納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共生培養發酵制備紅豆乳的方法

納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共生培養發酵制備紅豆乳的方法
【專利摘要】本發明公開了一種納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共生培養發酵制備紅豆乳的方法，包括：將產納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和10263分別進行亞硝基胍誘變，然后混合二者誘變后代，進行細胞融合傳代培養，高通量篩選得到高產納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌；將干酪乳桿菌進行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營養缺陷型的干酪乳桿菌；將篩選出的納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌共發酵紅豆汁，得到富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的紅豆乳。本發明得到的富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的紅豆乳中，吡咯喹啉醌含量達到78-97ng/mL，納豆激酶活力達到714-1218U/mL。
【專利說明】納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共生培養發酵制備紅豆乳的方 法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物工程與發酵領域，具體涉及一種納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共 生培養發酵制備紅豆乳的方法。

【背景技術】
[0002] 納豆由大豆經納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)發酵而成，具有多重生理功效：
[0003] ①納豆對心血管系統的作用：納豆中一種標志性生理活性物質納豆激酶 (Nattokinase，NK)是能夠溶解血栓的蛋白質，由275個氨基酸殘基組成，分子量27KD左右， 無毒、無副作用，是一種絲氨酸蛋白酶，其溶栓效果甚至超過溶栓制劑尿激酶。納豆激酶除 具有直接溶栓作用外，還具有促進靜脈內皮細胞產生纖維蛋白溶酶原激活劑的能力，從而 間接表現其溶栓活性。納豆中亞油酸占全脂質的50%，亞油酸能夠降低血漿中膽固醇含量， 有預防動脈硬化、心臟病和高血壓的功效，具有血栓溶解作用；
[0004] ②納豆對消化系統的作用：大豆蛋白質經納豆酶的作用轉化成可溶性多肽和氨 基酸，有利于人體吸收。lg納豆中含有10億個以上納豆菌，納豆菌繁殖快，能消耗腸道中 的氧，可以抑制引起腸內異常發酵的痢疾桿菌等腐敗菌，促進乳酸菌繁殖，調節腸內細菌平 衡，預防痢疾、腸炎和便秘等。大豆經過納豆菌發酵蓄積了大量蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、酯 酶、纖維素酶和脲酶等酶群，這些生物酶在消化系統中能夠有效調理促進消化吸收。納豆芽 孢桿菌在通過分解利用大豆蛋白進行繁殖的過程中，可以產生大量酵素、維生素、多聚谷氨 酸和多聚果糖等粘性物質，其被覆在胃腸粘膜表面起到保護作用，飲酒時可緩解酒醉。納豆 菌還能殺死腸道出血性大腸桿菌；
[0005] ③納豆對免疫系統的作用：通過接種納豆菌的動物實驗發現，納豆可以提高機體 抵抗力，排除侵入的葡萄球菌，還可以誘發機體干擾素生成，增強機體免疫力；納豆中含有 活性物質如皂草甙、維生素B 2、維生素E等，每天食用可除去體內致癌物質，預防癌癥發生， 并可軟化血管，促進肌膚光滑；
[0006] ④促進骨骼發育：維生素K2可促進鈣與蛋白質結合從而促進骨骼形成，在骨骼形 成過程中起著重要作用，而納豆中維生素1( 2含量是其他發酵食品的數百倍，有預防骨質疏 松、腰痛等老年病的功效。
[0007] 近年發現納豆還具有其它更豐富廣泛的生理功效，源于其另一種標志性生理活性 物質-批咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ)，它是繼黃素核苷酸和煙酰胺核苷 酸之后在細菌脫氫酶中發現的第三種輔基，化學名稱為4, 5-二氫-4, 5-二氧化-1-氫吡咯 (2, 3f)醌-2, 7, 9-三羧酸，又名Methaxatin。雖然自然條件下僅少數細菌如Methylovorus、 Deinococcus radiodurans>Gluconobacter oxydans、Klebsiella pneumoniae 等會泛夠合成 PQQ，但在各種植物、動物以及人體內都發現含有微量PQQ。日本科學家測定了 26種常見食 物中的PQQ含量，發現1克食物中PQQ含量在3. 65-61納克不等，例如，蔬菜中的歐芹、青椒， 水果中的奇異果、木瓜，飲品中的綠茶、烏龍茶，以及人們常吃的豆腐。值得注意的是，日本 傳統食物納豆當中PQQ含量最高，達到61納克/克。
[0008] PQQ作為一種普遍存在于動物和植物組織中的氧化還原酶輔基，雖然含量非常低， 但作用重要，不僅是一種新發現的線粒體呼吸鏈組分，參與催化生物體內氧化還原反應，還 具有非常多樣的生物活性，缺乏時會引起哺乳動物諸多代謝障礙，被認為是一種新型維生 素。PQQ對哺乳動物的主要生理作用有：
[0009] ①全面提高人體免疫功能：PQQ作為人類發育的必要因子，能刺激人體細胞生長， 尤其是激活人體B細胞、T細胞，提高人體免疫功能；
[0010] ②防治肝損傷：PQQ能顯著降低血清膽紅素和谷丙轉氨酶水平，調理肝損傷，對肝 臟疾病有極好療效；
[0011] ③減少自由基對人體的傷害：PQQ是一種氧化還原酶輔基，參與生物體內氧化還 原反應，能有效清除體內自由基，減少自由基對人體傷害所引發的各種疾病，如心臟病、癌 癥以及各類炎癥；
[0012] ④調理各種神經系統疾病：PQQ在體內能促進神經因子合成，調理各種神經系統 疾病；
[0013] ⑤促進氨基酸吸收：PQQ是醌蛋白酶的輔基，參與呼吸鏈電子傳遞，在人體內能促 進氨基酸吸收；
[0014] ⑥促進生長因子合成：生長因子是人類生長的激素，PQQ能刺激人體細胞生長，增 加細胞密度，微量PQQ就能提高生物體組織的代謝能力和生長機能；
[0015] ⑦防治老年癡呆癥：PQQ具有修復神經纖維、活化神經元、激活休眠神經細胞的能 力，能有效防治老年癡呆癥和改善記憶力；
[0016] ⑧促進谷胱甘肽合成：谷胱甘肽具有重要抗氧化作用和整合解毒作用，PQQ能促 進機體谷胱甘肽合成，防止白內障發生和肝臟膽紅素積累；
[0017] ⑨極強的抗癌功能：PQQ激活自然殺傷細胞（NK)細胞為ANK細胞，使其具有殺腫 瘤作用；使NK細胞等免疫細胞聚集，更有效地殺滅腫瘤細胞；封閉腫瘤細胞載鐵蛋白受體， 阻斷其功能，抑制腫瘤生長、轉移；破壞腫瘤細胞脂質雙層，使腫瘤細胞溶解死亡；阻止腫 瘤細胞DNA復制，促其凋亡。
[0018] 在天然食品中，納豆獨有NK，并且PQQ含量最豐富。納豆中的NK和PQQ由納豆芽 孢桿菌產生。納豆是日常健康食品，納豆芽孢桿菌是公認安全的食品級微生物（GRAS微生 物），對納豆芽孢桿菌進行定向選育，然后與乳酸菌共發酵，制備富含NK和PQQ的食品，對于 人們在日常飲食中補充NK和PQQ、充分發揮NK和PQQ的生理調理作用具有重要意義。 [0019] 紅豆味甘、酸、平、無毒，歸肺、心、脾經，有疏風清熱、燥濕止癢、潤膚養顏的功效。 內服有化濕補脾的功效，在食療中常被用于針對高血壓、動脈粥樣硬化、各種原因引起的水 腫及消暑、解熱毒、健胃等。紅豆含有較多的皂角甙，可刺激腸道，有良好利尿作用，能解酒、 解毒。另外，紅豆皮中含有豐富膳食纖維，起到潤腸通便、降血壓、降血脂、調節血糖、解毒抗 癌、預防結石、健美減肥的作用。紅豆還是富含葉酸的食物，產婦、乳母多吃紅小豆有催乳功 效。紅豆乳是用浸泡后的紅豆高溫研磨加工而成的飲品，保留了紅豆營養成分，經乳酸菌發 酵后，將進一步形成乳酸菌素、活性脂肪酸、以乳酸為主的有機酸等諸多食療物質。
[0020] 乳酸菌發酵除能產生諸多食療成分外，還能賦予怡人的甜酸口感。納豆芽孢桿菌 發酵則能產生NK和PQQ。本發明通過選育納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌及其共發酵，開發出 富含NK和PQQ的食療發酵紅豆乳。但如果干酪乳桿菌與納豆芽孢桿菌在同一體系中生長 不平衡會導致一種菌在競爭中排斥另一種，共發酵無法順利進行。關于生理特性，即使在野 生狀態下，乳酸菌胞壁蛋白酶PrtS也只有少數菌株具有且活力不高，分解蛋白質獲得必需 氨基酸的能力不足，而納豆芽孢桿菌具有較強蛋白酶活力，其分解蛋白質產生氨基酸和肽 可滿足乳酸菌對氨基酸的需求。納豆芽孢桿菌兼性厭氧，通過消耗氧氣也促進乳酸菌生長 和產酸。在本發明中，除了納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌兩者之間存在不嚴格偏利共生關系 夕卜，更通過選育手段使干酪乳桿菌因形成甲硫氨酸營養缺陷（Me〇而與納豆芽孢桿菌形成 嚴格偏利共生關系，從而保證了干酪乳桿菌與納豆芽孢桿菌的共發酵順利進行。
[0021] 納豆芽孢桿菌合成NK和PQQ的代謝途徑迄今尚未完全明了，從而無法通過理性優 化手段提高納豆芽孢桿菌合成NK和PQQ的產率。而且由于糖、氨基酸、脂類、核苷酸四大有 機物代謝之間的相通和密切關聯，使得微生物細胞代謝網絡既顯示出剛性（Rigidity)又 顯示出柔性（Plasticity)，處于嚴格控制之中，剛性表現為牽一發而動全身，從而在許多情 形下，即使明了代謝途徑，定點理性突變也并不能獲得理想表型，而柔性表現為對整個代謝 網絡中處于不同節點但又相關的途徑進行協同突變后，會表現出新的代謝屬性。欲提高納 豆芽孢桿菌合成NK和PQQ的產率，不明了其代謝途徑并不成為不可逾越的障礙，只要有合 適的非理性優化手段（Unrational optimization technique),對所有可能與NK和PQQ合 成有關的主流及旁支途徑統籌優化,實現多位點協同突變，并通過高通量篩選使多位點協 同突變的表型從突變庫中凸顯，即可實現提高納豆芽孢桿菌合成NK和PQQ產率的目標。
[0022] 隨機突變是最常見的非理性優化手段，雖然它能夠產生突變位點數量足夠大的突 變庫，但在突變庫中，各突變位點往往是分散獨立于單個細胞中，相互之間無法優化組合， 而且大多不產生可見表型，從而使得絕大多數突變隱沒于突變庫中而不能得到篩選。
[0023] 基因組重排（Genome Shuffling)是在隨機突變的基礎上發展起來的新型誘變育 種技術。它是在通過隨機突變產生突變位點數量足夠大的突變庫的基礎上，進一步通過 細胞融合使各突變位點優化組合，從而使突變指數級上升特別是增加大量表型可見突變。 基因組重排為利用微生物代謝網絡這種柔性進行多點協同突變的菌種選育提供了技術支 撐。Zhang等（2002)首先以傳統誘變方法獲得一個突變庫，篩選出若干個正向突變株作為 出發株，然后通過多輪遞推原生質體融合的方式使眾多基因隨機重組，實現基因組重排，最 終從突變庫中篩選出性狀被提升的目的菌株；St印hanopoulos (2002)通過基因組重排改 造了細菌表型；Patnaik等（2002)利用基因組產品技術實現了乳酸桿菌的一株工業菌株 的改良，令其在pH 4.0下乳酸產量為出發野生菌株的3倍；Gao等（2012)通過兩輪基因 組重排，使 Clostridium acetobutylicum CICC 8012 產 Acetone-Butanol-Ethanol (ABE) 提高了 34. 53% ;Ge 等（2012)通過基因組重排獲得 Saccharomyces cerevisiae GS3-10， 其對五碳糖和六碳糖的轉化率達到69. 48 %和100%，而出發菌株為14. 83 %和100%， 乙醇產率達到47.08g/L，而出發菌株為18. 12g/L;Kang等（2011)通過基因組重排，使 Aureobasidium pullulans產普魯藍多糖大幅度提高，并且遺傳穩定；Zheng等（2010)通 過基因組重排提高了 Sporolactobacillus inulinus ATCC 15538的D-乳酸產率和耐 酸性；John等（2008)通過原生質體融合式的基因組重排，獲得了以木薯-甘蔗渣為基質 的乳酸商廣菌株；Yu等（2008)通過基因組重排獲得了糖耐度提商從而乳酸廣率增加的 Lactobacillus rhamnosus ;Wang等（2007)通過基因組重排獲得了耐酸度提高從而乳酸產 率增加的 Lactobacillus rhamnosus。
[0024] 基因組重排也為進行微生物代謝組學分析提供了支撐。經過基因組重排而代謝 優化的目的菌其遺傳背景來源于出發菌，故通過比對目的菌與出發菌的蛋白表達譜差異， 輔以代謝流和代謝控制分析技術，即可解析導致代謝優化的關鍵酶及有關途徑的調控機 制。Luo 等（2012)通過基因組重排使 Streptomyces gilvosporeus ATCC 13326 的游霉素 (natamycin)產率明顯升高，Streptomyces gilvosporeus ATCC 13326 的蛋白表達譜發生 明顯改變，34種蛋白表達上升而20種蛋白表達下降，提示與游霉素合成有關的牽涉廣泛的 代謝網絡得到優化；Zhang等（2010)通過基因組重排，使Propionibacterium shermanii產 VB12大幅度提高，重排后菌株38種蛋白表達發生改變，其中22種蛋白表達上升而16種蛋白 表達下降，在表達上升的22種蛋白中，有6種是V B12合成途徑中的酶，提示與V B12合成有關 的牽涉廣泛的代謝網絡得到優化。
[0025] 但目前基因組重排在策略上存在一定缺陷，主要是選育培養基與發酵培養基之間 無關聯，使得選育到的菌株在發酵時目標產物產率遠低于預期。針對此問題，本發明在進行 基因組重排選育時，選育平板中添加一定比例的發酵培養基組分，而發酵培養基中添加一 定比例的選育平板組分，使得選育與發酵兩環節之間形成關聯，保障了選育環節表現出高 產表型的菌株在發酵時依然表現出高產表型，此即為本發明的底物誘導適應性策略。因此， 在對納豆芽孢桿菌高產NK兼PQQ表型進行基因組重排選育時，在選育平板中添加一定比例 紅豆汁，而在紅豆乳發酵時則添加一定比例豆芽汁。


【發明內容】

[0026] 本發明提供了一種納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共生培養發酵制備紅豆乳的方法， 本發明在基因組重排技術基礎上進一步采用底物誘導適應性策略，對納豆芽孢桿菌所有可 能與NK和PQQ合成有關的主流及旁支途徑統籌優化，實現多位點協同突變，進而通過高通 量篩選使多位點協同突變的表型從突變庫中凸顯，獲能夠在紅豆乳發酵中高產NK兼PQQ的 納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-203。同時，通過隨機誘變獲得甲硫氨酸營養缺陷（Met_)干 酪乳桿菌（Lactobacilluscasei Shirota-Met-，LcS-Met〇。LcS-Meif在生長速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-203,但前者對后者營養依賴，兩者之間形成穩定共生關系，保障了共發酵順 利完成，從而獲得富含NK和PQQ的紅豆乳。
[0027] -種納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共生培養發酵制備紅豆乳的方法，包括以下步 驟：
[0028] 1)、將產NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263分別進行亞硝基 胍誘變；然后混合二者誘變后代，進行細胞融合傳代培養，在基因組重排技術基礎上進一步 采用底物誘導適應性策略，高通量篩選得到高產NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌，命名為納豆芽 孢桿菌 BN-NKPQQ-RWX-203 ;
[0029] 細胞融合傳代培養實現基因組改組，使納豆芽孢桿菌10261和10623所有誘變后 代的優勢突變得到優化整合。如有必要，可對融合后代進行第二輪或者多輪誘變及融合，直 至選育出NK兼PQQ產率高且生長旺盛、遺傳穩定、適合作為生產菌株的高產NK兼PQQ納豆 芽孢桿菌。
[0030] 2)、將干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota)進行亞硝基胍誘變，從中篩選 出甲硫氨酸營養缺陷型的干酪乳桿菌，命名為干酪乳桿菌LcS-Meif (Lactobacillus casei Shirota-Met-)；
[0031] 3)將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-203和干酪乳桿菌LcS-Mef共發酵紅豆汁，得 到富含NK和PQQ的紅豆乳。
[0032] 本發明在基因組重排技術基礎上進一步采用底物誘導適應性策略，對納豆芽孢桿 菌所有可能與NK和PQQ合成有關的主流及旁支途徑統籌優化，實現多位點協同突變，進而 通過高通量篩選使多位點協同突變的表型從突變庫中凸顯，獲得能夠在紅豆乳發酵中高產 NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-203。同時，通過隨機誘變獲得甲硫氨酸營養缺陷 (Met )干釀乳桿菌LcS-Met。
[0033] 欲使干酪乳桿菌與納豆芽孢桿菌順利共發酵，兩者之間應形成共生關系。本發 明的策略是使通常情況下競爭占優的干酪乳桿菌成為甲硫氨酸營養缺陷（LcS-MeO，從 而在代謝上對納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-203形成依賴，其所需要的甲硫氨酸（Met) 由納豆芽孢桿菌供給，即形成嚴格的偏利共生關系。雖然LcS-Mef在生長速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-203,但前者對后者營養依賴，兩菌之間形成穩定共生關系，保障了共發酵順 利完成，從而獲得富含NK和PQQ的紅豆乳。
[0034] 所用納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌均屬于食品級安全微生物，共發酵得到的富含NK 和PQQ的紅豆乳中，PQQ含量達到78-97ng/mL，高于天然食品中含量最高的納豆（55-63ng/ mL)和豆腐（25-30ng/mL)。NK活力達到714-1218U/mL。所獲得的紅豆乳除富含納豆激酶 和吡咯喹啉醌之外，呈均一暗紅色，具有紅豆乳固有的滋味和發酵后特有的風味。
[0035] 步驟1)中，納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263采用現有技術，納豆芽孢 桿菌10261來自中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝陽區酒仙橋中 路24號院6號樓；保藏日期為2002年，菌種保持編號為10261 ;納豆芽孢桿菌10263來自中 國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝陽區酒仙橋中路24號院6號樓； 保藏日期為2002年，菌種保持編號為10263;干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Shirota) 來自養樂多（上海）有限公司；小鼠抗PQQIgG單抗PQQ-mAb采用市售產品，購自嘉興元科 生物科技有限公司，商品號為YK-Ab-013。
[0036] 所述的底物誘導適應性基因組重排后的高通量篩選具體包括：①制備2個平板豆 芽汁紅豆汁固體培養基（紅豆汁占平板總量的10% -15%，使得選育培養基與發酵培養基 之間發生關聯，此即為本發明的底物誘導適應性策略），其中一個將小鼠抗PQQIgG單抗 PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個將瓊脂糖-纖維蛋白配入，形成平板B ;②將納豆芽孢桿 菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變融合后代涂布其中一個平板后，再用纖維素膜影印 至另一個平板，使平板A和平板B互為影印平板；③平板A中，高產PQQ誘變融合后代菌落 周圍形成肉眼可見沉淀線，根據沉淀圈直徑大小可肉眼判斷產PQQ量大小；④平板B中，高 產NK誘變融合后代菌落周圍形成透明圈，根據透明圈直徑大小可肉眼判斷產NK活力高低； ⑤平板A與平板B中，高產PQQ菌落與高產NK菌落處于同一位置者，即為高產NK兼PQQ的 納豆芽孢桿菌。
[0037] 所獲得的高產NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-203保藏于斜面豆芽汁紅 豆汁固體培養基中。
[0038] 所述的平板豆芽汁紅豆汁固體培養基和斜面豆芽汁紅豆汁固體培養基以1L計， 由以下量的組分組成：
[0039] 紅豆汁 100?150mL; 蔗糖 4.0?6.0g; 瓊脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
[0040] 進一步優選，所述的平板豆芽汁紅豆汁固體培養基和斜面豆芽汁紅豆汁固體培養 基以1L計，由以下量的組分組成：
[0041] 紅豆汁 100?150mL; 蔗糖 5.0g; 瓊脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
[0042] 所述的豆芽汁的制備：剛出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸濃縮至1000mL后過 濾，得到豆芽汁。
[0043] 該平板豆芽汁紅豆汁固體培養基的配方有利于納豆芽孢桿菌菌落形成和高通量 篩選。該斜面豆芽汁紅豆汁固體培養基的配方有利于納豆芽孢桿菌保藏。
[0044] 本發明中，采用基因組重排技術選育納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-203時，選育平 板中添加一定比例的發酵培養基組分（紅豆汁），而發酵培養基中添加一定比例的選育平 板組分（豆芽汁），使得選育與發酵兩環節之間形成關聯，促使選育環節表現出高產表型的 菌株在發酵時依然表現出高產表型，此即為本發明的底物誘導適應性策略。
[0045] 步驟2)中，所述的從中篩選出甲硫氨酸營養缺陷型的干酪乳桿菌，具體包括：① 制備2個平板MRS固體培養基，其中一個將甲硫氨酸（Met)配入（Met添加量為10-15mg/ L)，為平板C，另一個為單純MRS固體培養基平板（平板D)，為平板D ;②將誘變后的干酪乳 桿菌（Lactobacillus casei Shirota)涂布其中一個平板后，再用纖維素膜影印至另一個 平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出現菌落 而平板D未出現菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落為甲硫氨酸營 養缺陷型干酪乳桿菌，命名為干酪乳桿菌LcS-Mef，保藏于斜面MRS固體培養基中。
[0046] 所述的平板MRS固體培養基和斜面MRS固體培養基以1L計，由以下量的組分組 成：
[0047] 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 梓檬酸氧二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 鱗酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量；
[0048] 該MRS固體培養基的pH值保持在6.2?6.4。
[0049] 該MRS固體培養基有利于干酪乳桿菌菌落形成和甲硫氨酸營養缺陷型干酪乳桿 菌的篩選。
[0050] 本發明中，采用隨機誘變技術獲得甲硫氨酸營養缺陷（Me〇的干酪乳桿 菌（Lactobacillus casei Shirota-Meif，LcS-Met〇。LcS-Meif在生長速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-203,但前者對后者營養依賴，兩者之間形成穩定共生關系，通過構建共生關 系的策略實現納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌的共發酵，獲得富含NK和PQQ的紅豆乳。
[0051] 步驟3)中，在共發酵之前，將BN-NKPQQ-RWX-203和LcS-Met_*別進行活化培 養，BN-NKPQQ-RWX-203在豆芽汁紅豆汁液體培養基中進行活化培養，培養溫度為34? 36°C (優選35°C )，LcS-Met-在MRS液體培養基中進行活化培養，培養溫度為36?38°C (優 選 37。。）。
[0052] 所述的豆芽汁紅豆汁液體培養基以1L計，由以下量的組分組成：
[0053]紅豆汁 100 ?150mL;
[0054]鹿糖 4. 0 ?6. 0g;
[0055] 豆芽汁 余量。
[0056] 所述的豆芽汁紅豆汁液體培養基以1L計，優選的，由以下量的組分組成：
[0057]紅豆汁 100 ?150mL;
[0058]蔗糖 5. 0g;
[0059] 豆芽汁 余量。
[0060] 該豆芽汁紅豆汁液體培養基的配方有利于納豆芽孢桿菌增殖培養。豆芽汁制備： 剛出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸濃縮至1000mL后過濾，得到豆芽汁。
[0061] 所述的MRS液體培養基以1L計，由以下量的組分組成：
[0062] 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g； 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； 該MRS液體培養基的pH值保持在6.2?6.4。
[0063] 該MRS液體培養基有利于干酪乳桿菌增殖培養。
[0064] 將BN-NKPQQ-RWX-203和LcS-Met_共發酵含紅豆汁的紅豆乳發酵培養基，具體包 括：將活化后的BN-NKPQQ-RWX-203和LcS-Met_混合，形成混合菌液，將混合菌液接種至含 紅豆汁的紅豆乳發酵培養基，紗布封口培養后得到富含NK和PQQ的紅豆乳。
[0065] 所述的紅豆乳發酵培養基以1L計，由以下量的組分組成：
[0066] 蔗糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; 豆芽lOOmL； 紅豆汁 余量。
[0067] 所述的紅豆汁的制備包括：水中加紅豆，浸泡2?12小時，90°C?99°C碾磨成漿 汁，得到紅豆汁，其中，所述的水的體積與紅豆的質量之比為100mL :10?25g。具體地，如 100mL水中加10?25g紅豆，浸泡2小時以上后，90°C以上碾磨成漿汁。
[0068] 混合菌液中，所述的BN-NKPQQ-RWX-203和LcS-Mef的混合密度比為1:2?1:5。
[0069] 所述的混合菌液接種至含紅豆汁的紅豆乳發酵培養基的接種量為1 %?5%。
[0070] 所述的紗布封口培養的條件為：37°C?42°C六層紗布封口培養24h?36h。
[0071] 共發酵時，在紅豆乳培養基中，添加酪氨酸和谷氨酸對BN-NKPQQ-RWX-203進行代 謝調控，促進PQQ合成，添加麥芽糖對BN-NKPQQ-RWX-203進行代謝調控，促進NK生成，添加 豆芽汁促進BN-NKPQQ-RWX-203在紅豆乳發酵過程中的增殖。本發明中，納豆芽孢桿菌與干 酪乳桿菌選育及其共發酵制備的紅豆乳，除富含納豆激酶和吡咯喹啉醌之外，呈均一暗紅 色，具有紅豆乳固有的滋味和發酵后特有的風味。
[0072] 與現有技術相比，本發明具有如下優點：
[0073] -、本發明使用的納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌均屬于食品級安全微生物。
[0074] 二、首次采用基因組重排技術優化NK和PQQ合成途徑，對納豆芽孢桿菌所有可能 與NK和PQQ合成有關的主流及旁支途徑統籌優化，實現多位點協同突變，進而通過高通量 篩選使多位點協同突變的表型從突變庫中凸顯。同時，在基因組重排技術基礎上進一步采 用底物誘導適應性策略，保障了選育環節表現出高產表型的菌株在發酵時依然表現出高產 表型，獲得能夠在紅豆乳發酵中高產NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-203。
[0075] 三、首次采用構建共生關系的策略實現納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌的共發酵。通 過隨機誘變獲得甲硫氨酸營養缺陷（Me〇干酪乳桿菌LcS-Met' LcS-Mef在生長速度上 高于BN-NKPQQ-RWX-203,但前者對后者營養依賴，兩者之間形成穩定共生關系，保障了共發 酵順利完成，從而獲得富含NK和PQQ的紅豆乳。
[0076] 四、從結構上看，PQQ通過酪氨酸和谷氨酸之間形成肽鍵連接環化而成。本發明通 過在紅豆乳發酵培養基中添加酪氨酸和谷氨酸對BN-NKPQQ-RWX-203進行代謝調控，促進 PQQ合成。通過在紅豆乳發酵培養基中添加麥芽糖對BN-NKPQQ-RWX-203進行代謝調控，促 進NK生成。通過在紅豆乳發酵培養基中添加豆芽汁促進BN-NKPQQ-RWX-203在紅豆乳發酵 過程中的增殖，從而得到富含NK和PQQ的紅豆乳，PQQ含量達到78-97ng/mL，高于天然食品 中含量最高的納豆（55-63ng/mL)和豆腐（25-30ng/mL)。NK活力達到714-1218U/mL。所獲 得的紅豆乳除富含納豆激酶和吡咯喹啉醌之外，呈均一暗紅色，具有紅豆乳固有的滋味和 發酵后特有的風味。

【具體實施方式】
[0077] 在實施例中，有關培養基配制如下，
[0078] (a)所述的豆芽汁紅豆汁液體培養基配制完成后，121°C滅菌15min，以1L計，由以 下量的組分組成：
[0079]紅豆汁 130mL ;
[0080] 蔗糖 5. 0g ;
[0081] 豆芽汁 余量；
[0082] 該豆芽汁紅豆汁液體培養基的配方有利于納豆芽孢桿菌增殖培養。豆芽汁制備 ： 剛出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸濃縮至1000mL后過濾，得到豆芽汁。
[0083] (b)所述的豆芽汁紅豆汁固體培養基（平板）配制完成后，121°C滅菌15min，以1L 計，由以下量的組分組成：
[0084] 紅豆汁 130mL; 蔗糖 5.0g; 瓊脂 1..8g; 豆芽汁 余量；
[0085] 該豆芽汁紅豆汁固體培養基（平板）的配方有利于納豆芽孢桿菌菌落形成和高通 量篩選。
[0086] (c)所述的豆芽汁紅豆汁固體培養基（斜面）配制完成后，121°C滅菌15min，以1L 計，由以下量的組分組成：
[0087] 紅豆汁 130mL； 蔗糖 5.0g; 瓊脂 1.8g; 豆芽汁 余量；
[0088] 倒試管斜面
[0089] 該豆芽汁紅豆汁固體培養基（斜面）的配方有利于納豆芽孢桿菌的保藏。
[0090] (d)所述的MRS液體培養基配制完成后，121°C滅菌15min，以1L計，由以下量的組 分組成：
[0091] 蛋白胨 1〇.〇g; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫2.0g； 葡萄糖 20.0g; 乙酸納 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； pH6.2 ?6.4
[0092] 該MRS液體培養基有利于干酪乳桿菌增殖培養。
[0093] (e)所述的MRS固體培養基（平板）配制完成后，121°C滅菌15min，以1L計，由以 下量的組分組成：
[0094]

【權利要求】
1. 一種納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共生培養發酵制備紅豆乳的方法，其特征在于，包 括以下步驟： 1)、將產納豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263分別進 行亞硝基胍誘變；然后混合二者誘變后代，進行細胞融合傳代培養，高通量篩選得到高產納 豆激酶兼吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌，命名為納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-203 ; 2) 、將干酪乳桿菌進行亞硝基胍誘變，從中篩選出甲硫氨酸營養缺陷型的干酪乳桿菌， 命名為干酪乳桿菌LcS-Met_; 3)將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-203和干酪乳桿菌LcS-Met_共發酵紅豆汁，得到富 含納豆激酶和吡咯喹啉醌的紅豆乳。
2. 根據權利要求1所述的納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共生培養發酵制備紅豆乳的方 法，其特征在于，步驟1)中，所述的高通量篩選具體包括：①制備2個平板豆芽汁紅豆汁固 體培養基，其中一個將小鼠抗PQQIgG單抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一個將瓊脂糖-纖 維蛋白配入，形成平板B;②將納豆芽孢桿菌10261和納豆芽孢桿菌10263的誘變融合后代 涂布其中一個平板后，再用纖維素膜影印至另一個平板，使平板A和平板B互為影印平板； ③平板A中，高產吡咯喹啉醌的誘變融合后代菌落周圍形成肉眼可見沉淀圈，根據沉淀圈 直徑大小可肉眼判斷產吡咯喹啉醌量大小；④平板B中，高產納豆激酶的誘變融合后代菌 落周圍形成透明圈，根據透明圈直徑大小可肉眼判斷產納豆激酶活力高低；⑤平板A與平 板B中，高產吡咯喹啉醌菌落與高產納豆激酶菌落處于同一位置者，即為高產納豆激酶兼 吡咯喹啉醌的納豆芽孢桿菌。
3.根據權利要求2所述的納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共生培養發酵制備紅豆乳的方 法，其特征在于，步驟1)中，所述的平板豆芽汁紅豆汁固體培養基以IL計，由以下量的組分 組成： 紅豆汁 100?丨50mL; 蔗糖 4.0?6.0g; 瓊脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
4.根據權利要求1所述的納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共生培養發酵制備紅豆乳的方 法，其特征在于，步驟2)中，所述的從中篩選出甲硫氨酸營養缺陷型的干酪乳桿菌，具體包 括：①制備2個平板MRS固體培養基，其中一個將甲硫氨酸配入，為平板C，另一個為單純 MRS固體培養基平板，為平板D;②將誘變后的干酪乳桿菌涂布其中一個平板后，再用纖維 素膜影印至另一個平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位 置，平板C出現菌落而平板D未出現菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則 該菌落為甲硫氨酸營養缺陷型干酪乳桿菌。
5.根據權利要求4所述的納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共生培養發酵制備紅豆乳的方 法，其特征在于，步驟2)中，所述的平板MRS固體培養基以IL計，由以下量的組分組成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 豐寧檬酸氫二銨 2.Og; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 〇.58g; 硫酸錳 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫80 l.OmL； 水 余量； 該MRS固體培養基的pH值保持在6. 2?6. 4。
6. 根據權利要求1所述的納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共生培養發酵制備紅豆乳的方 法，其特征在于，步驟3)中，在共發酵之前，將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-203和干酪乳桿 菌LcS-Met_分別進行活化培養，納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-203在豆芽汁紅豆汁液體培 養基中進行活化培養，培養溫度為34?36°C，干酪乳桿菌LcS-Met_iMRS液體培養基中進 行活化培養，培養溫度為36?38°C。
7. 根據權利要求6所述的納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共生培養發酵制備紅豆乳的方 法，其特征在于，步驟3)中，所述的豆芽汁紅豆汁液體培養基以IL計，由以下量的組分組 成： 紅豆汁 100?150mL; 鹿糖 4. 0?6.Og; 豆芽汁余量； 所述的MRS液體培養基以IL計，由以下量的組分組成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 吐溫80 l.OmL： 水 余量； 該MRS液體培養基的pH值保持在6. 2?6. 4。
8. 根據權利要求1所述的納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共生培養發酵制備紅豆乳的方 法，其特征在于，步驟3)中，將納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-203和干酪乳桿菌LcS-Mef共 發酵紅豆汁，具體包括：將活化后的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-203和干酪乳桿菌 LcS-Mef混合，形成混合菌液，將混合菌液接種至含紅豆汁的紅豆乳發酵培養基，紗布封口 培養后得到富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的紅豆乳； 所述的紅豆乳發酵培養基以IL計，由以下量的組分組成： 蔗糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; Λ7.芽?|· IOOmL; 紅豆汁 余量。
9.根據權利要求8所述的納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共生培養發酵制備紅豆乳的方 法，其特征在于，步驟3)中，所述混合菌液中的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-203和干酪乳 桿菌LcS-MetI^菌數密度比為1:2?1:5 ; 所述的混合菌液接種至含紅豆汁的紅豆乳發酵培養基的接種量為1%?5% ; 所述的紗布封口培養的條件為：37°C?42°C六層紗布封口培養24h?36h。
10. 根據權利要求1所述的納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共生培養發酵制備紅豆乳的 方法，其特征在于，步驟3)中，所述的紅豆汁的制備包括：水中加紅豆，浸泡2?12小時， 90°C?99°C碾磨成漿汁，得到紅豆汁，其中，所述的水的體積與紅豆的質量之比為IOOmL: 10 ?25g。
【文檔編號】C12N15/01GK104430912SQ201410751453
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月10日 優先權日:2014年12月10日
【發明者】吳淵, 鄧惟, 張哲滔 申請人:杭州元佩特生物科技有限公司