一種有機污染物致大鼠肝臟細胞凋亡的方法
【專利摘要】本發明公開了一種有機污染物致大鼠肝臟細胞凋亡的方法，該方法利用固相萃取法提取有機污染物，對大鼠進行經口亞慢性灌胃染毒，染毒90天后固定、包埋、脫蠟、洗滌、消化、閉液、洗滌、顯色觀察肝臟細胞發生的變化，本研究中，隨染毒劑量升高，大鼠肝細胞凋亡指數逐漸升高，尤以中、高劑量組明顯。進一步進行相關性分析發現肝細胞的凋亡存在劑量依賴性。提示該地飲用水有機污染物較高劑量亞慢性暴露可誘導大鼠肝細胞發生細胞凋亡。本方法不但能從形態上觀察凋亡細胞和凋亡小體，同時也能了解其分布并進行定量分析，是標記凋亡細胞較可靠的方法。
【專利說明】-種有機污染物致大鼠肝臟細胞凋亡的方法
【技術領域】
[0001] 一種有機污染物致大鼠肝臟細胞凋亡的方法，屬于衛生檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 關于有機污染物致肝臟損傷的機制尚無統一定論，涉及的學說眾多：如苯并芘和 滴滴涕可引起肝細胞凋亡、多氯聯苯可致肝微粒體CYPlAl酶活力異常改變、二氯溴烷能夠 誘導肝細胞腺瘤形成等。其中，細胞凋亡作為一種由基因控制的程序性細胞死亡，在保持 器官和組織的穩定性方面起著重要作用，不正常的凋亡調控可以引起組織器官損傷乃至 癌癥等疾患。近年來多項研究表明肝細胞凋亡在肝病的發生、發展中發揮著重要作用，參與 許多肝臟疾病的病理過程。凋亡過度或不足都會導致不同程度的肝損傷，如爆發性肝衰竭、 肝硬化、病毒性肝炎、自身免疫性肝病以及肝臟腫瘤等。近年的研究也多認為各種原因引起 的肝細胞損傷與細胞凋亡有著密切的關系。檢測細胞凋亡的方法很多，有形態學觀察法、標 記法、流式細胞儀技術、ELISA法，本實驗使用的方法不但能從形態上觀察凋亡細胞和凋亡 小體，同時也能了解其分布并進行定量分析，是標記凋亡細胞較可靠的方法。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是：提供一種有機污染物致大鼠肝臟細胞凋亡的方法，能直觀的發 現肝臟的損害情況。
[0004] 本發明的技術方案 一種有機污染物致大鼠肝臟細胞凋亡的方法，該方法利用固相萃取法提取有機污染 物，對大鼠進行經口亞慢性灌胃染毒，染毒90天后固定、包埋、脫蠟、洗滌、消化、閉液、洗 滌、顯色觀察肝臟細胞發生的變化，以達到直觀、清楚地觀察肝細胞凋亡的部位及數量。
[0005] 前述的一種有機污染物致大鼠肝臟細胞凋亡的方法中，采用固相萃取法富集水中 有機污染物，萃取劑為XAD-2樹脂，洗脫劑為二氯甲烷和甲醇，水樣過柱流速為4倍柱體積 /min，過柱完后依次用3倍柱體積的二氧甲烷和甲醇先后洗柱，流速0. 1倍柱體積/min，洗 脫液經旋轉蒸發儀25°C減壓蒸餾揮干，將已揮干的濃縮提取物用玉米油定容至50L/ml (母 液）-200C冰箱保存備用。 前述的一種有機污染物致大鼠肝臟細胞凋亡的方法中，將40只SD大鼠按隨機區組法 分為4組，每組10只，雌雄各半，1組為對照組（予玉米油），其余3組為低、中、高劑量染毒 組，依據預實驗結果，確定大鼠染毒高劑量組劑量為80L飲用水有機污染物提取物/kg. bw. day,向下設置低、中2個劑量組，分別為20L/kg. bw. day，5L/kg. bw. day。
[0006] 由于采用了上述技術方案，與現有技術相比，由于隨染毒劑量升高，大鼠肝細胞凋 亡指數逐漸升高，尤以中、高劑量組明顯。進一步進行相關性分析發現肝細胞的凋亡存在劑 量依賴性。提示該地飲用水有機污染物較高劑量亞慢性暴露可誘導大鼠肝細胞發生細胞凋 亡。本實驗使用的方法不但能從形態上觀察凋亡細胞和凋亡小體，同時也能了解其分布并 進行定量分析，被認為是標記凋亡細胞較可靠的方法。
【具體實施方式】
[0007] 下面對本發明進一步的詳細說明，但不作為對本發明的任何限制。
[0008] 1材料與試劑 1材料 1. 1主要試劑及其配制 1. 1. 1主要的試劑 脫脂奶粉（武漢博士德公司）；甲醇（上海生工）；過硫酸銨（APS)、Tween 20、Tris、甘 氨酸、SDS、二甲苯：上海碧云天公司。
[0009] I. L 2 試劑的配制 10XTBS Tris、24. 2gNacl、80g加700ml蒸餾水溶解后用IMoIHcI調PH至7. 6,再加蒸餾水定 容至IL 2. 2主要的儀器 高速臺式冷凍離心機（Sigma 2-16k，美國Sigma公司）、顯微鏡（BX51，日本奧林巴斯公 司）、透射電子顯微鏡（日立H-7650,日本日立公司）、抽真空型脫水機（Leica TP1020,德 國徠卡公司）、生物組織石蠟包埋機（YB-6LF，孝感市亞光醫用電子科技公司）、旋轉式超薄 切片機（LEICA RM2135,德國徠卡公司）、徠卡攤片機（HI1210,德國徠卡公司）、徠卡烘片機 (HI1220,德國徠卡公司）。
[0010] 2實驗方法 (1)載玻片預先用多聚賴氨酸浸泡處理，大鼠肝臟組織用10%多聚甲醛固定，石蠟包 埋制作切片。
[0011] (2)肝臟切片常規脫蠟入水：將切片依次浸入二甲苯I lOmin、二甲苯II lOmin、 95% 乙醇 I 4min、95% 乙醇 II 3min、80% 乙醇 2min、蒸饋水洗 lmin。
[0012] (3)新鮮配制3%乙酸（ρΗ=2· 5)室溫處理IOmin,蒸饋水洗漆2minX3次。
[0013] (4)標本切片上滴加 0· OlM TBS ((pH=7) 1:200 新鮮稀釋 Proteinase K 37oC 消化 IOmin,用 0· OlM TBS 洗 2minX3 次。
[0014] (5)按每張切片取TdT和DIG-d-UTP各?μ?，加入到18μ1標記緩沖液中，充分混勻 配成標記液。甩去切片上多余液體后加標記液，按2〇μ1/片，置于濕盒中，37 〇C標記2h。
[0015] (6) 0· OlM TBS 洗 2minX3 次。
[0016] (7)在切片上滴加封閉液3〇μ1/片，室溫反應30min,甩掉封閉液，不洗。
[0017] (8)用抗體稀釋液1:100稀釋生物素化抗地高辛抗體，混勻后5〇μ1/片加至標本 片上并置于濕盒中，37oC反應50min。0. OlM TBS洗2minX3次。
[0018] (9)用抗體稀釋液1:100稀釋SABC-AP，混勻后5〇μ1/片加至切片上。37〇C反應 60min。0.01M TBS 洗 5minX4 次。
[0019] (10) DAB避光顯色：取Iml蒸餾水，分別加入DAB試劑盒中A、B、C試劑各一滴，混 勻后加至標本片上，37°C顯色20?30min左右(顯微鏡下控制時間）。充分水洗。
[0020] (11)蘇木素輕度復染Imin, 0. OlM TBS洗,蒸饋水洗lmin、80%乙醇2min、95%乙 醇I 3min、95%乙醇II4min、二甲苯I IOmiru二甲苯II lOmin，中性樹膠封片。
[0021] (12)結果判斷：光鏡觀察，細胞核呈棕黃色或其中有棕黃色顆粒者為陽性細胞， 即凋亡細胞。凋亡率（Al)的計算：每張切片隨機取10個高倍鏡視野（X400)，計數視野 中凋亡細胞數占視野細胞總數的百分比，肝臟細胞總數應不少于1000個。
[0022] 2 結果 隨著染毒劑量的升高，肝臟細胞的凋亡率呈上升趨勢，與對照組比較，中高劑量組升高 明顯，差異具有統計學意義（P〈〇. 05)，詳見表9。
[0023] 細胞凋亡率與染毒劑量呈正相關關系，相關系數r=0. 5683 (P〈0. 05)，回歸方程為 Y=0. 118X+6. 197 (Y為細胞凋亡率，X染毒劑量）；與血清CHE水平呈正相關關系，r=0. 4054 (P〈0. 05)，回歸方程為Y=0. 570X+115. 006 (Y為血清CHE水平，X為肝臟細胞凋亡率）。
【權利要求】
1. 一種有機污染物致大鼠肝臟細胞凋亡的方法，其特征在于：該方法利用固相萃取法 提取有機污染物，對大鼠進行經口亞慢性灌胃染毒，染毒90天后固定、包埋、脫蠟、洗滌、消 化、閉液、洗滌、顯色觀察肝臟細胞發生的變化，以達到直觀、清楚地觀察肝細胞凋亡的部位 及數量。
2. 根據權利要求1所述的一種有機污染物致大鼠肝臟細胞凋亡的方法，其特征在于：采用固相萃取法富集水中有機污染物，萃取劑為XAD-2樹脂，洗脫劑為二氯甲烷和甲醇，水 樣過柱流速為4倍柱體積/min，過柱完后依次用3倍柱體積的二氧甲烷和甲醇先后洗柱，流 速〇. 1倍柱體積/min，洗脫液經旋轉蒸發儀25°C減壓蒸餾揮干，將已揮干的濃縮提取物用 玉米油定容至50L/ml (母液）-200C冰箱保存備用。
3. 根據權利要求1所述的一種有機污染物致大鼠肝臟細胞凋亡的方法，其特征在于：將40只SD大鼠按隨機區組法分為4組，每組10只，雌雄各半，1組為對照組（予玉米油）， 其余3組為低、中、高劑量染毒組，依據預實驗結果，確定大鼠染毒高劑量組劑量為80L飲用 水有機污染物提取物/kg. bw. day，向下設置低、中2個劑量組，分別為20L/kg. bw. day，5L/ kg. bw. day。
【文檔編號】C12Q1/06GK104498581SQ201410750636
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月10日 優先權日:2014年12月10日
【發明者】敖云霞 申請人:敖云霞