。
[0030]將收集的SOD可以用分離效率為10000 Da的醋酸纖維素超濾膜系統濃縮以后，加入10倍體積的水繼續濃縮，反復5次，以脫掉SOD溶液中的鹽離子。隨后，將SOD溶液再次通過裝有GE health care的Q-sepharose Fast Flow (Q_瓊脂糖凝膠)層析柱，先后用10倍柱床體積的pH 6.0濃度為20 mM乙酸-乙酸鈉緩沖溶液沖洗，而后用25mM的pH 5.4乙酸-乙酸鈉緩沖溶液進行洗脫，收集SOD活力組分。收集的SOD組分繼續超濾系統濃縮以后，加入10倍體積的水繼續濃縮，反復5次。隨后，將SOD溶液再次通過裝有GE healthcare的Q-sepharose Fast Flow (Q_瓊脂糖凝膠)層析柱，先用10倍柱床體積的pH 6.0濃度為20 mM乙酸-乙酸鈉緩沖溶液沖洗，而后用25mM的pH 5.4乙酸-乙酸鈉緩沖溶液進行洗脫，收集SOD活力組分。
[0031]上述高純度SOD溶液用超濾膜系統處理；將得到的SOD溶液冷凍干燥可以得到淺藍色的凍干粉。用GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性測定第一法(鄰苯三酚法)測定，SOD純度約15270U/mg。
[0032]實施例3
將100L發酵罐中發酵得到的釀酒酵母發酵液用板框過濾器過濾后，將得到約1kg菌泥加入到攪拌罐中，向其中加入80升4~15°C去離子水并攪拌使得酵母細胞均勻分散，加入去離子水至終體積為99L。將上述釀酒酵母懸濁液用100bar壓力進行勻漿，勻漿產物用100bar再次勻漿，反復3次后，酵母細胞破碎率大于95%。
[0033]在勻漿產物中加入I升200g/L的pH7.9的聚醚酰亞胺(PEI)溶液，使PEI在勻漿產物中的終濃度為2g/L，用約50rpm的速度攪拌lOmin，在其中加入1kg娃藻土混合均勾，而后用板框過濾器再次過濾收集濾液。為了提高SOD收率，濾餅可以用50升去離子水洗滌。
[0034]將濾液用分離效率為20000 Da的醋酸纖維素超濾膜系統將上述粗酶液濃縮到5L后，向其中加入20L去離子水繼續濃縮，反復加水3次后，濃縮到5L。將粗酶液通過裝有GEhealth care的Q-sepharose Fast Flow (Q_瓊脂糖凝膠)層析柱，先后用5倍柱床體積的PH5.0濃度為1mM乙酸-乙酸鈉緩沖溶液沖洗，而后用15mM的pH 4.5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液進行洗脫，收集SOD活力組分。
[0035]將收集的SOD可以用分離效率為20000 Da的醋酸纖維素超濾膜系統濃縮以后，加入10倍體積的水繼續濃縮，反復5次。隨后，將SOD溶液再次通過裝有GE health care的Q-sepharose Fast Flow (Q_瓊脂糖凝膠)層析柱，先后用5倍柱床體積的pH 5.0濃度為5mM乙酸-乙酸鈉緩沖溶液沖洗，而后用15mM的pH4.5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液進行洗脫，收集SOD活力組分。
[0036]上述高純度SOD溶液用超濾膜系統處理；將得到的SOD溶液冷凍干燥可以得到顏色為淺藍綠色的凍干粉。用GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性測定第一法(鄰苯三酚法)測定，SOD的純度約11830 U/mgo
[0037]實施例4
將200L發酵罐中發酵得到的釀酒酵母發酵液用板框過濾器過濾后，將得到約24kg菌泥加入到攪拌罐中，向其中加入48升4~15°C去離子水并攪拌使得酵母細胞均勻分散，加水定容到77.5L。將上述釀酒酵母懸濁液用100bar壓力進行勻漿，勻漿產物用100bar再次勻漿，反復3次后，酵母細胞破碎率大于95%。
[0038]在勻漿產物中加入2.5升200g/L的pH7.0的聚醚酰亞胺(PEI)溶液，使PEI在勻楽產物中的終濃度為6.25g/L，用約50rpm的速度攪拌lOmin，在其中加入16kg娃藻土混合均勻，而后用板框過濾器再次過濾收集濾液。為了提高SOD收率，濾餅可以用100升去離子水洗滌。
[0039]將濾液用分離效率為40000 Da的醋酸纖維素超濾膜系統將上述粗酶液濃縮到5L后，向其中加入20L去離子水繼續濃縮，反復加水3次后，濃縮到5L。將粗酶液加入pH 6.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，是乙酸的終濃度為30mM后，將粗酶液通過裝有GE health care的Q-sepharose Fast Flow (Q_瓊脂糖凝膠)層析柱，先后用10倍柱床體積的pH7.0濃度為20mM乙酸-乙酸鈉緩沖溶液沖洗，而后用50mM的pH 6.0乙酸-乙酸鈉緩沖溶液進行洗脫，收集SOD活力組分。
[0040]將收集的SOD可以用分離效率為40000 Da的醋酸纖維素超濾膜系統濃縮以后，加入10倍體積的水繼續濃縮，反復5次。隨后，將SOD溶液再次通過裝有GE health care的Q-sepharose Fast Flow (Q_瓊脂糖凝膠)層析柱，先后用10倍柱床體積的pH 7.0濃度為30mM乙酸-乙酸鈉緩沖溶液沖洗，而后用50mM的pH6.0乙酸-乙酸鈉緩沖溶液進行洗脫，收集SOD活力組分。
[0041]上述高純度SOD溶液用超濾膜系統處理；將得到的SOD溶液冷凍干燥可以得到顏色為淺藍綠色的凍干粉。用GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性測定第一法(鄰苯三酚法)測定，SOD的純度約9710U/mg。
[0042]實施例5 將200L發酵罐中發酵得到的釀酒酵母發酵液用板框過濾器過濾后，將得到約14kg菌泥加入到攪拌罐中，向其中加入100升4~15°C去離子水并攪拌使得酵母細胞均勻分散，加入水至終體積140L。將上述釀酒酵母懸濁液用1500bar壓力進行勻漿，勻漿產物用1500bar再次勻漿。
[0043]在勻漿產物中加入10升75g/L的pH9.0的聚醚酰亞胺(PEI)溶液，使PEI在勻漿產物中的終濃度為5g/L，用約50rpm的速度攪拌lOmin，在其中加入40kg娃藻土混合均勾，而后用板框過濾器再次過濾收集濾液。為了提高SOD收率，濾餅可以用150升去離子水洗滌。
[0044]將濾液用分離效率為40000Da的醋酸纖維素超濾膜系統將上述粗酶液濃縮到5L后，向其中加入20L去離子水繼續濃縮，反復加水3次后，濃縮到5L。將粗酶液加入pH5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，是乙酸的終濃度為25mM后，通過裝有GE health care的Q-sepharose Fast Flow (Q_瓊脂糖凝膠)層析柱，先后用10倍柱床體積的pH6.3濃度為20mM乙酸-乙酸鈉緩沖溶液沖洗，而后用20mM的pH 5.5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液進行洗脫，收集SOD活力組分。
[0045]將收集的SOD可以用分離效率為40000Da的醋酸纖維素超濾膜系統濃縮以后，加入10倍體積的水繼續濃縮，反復5次。隨后，將SOD溶液再次通過裝有GE health care的Q-sepharose Fast Flow (Q_瓊脂糖凝膠)層析柱，先后用10倍柱床體積的pH 6.3濃度為25mM乙酸-乙酸鈉緩沖溶液沖洗，而后用20mM的pH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液進行洗脫，收集SOD活力組分。
[0046]上述高純度SOD溶液用超濾膜系統處理；將得到的SOD溶液冷凍干燥可以得到顏色為淺藍綠色的凍干粉。用GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性測定第一法(鄰苯三酚法)測定，SOD的純度約12750U/mg。
[0047]實施例6
將200L發酵罐中發酵得到的釀酒酵母發酵液用板框過濾器過濾后，將得到約24kg菌泥加入到攪拌罐中，向其中加入750升4~15°C去離子水并攪拌使得酵母細胞均勻分散。將上述釀酒酵母懸池液用500bar壓力進行勾楽，勾楽產物用800bar再次勾楽，反復5次后，酵母細胞破碎率大于95%。勻漿壓力低時，勻漿速率較快，通量大，且勻漿產物溫度較低，當不具備冷卻設備時，可以采用低壓力多次勻漿法。
[0048]將勻漿產物用管式離心機在HOOOrpm離心，出料口速率約30L/h條件下離心。離心后的液體用南京艾宇琦膜科技有限公司的陶瓷膜進行過濾。將濾液用分離效率為10000Da的醋酸纖維素超濾膜系統將上述粗酶液濃縮到5L后，向其中加入20L去離子水繼續濃縮，反復加水3次后，濃縮到5L。將粗酶液通過裝有GE health care的Q-sepharose FastFlow (Q-瓊脂糖凝膠)層析柱，先后用10倍柱床體積的pH 7.0濃度為30 mM乙酸-乙酸鈉緩沖溶液沖洗，而后用10mM的pH 7.0乙酸-乙酸鈉緩沖溶液進行洗脫，收集SOD活力組分。
[0049]將收集的SOD可以用分離效率為10000 Da的醋酸纖維素超濾膜系統濃縮以后，加入10倍體積的水繼續濃縮，反復5次，以脫掉SOD溶液中的鹽離子。將粗酶液加入pH 7.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，是乙酸的終濃度為5mM后，將SOD溶液再次通過裝有GE healthcare的Q-sepharose Fast Flow (Q-瓊脂糖凝膠)層析柱，先后用10倍柱床體積的pH 7.0濃度為30mM乙酸-乙酸鈉緩沖溶液沖洗，而后用10mM的pH 7.0乙酸-乙酸鈉緩沖溶液進行洗脫，收集SOD活力組分。收集的SOD組分繼續超濾系統濃縮以后，加入10倍體積的水繼續濃縮，反復5次。隨后，將SOD溶液再次通過裝有GE health care的Q-sepharose FastFlow (Q-瓊脂糖凝膠)層析柱，先后用10倍柱床體積的pH 7.0濃度為30 mM乙酸-乙酸鈉緩沖溶液沖洗，而后用10mM的pH7.0乙酸-乙酸鈉緩沖溶液進行洗脫，收集SOD活力組分。
[0050]上述高純度SOD溶液用超濾膜系統處理；將得到的SOD溶液冷凍干燥可以得到淺藍色的凍干粉。用GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性測定第一法(鄰苯三酚法)測定，SOD純度約7280U/mg。
【權利要求】
1.一種從釀酒酵母中提取純化300的方法，其特征在于其包括下述操作步驟: 1?菌體收集:用板框過濾器收集濕釀酒酵母細胞； 2)菌體勻漿:將上述釀酒酵母細胞中加入2~30倍體積的水，攪拌使釀酒酵母均勻分散為懸浮液，用高壓均質機在300~15001^1~勻漿2~8次； 3)粗酶液制備:向勻漿后產物加入邱7~9的聚醚酰亞胺溶液，使聚醚酰亞胺的終濃度為1~258凡；攪拌均勻后加入硅藻土，硅藻土的加入量為每升100~300克；混合均勻后用板框過濾器過濾收集濾液，即為300粗酶液； 或將勻漿后產物以100004600011)111離心，上清液用陶瓷膜微濾系統過濾得到300粗酶液； 4)超濾:將上述300粗酶液用1000~40000超濾膜處理，超濾膜兩側壓力不大于0.41？3 ； 5)層析:將上述超濾后所得濾液通過陽離子層析柱層析，用去離子水沖洗后用5-1001111的邱4.0-7.0乙酸緩沖液進行洗脫，收集富含300的洗脫液；所述陽離子層析柱選白 0-861)1181-086 02八2—86^)1181086 胃豐斤豐主。
2.根據權利要求1所述的一種從釀酒酵母中提取純化300的方法，其特征在于 向步驟5)中的超濾后所得濾液中加入邱5.0-7.0的乙酸緩沖液，使乙酸的終濃度為5-301111的后進行層析。
3.根據權利要求2所述的一種從釀酒酵母中提取純化300的方法，其特征在于所述乙酸緩沖液為乙酸-乙酸鈉緩沖液。
4.根據權利要求1或2所述的一種從釀酒酵母中提取純化300的方法，其特征在于層析后將所得富含300的洗脫液通過超濾或凝膠排阻層析脫鹽。
5.根據權利要求1或2所述的一種從釀酒酵母中提取純化300的方法，其特征在于重復步驟4)^5)2-5次獲得高純度的富含300的洗脫液。
6.根據權利要求5所述的一種從釀酒酵母中提取純化300的方法，其特征在于步驟2)中所述水的溫度為4~15。〇。
【文檔編號】C12R1/865GK104450635SQ201410757440
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月12日 優先權日:2014年12月12日
【發明者】馬功臣 申請人:邢臺怡通生物科技有限公司