一組微孢子蟲分子通用檢測引物及其試劑盒的制作方法

一組微孢子蟲分子通用檢測引物及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一組微孢子蟲通用檢測引物及其試劑盒。所述通用檢測引物包括上游引物HMG1F和下游引物HMG1R，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。該檢測引物以基因 HMG1 為靶基因，能夠同時應用于多種微孢子蟲的檢測，檢測結果可靠、易于操作、靈敏度高，尤其是對于實際檢疫工作中，對于樣品的各種微孢子蟲的早期檢測，具有非常重要的實際應用意義。
【專利說明】一組微孢子蟲分子通用檢測弓I物及其試劑盒

【技術領域】
[0001]本發明屬于昆蟲病原微生物分子檢測【技術領域】。更具體地，涉及一組微孢子蟲分子通用檢測引物及其試劑盒。

【背景技術】
[0002]蠶微粒子病的研宄始于1845年發生在法國的全國流行微粒子病，巴斯德確定他觀察到的“微粒”是微粒子病的成因因素，其病原包括家蠶微孢子蟲和柞蠶微孢子蟲等微孢子蟲病原物。尤其是家蠶微孢子蟲有水平傳播和垂直傳播兩種傳染途徑，其中垂直傳播對蠶業生產中的蠶種生產造成巨大的危害，同時對絲繭育蠶繭產量和品質帶來很大的負面影響，嚴重影響蠶絲產業鏈下游經濟的發展(蔡順風等，2011)。自法國全國微粒子病爆發以來，家蠶微孢子蟲始終是各國蠶種生產和進出口貿易的重要檢測對象。19世紀末，在日本養蠶業最發達的時期，《母蛾鏡檢法》、《蠶病預防法》曾被寫入憲法(Takeshi Kawarabata,2003)，我國也將其列為進出口動物檢疫二類疫病[《中華人民共和國進境動物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》，(1992)農(檢疫)字第12號]。
[0003]最初人們判別微孢子蟲主要根據微粒子病的發病特點進行肉眼觀察。顯微鏡發明以后，人們根據微孢子蟲的形態和大小進行顯微鏡鏡檢，一定程度上提高了檢測的靈敏度和效率，并因此遏制了法國全國流行的微粒子病。但是顯微鏡鏡檢有明顯的缺點，如對操作人員的技術及經驗要求較高，而且微孢子蟲個體及其微小，常用的顯微鏡鏡檢檢測方法特異性和靈敏度較低，難以區分微孢子蟲類似物。
[0004]隨著PCR技術的普及，人們開始使用PCR方法來檢測微孢子蟲并且達到了較高的靈敏度。“分子鐘”是分子水平分析生物系統進化中的有效手段，SSU rRNA (16S rDNA)是微生物進化研宄中常用的“分子鐘”(Pei A Y, et al.，2010)。家蠶微粒子病PCR檢測技術研宄中所設計的引物針對的靶基因多數也是SSU rRNA，針對其他微孢子蟲基因設計的引物較少或靈敏度較差，因而很少被報道。Baker et al (1995)和Terry et al (1999)根據相近種屬微孢子蟲SSU rRNA高度保守區設計的PCR引物Vlf/530r，可鑒別多種種屬的微孢子蟲的DNA模板擴增約450bp的特異目的條帶，但是靈敏性卻差強人意，而且本發明人研宄發現，使用該引物檢測蠶卵微孢子蟲時，檢測的靈敏度極低，暗示蠶卵抽提物中可能存在某種抑制因素干擾了對家蠶微孢子蟲(N.b) DNA的PCR擴增。
[0005]而在實際工作中，尤其是檢疫工作，對于樣品的各種微孢子蟲病原的檢測是很重要的，且不能出現漏檢的情況，因此尋求一種既能夠通用的檢測多種微孢子蟲，又具有很好的檢測靈敏性，且以蠶卵DNA為模板時也具有很好的靈敏性的引物組，在微孢子蟲的實際檢測應用中具有廣泛的應用價值和意義。


【發明內容】

[0006]本發明要解決的技術問題是克服現有微孢子蟲通用檢測技術的不足，以家蠶微孢子蟲基因為靶基因設計檢測引物，提供一種結果可靠、易于操作(簡單快速)、靈敏度高的通用檢測多種微孢子蟲的方法。
[0007]本發明的目的是提供一種微孢子蟲分子通用檢測引物。
[0008]本發明另一目的是提供所述微孢子蟲分子通用檢測引物在制備微孢子蟲通用檢測試劑盒方面的應用。
[0009]本發明的再一目的是提供一種微孢子蟲通用檢測試劑盒。
[0010]本發明上述目的通過以下技術方案實現:
一組微孢子蟲通用檢測引物，所述通用檢測引物包括上游引物HMGlF和下游引物HMG1R，上游引物HMGlF的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，下游引物HMGlR的核苷酸序列如 SEQ ID N0.4 所示。
[0011]本發明在獲得了家蠶微孢子蟲邏基因的基礎上(邏基因DNA全長核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其cDNA全長核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示)，以邏基因為靶基因，設計了上述引物，該引物既能夠通用的檢測多種微孢子蟲，又具有很好的檢測靈敏性，在微孢子蟲的實際檢測應用中具有廣泛的應用價值和意義。所述引物尤其適用于同時檢測家蠶微孢子蟲、柞蠶微孢子蟲和玉米螟微孢子蟲。
[0012]本發明還提供了所述微孢子蟲通用檢測引物在制備微孢子蟲通用檢測試劑盒方面的應用。提供了一種微孢子蟲通用檢測試劑盒，包括上游引物HMGlF和下游引物HMG1R，上游引物HMGlF的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，下游引物HMGlR的核苷酸序列如SEQID N0.4 所示。
[0013]優選地，所述試劑盒的使用方法如下:
以樣品DNA或cDNA為模板，利用引物HMGlF和HMGlR進行PCR反應，反應結束后凝膠電泳檢測擴增產物，根據擴增DNA片段的大小判定結果；所述判定結果的標準為:瓊脂糖凝膠上出現特異性地561bp的DNA片段產物，即該樣品感染了家蠶微孢子蟲。
[0014]優選地，所述PCR反應的反應體系為:
2 X反應緩沖液1yL
10 μ M 上游引物 HMGlF0.5 μ L
10 μ M 下游引物 HMGlR0.5 μ L
模板DNAI μ L
ddH20補至 20 μ L ;
其中，2Χ反應緩沖液的組分為Taq DNA聚合酶，160 mM Tris-HCl, 40 mM(NH4)2SO4, 3.0mM MgCl2,400 μ M dNTP。
[0015]優選地，所述PCR 反應的反應程序為:94°C 5 min ；94°C 30 s，58.5°C 45 s，72°C45 8，32個循環；72°〇 10 min。
[0016]本發明具有以下有益效果:
本發明公開了一組微孢子蟲通用檢測引物，是根據家蠶微孢子蟲(廣東株基因序列設計的引物，該引物可用于微孢子蟲病的PCR檢測，具有很好的通用性和靈敏性，既能夠通用的檢測多種微孢子蟲，又具有很好的檢測靈敏性，在微孢子蟲的實際檢測應用中具有廣泛的應用價值和意義。
[0017]另外，本發明引物及相關試劑可組裝成試劑盒，使用方便，而且PCR擴增的模板不受限制，適用范圍廣，可以是樣品的DNA或cDNA，可以直接以蠶卵DNA為模板，大大增加了檢測對象的范圍。
[0018]重要的是，本發明的檢測引物和試劑盒能夠在微孢子蟲侵染的早期就能夠檢測出來，為微孢子蟲病的早期檢測提供了一種簡單快速的方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為HMGIF/ HMGlR引物的檢測結果；泳道:M:DL1000 ;1:有毒蠶卵DNA，2:純化的家蠶微孢子蟲(N.b) DNA, 3:(正常)無毒蠶卵DNA，4:ddH20。
[0020]圖2為HMGl-sF/ HMGl-sR引物的檢測結果；泳道:M:DL1000 ；1:有毒蠶卵DNA, 2:純化的家蠶微孢子蟲(N.b) DNA, 3:(正常)無毒蠶卵DNA，4:ddH20。
[0021]圖3為HMGl-xF/ HMGl-xR引物的檢測結果；泳道:M:DL1000 ；1:有毒蠶卵DNA, 2:純化的家蠶微孢子蟲(N.b) DNA, 3:(正常)無毒蠶卵DNA，4:ddH20。
[0022]圖4為HMGIF/ HMGlR引物的特異性檢測結果；泳道:M:DL1000 ；1:N.b (家蠶微孢子蟲)DNA ；2:N.a (柞蠶微孢子蟲)DNA ；3:N.f (玉米螟微孢子蟲)DNA ；4:水對照。
[0023]圖5為HMGl-sF/ HMGl-sR引物的特異性檢測結果；泳道:M:DL1000 ；1:N.b (家蠶微孢子蟲)DNA ；2:N.a (柞蠶微孢子蟲)DNA ；3:N.f (玉米螟微孢子蟲)DNA ；4:水對照。
[0024]圖6為HMGl-xF/ HMG1-xR引物的特異性檢測結果；泳道:M:DL1000 ；1:N.b (家蠶微孢子蟲)DNA ；2:N.a (柞蠶微孢子蟲)DNA ；3:N.f (玉米螟微孢子蟲)DNA ；4:水對照。
[0025]圖7為HMGIF/ HMGlR引物的靈敏性檢測結果；泳道:M:DL1000 ； 1-7分別為5.0XlO0、5.0X1'5.0X10_2、5.0X10_3、5.0X10_4、5.0X10_5、5.0X10_6 ng/μ L 的 N.bDNA，8為水對照。
[0026]圖8為HMGl-sF/ HMGl-sR引物的靈敏性檢測結果；泳道:M:DL1000 ；1~7分別為5.0XlO0、5.0X1'5.0X10_2、5.0X10_3、5.0X10_4、5.0X10_5、5.0X10_6 ng/μ L 的 N.bDNA，8為水對照。
[0027]圖9為HMGl-xF/ HMG1-xR引物的靈敏性檢測結果；泳道:M:DL1000 ；1~7分別為5.0XlO0、5.0X1'5.0X10_2、5.0X10_3、5.0X10_4、5.0X10_5、5.0X10_6 ng/μ L 的 N.bDNA，8為水對照。
[0028]圖10為HMGIF/ HMGlR引物對N.b感染四齡蠶不同時間cDNA模板的PCR結果；泳道:M 為 DL1000 ；1:6h ；2:12h ；3:18h ；4:24h ；5:36h ；6:48h ；7:60h ；8:72h ；9:84h ；10:96h ；11:108h ；12:純化的 N.b cDNA ；13:正常家蠶中腸 cDNA ； 14:ddH20。
[0029]圖11為HMGIF/ HMGlR引物對N.b感染蠶卵(浸酸前)不同時間cDNA模板的PCR結果；泳道:M 為 DL1000 ；1:2h ；2:8h ；3:10h ；4:12h ；5:17h ；6:純化的 N.b 孢子的 cDNA ；7:正常家蠶蠶卵cDNA ；8:ddH2Oo
[0030]圖12為HMGIF/ HMGlR引物對N.b感染蠶卵(不浸酸)不同時間cDNA模板的PCR結果；泳道:M 為 DL1000 ；1:24h ；2:48h ；3:72h ；4:96h ；5:120h ；6:144h ；7:168h ；8:192h ；
9:216h ；10:240h ；11:純化的 N.b 的 cDNA ；12:正常家蠶蠶卵 cDNA ；13:ddH20。
[0031]圖13為HMGIF/ HMGlR引物對N.b感染蠶卵(浸酸)不同時間cDNA模板的PCR結果；泳道:M 為 DL1000 ；1:24h ；2:48h ；3:72h ；4:96h ；5:120h ；6:144h ；7:168h ；8:192h ；9:216h ；10:240h ；11:純化的 N.b 的 cDNA ；12:正常家蠶蠶卵 cDNA ；13:ddH20。

【具體實施方式】
[0032]以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本【技術領域】常規試劑、方法和設備。
[0033]除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
[0034]實施例1家蠶微孢子蟲HMG 7基因
1、根據分子生物學的基因克隆技術中基因同源克隆的方法，克隆獲得了家蠶微孢子蟲HMG 2基因的cDNA和DNA全長序列。
[0035]2、cDNA全長的獲得，具體方法如下:
(I)運用Primer premier 5.0軟件，結合綜合分析，設計了引物引物HMGIF/ HMG1R，序列分別如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
[0036]上游引物HMGlF (SEQ ID N0.3):
5’ ATGACTGCTCAAAAAGACGATAC 3’
下游引物 HMGlR (SEQ ID N0.4):
5’ TTATTCATCACTATCTCCTACTTCT 3’。
[0037](2)以純化的家蠶微孢子蟲(N.b)孢子DNA為模板，以引物HMGIF/ HMGlR進行PCR擴增。
[0038](3)PCR產物經過純化，連接到pMD19T中，并轉化到E.coli DH- 5α中培養。
[0039](4)提取重組質粒，并測序，獲得邏基因的cDNA全長，如SEQ ID N0.2所示。
[0040]3、DNA全長的獲得
利用基因組高通量測序的方法，并經過大量的基因預測對比分析，最后經PCR測序驗證，獲得了家蠶微孢子蟲HMG 2基因的DNA全長序列，如SEQ ID N0.1所示。
[0041]4、根據測序結果的多次確認，得出家蠶微孢子蟲M 2基因的DNA全長序列，如SEQ ID N0.1所示，其cDNA全長核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0042]實施例2檢測引物設計及PCR擴增方法的建立
1、引物設計
在獲得家蠶微孢子蟲/3私7基因的基礎上，應用Primer premier 5.0軟件設計，設計了多對引物，通過大量的抗藥性、特異性和靈敏性檢測，最終選取了 3對引物有代表性的引物組，各組引物序列如下:
(I)第一對:
上游引物 HMGlF (SEQ ID N0.3):
5’ ATGACTGCTCAAAAAGACGATAC 3’
下游引物 HMGlR (SEQ ID N0.4):
5’ TTATTCATCACTATCTCCTACTTCT 3’。
[0043](2)第二對:
上游引物 HMGl-sF (SEQ ID N0.5):
TTCCGAAATAATCTTCTTTTAATTG
下游引物 HMGl-sR (SEQ ID N0.6):
TTGTGCACCGAATCGTAAATAG (3)第三對:
上游引物 HMGl-xF (SEQ ID N0.7):
TCCCTAGGAACTTTTAAAGAGAAG
下游引物 HMGl-xR (SEQ ID N0.8):
TCCTTTTATTCATCACTATCTCCT
2、PCR擴增方法的建立
(I)以家香或家香香卵的總DNA的提取為例，說明樣品的DNA提取:
(方法只做參考，不具任何限定意義，通過本領域任何方法提取樣品DNA均可)
采用QIAGEN公司生產的植物DNA小提試劑盒(DNeasy Plant mini kit試劑盒)抽提蠶卵基因組DNA，步驟如下(按照說明書進行):
取20粒蠶卵放入研缽中，液氮充分研磨，將研磨后的粉末收集至1.5mL的離心管中。加Λ 400 μ L裂解緩沖液APl和4 uL Rnase Α，渦旋混勻(400 μ L裂解緩沖液APl和4 μ LRnase A勿在使用前混合)；混勻后的溶液，65°C，孵育10 min (期間上下顛倒試管2~3次)；加130 μ L緩沖液ΑΡ2，混合后冰浴5 min ;然后14，000 rpm，離心5 min ;吸取上清于過濾柱(QIAshredder spin column)中的收集管，14，OOOrpm，離心2min ;將離心管中上清液移至新管(勿攪動出現的殘渣)，加入1.5倍體積的AP3/E，移液器混合；將650 yL混合液移至吸附柱(DNeasy Mini spin column)中，4200 rpm，離心I min ;剩下的液體重復此步驟；將吸附柱放入新收集管中，加入500 μ L緩沖液AW，4200 rpm,離心I min ;棄上清；再加入500μ L緩沖液AW，14000 rpm，離心2 min(保證收集管不接觸到底部上清);移收集管至1.5 mL或2 mL離心管中；加入40 μ L緩沖液AE洗脫，室溫放置5 min ；4200 rpm離心I min ;重復上一步(即加入40 μ L緩沖液AE洗脫，室溫放置5 min, 4200 rpm離心I min);將提取好的總DNA置于-20°C冰箱保存備用。
[0044](2) PCR擴增方法
以樣品總DNA為模板，用實施例1所述三對引物進行PCR擴增。
[0045]所述PCR反應體系(總體積20 μ L):
2 X Taq Master Mix (反應緩沖液)1yL
10 μ M 上游引物 HMGlF0.5 μ L
10 μ M 下游引物 HMGlR0.5 μ L
模板 DNAI μ L ；
ddH20補至 20 yLo
[0046]其中，2XTaq Master Mix (反應緩沖液)的組分為Taq DNA聚合酶，160 mMTris-HCl,40 mM(NH4)2SO4, 3.0 mM MgCl2,400 μΜ dNTP。
[0047]PCR 反應條件為:94°C 5 min ；94°C 30 s，58.5°C 45 s，72°C 45 s，32 個循環；72°C 10 min。
[0048](3)結果判斷
第一對引物HMG1F/HMG1R:PCR反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳，根據是否擴增到561bp的DNA片段判定蠶卵樣品是否感染了家蠶微孢子蟲。當能特異性地擴增出561 bp的DNA片段產物，即可判斷該家蠶或蠶卵感染了家蠶微孢子蟲。
[0049]第二對引物HMGl-sF/HMGl-sR:PCR反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳，根據是否擴增到684 bp的DNA片段判定蠶卵樣品是否感染了家蠶微孢子蟲。當能特異性地擴增出684bp的DNA片段產物，即可判斷該家蠶或蠶卵感染了家蠶微孢子蟲。
[0050]第三對引物HMGl-xF/HMGl-xR:PCR反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳，根據是否擴增到251 bp的DNA片段判定蠶卵樣品是否感染了家蠶微孢子蟲。當能特異性地擴增出251bp的DNA片段產物，即可判斷該家蠶或蠶卵感染了家蠶微孢子蟲。
[0051](4)分別取50粒“有毒”蠶卵(即感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產的蠶卵)、健康蠶卵和純化的家蠶微孢子蟲樣本，分別提取DNA，按照上述的PCR方法進行PCR擴增。
[0052]瓊脂糖凝膠電泳檢測結果分別如附圖1~3所示，三對引物均可在“有毒”蠶卵和純化的家蠶微孢子蟲中檢出特異性的DNA片段，而健康蠶卵中未檢測出特異性片段。表明三對引物和建立的PCR方法均可以很好的用于家蠶微孢子蟲的快速檢測。
[0053]實施例3引物特異性檢測
1、分別以家蠶微孢子蟲(N.b )、柞蠶微孢子蟲(N.a )、玉米螟微孢子蟲(N.f )的DNA為模板，以引物 HMGIF/ HMG1R，HMG1-sF/ HMGl-sR，HMG1-xF/ HMGl-xR，以實施例 2 的方法進行PCR擴增，擴增結束后瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。
[0054]2、三對引物的擴增結果分別如附圖4~6所示。結果顯示，引物HMGIF/ HMGlR和引物HMGl-xF/ HMGl-xR均能夠檢測到多種微孢子蟲，具有很好的通用檢測性。而引物HMG1-sF/ HMGl-sR只能特異的檢測家蠶微孢子蟲。
[0055]實施例4引物靈敏性檢測
1、提取家蠶微孢子蟲(N.b)的DNA，原始濃度為5.0 ng/ μ L。
[0056]將上述N.b DNA用ddH20進行稀釋，分別稀釋10°、1iUO2UO3UO4UO'16倍。即得到濃度梯度為 5.0Χ10'5.ΟΧΙΟ'5.0Χ10_2、5.0Χ10_3、5.0Χ10_4、5.0Χ10_5、5.0X10—6ng/ μ L0
[0057]2、以上述各濃度的 N.b DNA 為模板，以引物 HMGIF/ HMG1R, HMGl-sF/ HMGl-sR，HMG1-xF/ HMGl-xR,以實施例2的方法進行PCR擴增，擴增結束后瓊脂糖凝膠電泳檢測結果O
[0058]3、三對引物的擴增結果分別如附圖7~9所示。結果顯示，引物HMGIF/ HMGlR和引物HMGl-sF/ HMGl-sR均能檢測到5.0X 10_4 ng/ μ L濃度的N.b DNA,具有很好的檢測靈敏性。而引物HMGl-xF/ HMGl-xR的靈敏性差了 I個數量級，能檢測到5.0X 10_3 ng/μ L濃度的 N.b DNAo
[0059]因此，綜上所述，從特異性和靈敏性的角度考慮，只有引物HMGIF/ HMGlR既能夠通用的檢測多種微孢子蟲，又具有很好的檢測靈敏性，在微孢子蟲的實際檢測應用中具有廣泛的應用價值和意義。
[0060]以下實施例進一步對引物HMGIF/ HMGlR的檢測適用性和靈敏性進行測試。
[0061]實施例5感染N.b不同時間段的四齡家蠶中腸和感染N.b的蠶卵檢測 1、總RNA的提取
使用按照艾德萊生物公司的EASYspin植物RNA快速提取試劑盒說明書進行操作，分別提取感染N.b不同時間段的四齡家蠶中腸和感染N.b的蠶卵的RNA，具體步驟如下:
Cl)取500 μ L裂解液RLT，轉入1.5mL離心管中，加入50 μ L植物RNA助提劑(PLANTaid，結合有多糖多酚)混勻備用； (2 )液氮中研磨家蠶組織成細粉后，取50 mg細粉轉入上述裝有裂解液RLT和PLANTaid的離心管，立即用手劇烈振蕩20 S，充分裂解；
(3)將裂解物13000rpm離心5~10min，沉淀不能裂解的碎片和結合有多糖多酚的PLANTaid；
(4)取裂解物上清轉到一個新的離心管。加入上清體積一半的無水乙醇，此時可能出現沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心；
(5)將混合物(每次小于720μ L，多可以分兩次加入)加入一個吸附柱RA中，(吸附柱放入收集管中)13000 rpm離心2 min，棄掉廢液；
(6)加700μ L去蛋白液RWl，室溫放置Imin，13000rpm離心30s，棄掉廢液；
(7)加入500μ L漂洗液Rff, 13000 rpm離心30s，棄掉廢液。加入500 μ L漂洗液Rw,重復一遍；
(8)將吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm離心2min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應；
(9)取出吸附柱RA，放入一個RNase離心管中，根據預期RNA產量在吸附膜的中間部位加30~50 μ L去除RNA酶的無菌水(RNase free water，事先在70~90°C水浴中加熱，可提高產量)，室溫放置lmin，12000rpm離心lmin。
[0062]2、RNA 反轉錄成 cDNA
將提取到的RNA進行反轉錄反應，使用TAKARA公司生產的PrimeScript ? RT reagentKit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒，步驟如下:
(I)去除基因組DNA反應反應體系(20 yL):
5 X gDNA Eraser Buffer4.0 μ L
gDNA Eraserl.0yL
總 RNA^ 2.0yg
RNase Free dH20加至 20 μ L
去除基因組DNA反應條件:42°C，2min (或室溫5min最多可處理30min)。
[0063](2)反轉錄反應反轉錄體系(40 μ L)
步驟(I)的反應液20 μ L
5XPrimeScript Buffer24.0 μ L
PrimeScript RT Enzyme Mix I2.0 μ L
RT Primer Mix2.0 μ L
RNase Free dH20加至 40 μ L
反轉錄反應條件:37°C，15min ;85°C，5s ；4°C /_20°C保存備用。
[0064]3、PCR 檢測
以步驟2得到的各cDNA為模板，用特異性引物HMG1F/HMGR進行RT-PCR反應。
[0065]反應結果如附圖10所示，在N.b感染家蠶中腸的前12 h都沒有檢測到基因，說明此時微孢子蟲還沒有開始繁殖，而從18h開始基因有轉錄活性，此時微孢子蟲可能已經開始進行分裂繁殖。而這一結論與現有技術中家蠶微孢子蟲侵染家蠶的生活史是一致的，也從側面證實了本發明所述檢測引物具有很好的特異性和敏感性。
[0066]實施例6 N.b感染蠶卵不同時間cDNA模板的檢測
1、本實施例分別以N.b感染蠶卵和正常家蠶蠶卵為檢測對象，分別以不浸酸、浸酸前、浸酸后的N.b感染后不同時間的蠶卵的cDNA為模板，以正常家蠶蠶卵DNA為對照，以HMGIF/ HMGlR引物進行PCR檢測。
[0067]2、實驗方法
(I)浸酸前取樣:家蠶微孢子蟲感染家蠶后，在蠶蛾交配2h、8h、10h、12h、17h時分別取蠶卵，置于-80 °C冰箱保存備用。
[0068](2)浸酸處理:將一個卵圈平均分成兩份，產卵后20h左右，浸酸(鹽酸比重為1.075)，浸酸條件為:46°C浸酸5min，清水沖洗20min，置于溫度為25°C，濕度為85%的人工氣候培養箱中培養，至蟻蠶。
[0069](3)將浸酸與不浸酸的蠶卵按產卵后 24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h、240h (蟻蠶)取樣，置于_80°C冰箱保存備用。
[0070]3、結果如附圖11~13所示。
[0071]圖11為HMGIF/ HMGlR引物對N.b感染蠶卵(浸酸前)不同時間cDNA模板的PCR結果；泳道:M 為 DL1000 ；1:2h ；2:8h ；3:10h ；4:12h ；5:17h ；6:純化的 N.b 孢子的 cDNA ；7:正常家蠶蠶卵cDNA ；8:ddH20o
[0072]圖12為HMGIF/ HMGlR引物對N.b感染蠶卵(不浸酸)不同時間cDNA模板的PCR結果；泳道:M 為 DL1000 ；1:24h ；2:48h ；3:72h ；4:96h ；5:120h ；6:144h ；7:168h ；8:192h ；
9:216h ；10:240h ；11:純化的 N.b 的 cDNA ；12:正常家蠶蠶卵 cDNA ；13:ddH20。
[0073]圖13為HMGIF/ HMGlR引物對N.b感染蠶卵(浸酸)不同時間cDNA模板的PCR結果；泳道:M 為 DL1000 ；1:24h ；2:48h ；3:72h ；4:96h ；5:120h ；6:144h ；7:168h ；8:192h ；9:216h ；10:240h ；11:純化的 N.b 的 cDNA ；12:正常家蠶蠶卵 cDNA ；13:ddH20。
[0074]附圖11~13的檢測結果表明，在蠶卵產下2 h時，即可檢測到M2基因有轉錄活性，而且在此后蠶卵(浸酸與不浸酸)的整個發育過程基因都有轉錄活性，因此可以將
基因作為一個分子靶標，來檢測早期蠶卵是否感染了家蠶微孢子蟲。
[0075]綜上所述，本發明的檢測引物和試劑盒能夠準確地判斷樣品是否含有家蠶微孢子蟲，尤其是檢測蠶卵家蠶微孢子蟲，為蠶種生產中“有毒”蠶種的檢測及安全發種提供了保證。實驗結果也表明，細似基因是一個很好的檢測微孢子蟲的分子靶標。
【權利要求】
1.一組微孢子蟲通用檢測引物，其特征在于，所述通用檢測引物包括上游引物HMGlF和下游引物HMG1R，上游引物HMGlF的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，下游引物HMGlR的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
2.權利要求1所述微孢子蟲分子通用檢測引物在制備微孢子蟲通用檢測試劑盒方面的應用。
3.根據權利要求2所述應用，其特征在于，所述微孢子蟲為家蠶微孢子蟲、柞蠶微孢子蟲或玉米螟微孢子蟲。
4.一種微孢子蟲通用檢測試劑盒，其特征在于，包括上游引物HMGlF和下游引物HMG1R，上游引物HMGlF的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，下游引物HMGlR的核苷酸序列如 SEQ ID N0.4 所示。
5.根據權利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的使用方法如下: 以樣品DNA或cDNA為模板，利用引物HMGlF和HMGlR進行PCR反應，反應結束后凝膠電泳檢測擴增產物，根據擴增DNA片段的大小判定結果。
6.根據權利要求5所述試劑盒，其特征在于，所述PCR反應的反應體系為: 2 X反應緩沖液1yL 10 μ M 上游引物 HMGlF0.5 μ L 10 μ M 下游引物 HMGlR0.5 μ L 模板DNAI μ L ddH20補至 20 μ L ; 其中，2Χ反應緩沖液的組分為Taq DNA聚合酶，160 mM Tris-HCl, 40 mM(NH4)2SO4, 3.0mM MgCl2,400 μ M dNTP。
7.根據權利要求5所述試劑盒，其特征在于，所述PCR反應的反應程序為:94°C5min -M0C 30 s,58.5°C 45 s,72°C 45 s，32 個循環；72°C 10 min。
8.根據權利要求5所述試劑盒，其特征在于，所述判定結果的標準為:瓊脂糖凝膠上出現特異性地561 bp的DNA片段產物，即該樣品感染了家蠶微孢子蟲。
【文檔編號】C12Q1/04GK104498599SQ201410755669
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月11日 優先權日:2014年12月11日
【發明者】劉吉平, 宋小景, 程偉 申請人:華南農業大學