一種快速檢測植物乳桿菌st-iii的引物及其檢測方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明目的是提供一種植物乳桿菌ST-III菌株的特異性標記分子，其特征在于：所述特異性標記分子是編碼植物乳桿菌ST-III的KdpA蛋白質的基因，并位于植物乳桿菌ST-III來源的pST-III質粒上。本發明的另一個目的是提供一種檢測植物乳桿菌ST-III的引物對，其特征在于：該引物對中，一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的特異性標記分子的序列形同，引物長度為15-40bp；另一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的特異性分子標記的序列互補，引物長度為15-40bp，該引物對擴增片段長度為200-1773bp。具有如下優點：檢測速度快、特異性高、靈敏度高、成本低。
【專利說明】一種快速檢測植物乳桿菌ST-I I I的引物及其檢測方法和 試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種快速檢測植物乳桿菌ST-III的引物及其檢測方法和試劑盒，屬 于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 植物乳桿菌ST-III是一株典型的益生菌，自身具有降低膽固醇、降血脂、提高人 體免疫力等多種益生功能。該菌株的基因組已于2010年測定并公布，同時該菌株已經作 為發酵劑應用于工業生產，但目前市場相對混亂，存在大量以假亂真、以次充好的現象。目 前已經確定植物乳桿菌ST-III的很多益生功能與其自身的pST-ΙΙΙ質粒密切相關，而且 pST-III質粒決定了植物乳桿菌ST-III -些特殊性質。pST-ΙΙΙ質粒大小為53. 6kbp，多拷 貝，而且核苷酸序列也已經被公布測定。這些核苷酸序列的公布可以使我們了解不同益生 菌的遺傳結構和特點，找出不同菌株的專有特征，從而為同種細菌不同菌株間的區分和鑒 定奠定基礎。經分析發現pST-III質粒存在一個編碼鉀離子轉運基因簇Kdp，此基因簇賦予 植物乳桿菌ST-III極強的耐鹽性，而且是目前為止在乳桿菌中僅在植物乳桿菌ST-III發 現這一鉀離子轉運簇。這為植物乳桿菌ST-III進行分子標記，并提供特異性的檢測方法提 供額可能。分子檢測主要是PCR方法檢測具有檢測速度快、靈敏度高、特異性強、成本低的 優勢，因此建立植物乳桿菌ST-III的PCR方法能快速的將植物乳桿菌ST-III與其它植物 乳桿菌菌株區分開來，從而檢測市場上以假亂真、以次充好的乳制品，對乳制品的監管，具 有很強的應用價值。
【發明內容】
[0003] 為解決上述問題，本發明采用了如下技術方案：
[0004] 本發明的一個目的是提供一種植物乳桿菌ST-III菌株的特異性標記分子，其特 征在于：
[0005] 特異性標記分子是編碼植物乳桿菌ST-III的KdpA蛋白質的基因，位于植物乳桿 菌ST-III來源的pST-III質粒上。
[0006] 本發明所提供的特異性標記分子，還可以具有這樣的特征：
[0007] 的特異性標記分子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第720位至第1200位所示。
[0008] 本發明的另一個目的是提供一種檢測植物乳桿菌ST-III的引物對，其特征在于：
[0009] 該引物對中，一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的特異性標記分子的序列中的 一段相同，長度為15_40bp ;另一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的特異性分子標記的序 列中的一段互補，長度為15_40bp，該引物對擴增出的片段長度為200-1773bp。
[0010] 本發明所提供的引物，還可以具有這樣的特征，的引物對中，一條引物的序列如 SEQ ID NO. 2所示，另一條引物的序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0011] 本發明的又一個目的在于提供一種檢測植物乳桿菌ST-III菌株的試劑盒，其特 征在于：該試劑盒包括上述目的中所提供的引物對。
[0012] 根據本發明所提供的試劑盒，其特征在于：
[0013] 的試劑盒還包括dNTP，10 XPCR緩沖液和Taq DNA聚合酶。
[0014] 本發明再一個目的在于提供一種植物乳桿菌ST-III菌株的檢測方法，其特征在 于，包括如下步驟：
[0015] 步驟一，提取待測樣品囷株中的質粒DNA ;
[0016] 步驟二，以步驟一所得質粒DNA為模板，以上述目的中所提供的引物對進行PCR反 應；
[0017] 步驟三，將步驟二所得PCR反應產物進行電泳檢測，檢測是否存在權利要求3或4 的引物擴增出的片段。
[0018] 另外，本發明所提供的植物乳桿菌ST-III菌株的檢測方法，還可以具有這樣的特 征：
[0019] 其中，步驟二中的PCR反應的反應體系包括引物對，該引物對中的兩種引物的濃 度均為 0· 5mmol/L ;0· 2mmol/L 的dNTP ;lXPCRbuffer ;L 5mmol/L的 Mg2+;0. 02U/yL的Taq DNA聚合酶；以及I. 0-2. Ong/ μ L的DNA模板。
[0020] 另外，本發明所提供的植物乳桿菌ST-III菌株的檢測方法，還可以具有這樣的特 征：
[0021] 步驟二中的 PCR反應程序為：95°C，3min ;95°C下 45s，55°C下 45s，72°C下 lmin，進 行30個循環；72°C，5min ;4°C保存。
[0022] 本發明的再一個目的在于提供一種上述特異性標記分子作為植物乳桿菌ST-III 菌株的特征序列在檢測植物乳桿菌ST-III菌株中的應用。
[0023] 發明作用與效果
[0024] 本發明所提供的特異性檢測植物乳桿菌ST-III菌株的引物及其檢測方法和試劑 盒，具有如下優點：
[0025] 1.檢測速度快、特異性高
[0026] 與傳統的微生物的生化培養鑒定技術的整個鑒定周期需要5-7天相比，本發明所 提供的檢測方法只需要3-4個小時，檢測速度明顯變快。本發明所設計的引物對根據編碼 植物乳桿菌ST-IIIKdpA蛋白質基因的特異性標記片段設計，該引物可以在編碼植物乳桿 菌ST-III菌株中擴增出相應的DNA片段，并且只特異性的擴增植物乳桿菌ST-III的基因， 而不能在其他乳桿菌中擴增出相應片段，包括NCBI已報道的經過全基因組（含質粒）測序 的乳桿菌菌株，說明以該基因片段為基礎設計的PCR反應系統具有良好的特異性。
[0027] 2.靈敏度高、成本低
[0028] PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克級的起始待測模板擴增到微克 水平，因此靈敏度高。而且本發明中的模板為多拷貝的質粒（約10個拷貝），因此與一般的 以基因組為模板的PCR方法相比，本發明中的方法能再提高一個數量級的靈敏度，因此本 發明中的方法靈敏度更高。此外，與通過全基因組序列測序區分同類細菌間不同菌株的方 法相比，費用大為降低、實驗周期也大為縮短，可以很方便地投入實際應用。
【具體實施方式】
[0029] 以下說明本發明的【具體實施方式】
[0030] 實施例1酸奶中植物乳桿菌ST-III的檢測
[0031] 取IOml酸奶，8000g離心lOmin，棄上清，取沉淀。以去離子水洗沉淀2次，用質粒 提取試劑盒（SanPrep柱式質粒DNA抽提試劑盒，購自生工生物工程有限公司）提取菌體的 質粒DNA。然后以所提取DNA為模板進行PCR反應。
[0032] PCR反應體系為：0. 5mmol/L的上游引物，0. 5mmol/L的下游引物，0. 2mmol/L的 dNTP，IXPCR buffer，I. 5mmol/L 的 Mg2+，0· 02U/uL 的 Taq DNA 聚合酶，IuL 的 DNA 模板，加 去例子水至 20ul。PCR 反應程序為：95°C，3min ;將 95°C下 45s，55°C下 45s，72°C下 lmin， 對以上三步進行30個循環；72°C 5min ;4°C保存。
[0033] 最后進行電泳檢測，取5ul PCR產物在I %瓊脂糖凝膠中電泳，電泳電壓為100V， 電泳時間為40min。以DNA分子量標記為對照進行檢測。
[0034] 結果顯示在紫外燈下存在480bp的核酸片段，說明待測樣品中存在植物乳桿菌 ST-IIIo
[0035] 實施例2特異性驗證
[0036] 選擇選擇不同的植物乳桿菌菌株20株，包括5株植物乳桿菌植物亞種，5株不同 來源的植物乳桿菌ST-III，3株植物乳桿菌P8菌株，2株植物乳桿菌299v菌株，1株植物 乳桿菌ATCC8014,1株植物乳桿菌CCFM8610,1株植物乳桿菌CCFM8724,1株植物乳桿菌 CCFM8661，1株植物乳桿菌CW006。其它種乳桿菌50株，包括10株嗜酸乳桿菌，5株動物乳 桿菌，5株短乳桿菌，5株布氏乳桿菌，5株解淀粉乳桿菌，5株卷曲乳桿菌，5株德氏乳桿菌， 5株發酵乳桿菌，5株干酪乳桿菌，利用本發明所提供的引物對進行PCR反應，PCR擴增體系 和程序以及電泳的具體操作參照實施例1。
[0037] 結果顯示在紫外燈下，只有植物乳桿菌ST-III有較亮的480bp電泳條帶，其它菌 株和菌種均沒有480bp電泳條帶。說明設計的PCR引物檢測特異性強，可以準確、方便地將 植物乳桿菌ST-III與其它不同細菌區分開來。
[0038] 本實施方式提供一種植物乳桿菌ST-III菌株的特異性標記分子，此特異性標記 分子是編碼植物乳桿菌ST-III KdpA蛋白質的基因。
[0039] KdpA蛋白質是參與鉀離子轉運的蛋白質之一，編碼植物乳桿菌ST-III菌株KdpA 蛋白質的基因的GenBank Accession No.為LPST_P0009。優選的，的特異性標記分子是編 碼植物乳桿菌ST-IIIKdpA蛋白質的基因。更優選的，特異性標記分子是編碼植物乳桿菌 ST-III KdpA蛋白質基因的第720bp至第1200bp所示序列的核苷酸。特異性標記分子最優 選的其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第720bp至第1200bp所示。
[0040] 上述實施例還提供一種檢測植物乳桿菌ST-III菌株的引物對。該引物對中，一條 引物和植物乳桿菌ST-III菌株的特異性標記分子的前端序列相同，引物長度為15-40bp， 最佳的是23bp ;另一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的特異性分子標記的序列互補，引物 長度15-40bp，最佳的是23bp ;該引物對擴增出的片段長度為200-1773bp.，優選480bp。優 選的，引物對中，一條引物的序列如SEQ ID NO. 2所示，另一條引物的序列如SEQ ID NO. 3 所示。
[0041] 上述實施例所提供的特異性擴增植物乳桿菌ST-III菌株的引物，根據本發明的 特異性標記分子的序列進行設計，并通過常規的DNA合成方法獲得。
[0042] 本實施例還提供一種檢測植物乳桿菌ST-III菌株的試劑盒，該試劑盒包括的引 物對，該試劑盒較佳的還包括dNTP，10XPCR緩沖液和Taq DNA聚合酶。更佳的，試劑盒還包 括陽性對照或者基因抽提試劑。
[0043] 本發明的待測樣品為任何可能含有植物乳桿菌ST-III的物質，較佳的比如牛奶 或乳制品。
[0044] 本發明根據NCBI已報道的乳桿菌的序列，運用blast程序找出植物乳桿菌ST-III 所特有的核苷酸序列kdpA基因，根據這些核苷酸序列設計相應引物。經過對這些引物的篩 選和驗證，得到了能夠用于鑒定植物乳桿菌ST-III的特異性引物。本發明一并提供了使用 該引物的方法和試劑盒。應理解，以上實施例僅用于說明本發明而非用于限定本發明的范 圍。上述實例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件進行。
[0045]
[0046]
【權利要求】
1. 一種植物乳桿菌ST-III菌株的特異性標記分子，其特征在于： 所述特異性標記分子是編碼植物乳桿菌ST-III的KdpA蛋白質的基因，位于植物乳桿 菌ST-III來源的pST-III質粒上。
2. 如權利要求1所述的植物乳桿菌ST-III菌株的特異性標記分子，其特征在于： 所述的特異性標記分子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第720位至第1200位所示。
3. -種檢測植物乳桿菌ST-III菌株的引物對，其特征在于： 該引物對中，一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的特異性標記分子的序列中的一段 相同，長度為15-40bp ;另一條引物和植物乳桿菌ST-III菌株的特異性分子標記的序列中 的一段互補，長度為15-40bp，該引物對擴增出的片段長度為200-1773bp。
4. 如權利要求3所述的檢測植物乳桿菌ST-III菌株的引物對，其特征在于： 所述引物對中，一條引物的序列如SEQ ID NO. 2所示，另一條引物的序列如SEQ ID NO. 3所示。
5. -種檢測植物乳桿菌ST-III菌株的試劑盒，其特征在于： 該試劑盒包括如權利要求3或4所述的引物對。
6. 如權利要求5所述的檢測植物乳桿菌ST-III菌株的試劑盒，其特征在于，還包括： dNTP ;10XPCR緩沖液和Taq DNA聚合酶。
7. -種植物乳桿菌ST-III菌株的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟一，提取待測樣品菌株中的質粒DNA ; 步驟二，以步驟一所得的所述質粒DNA為模板，以權利要求3或4所述的引物對進行 PCR反應； 步驟三，對步驟二所得的PCR反應產物進行電泳檢測，檢測是否存在權利要求3或4所 述的引物擴增出的片段。
8. 如權利要求7所述的植物乳桿菌ST-III菌株的檢測方法，其特征在于： 其中，步驟二中所述的PCR反應的反應體系包括 所述引物對，該引物對中的兩種引物的濃度均為〇. 5mmol/L;0. 2mmol/L的dNTP ; 1 X PCR buffer ; 1. 5mmol/L 的 Mg2+;0. 02U/ y L 的 Taq DNA 聚合酶；以及 1. 0-2. Ong/ y L 的 DNA模板。
9. 如權利要求7所述的植物乳桿菌ST-III菌株的檢測方法，其特征在于： 其中，步驟二中所述的PCR反應的反應程序依次為，95 °C，3min ;95 °C下45s，55 °C下 45s，72°C下 lmin，進行 30 個循環；72°C，5min;4°C保存。
10. 如權利要求1所述的特異性標記分子作為植物乳桿菌ST-III菌株的特征序列在檢 測植物乳桿菌ST-III菌株中的應用。
【文檔編號】C12Q1/04GK104480204SQ201410747460
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月8日 優先權日:2014年12月8日
【發明者】艾連中, 王光強, 夏永軍, 陳衛, 王彥波, 郭本恒, 宋馨 申請人:上海理工大學