一種樟疫霉菌的lamp檢測引物組合物及其lamp檢測試劑盒和lamp檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種樟疫霉菌的LAMP檢測引物組合物及其LAMP檢測試劑盒和LAMP檢測方法。該LAMP檢測引物組合物由正向內引物FIP、反向內引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向環引物LF和反向環引物LB組成。本發明的檢測方法準確性高、特異性強、操作方便、實用性好、實現了恒溫擴增，同時還為樟疫霉菌的檢測提供了新的技術平臺，可用于樟疫霉菌的高靈敏度快速檢測，同時在病害侵染初期鑒定出病原物，能夠對田間土壤中的樟疫霉菌進行檢測。本發明對樟疫霉菌引起的疫病防治和對減少農藥盲目使用，降低生產成本，減少農藥的環境污染也具有重要意義。
【專利說明】-種樟疫霉菌的LAMP檢測引物組合物及其LAMP檢測試劑 盒和LAMP檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及樟疫霉菌的LAMP檢測引物組合物及其LAMP 檢測試劑盒和LAMP檢測方法。
【背景技術】
[0002] 樟疫霉菌（Phytophthora cinnamomi)屬于卵菌門（Oomycota)、卵菌綱 (Oomycetes)、霜霉目（Peronosporales)、腐霉科（Pythiaceae)、疫霉屬（Phytophthora)。 樟疫霉可侵染樟屬植物引起根部腐爛以及枝干潰瘍等病害，會對樟屬植物造成毀滅性打 擊。樟疫霉菌寄主廣泛，可以侵染上千種植物。據報道，樟疫霉已經造成澳大利亞西南地區 森林發生結構和植物種群變化，已經嚴重威脅到當地自然生態系統以及生物多樣性。目前 對該病害還沒有有效的防治措施，加強檢疫，防止病原菌的傳播擴散是控制該病的最有效 措施。為此應加強疫情監測，建立快速檢測方法，為病害的風險及研究決策提供依據，從而 有利于降低樟樹疫病引起的損失。
[0003] 傳統的樟疫霉菌的分類鑒定主要是基于形態學特征、致病性測定、生理生化特征 等。傳統的分離疫霉菌的方法采用誘捕法從土壤、灌溉水和植物材料中分離疫霉菌。為了 提高誘捕效果，可在土壤溶液中加入少量抗生素和殺菌劑抑制雜菌生長。適用于做誘餌的 植物材料因不同疫霉菌也有所不同，松針適合用于誘捕樟疫霉菌。傳統方法在樟疫霉菌檢 測中發揮了重要作用，但是費時費力而且要求操作者具備專業的疫霉菌分離、形態學鑒定 知識和豐富的經驗；同時傳統分類鑒定方法耗時長、靈敏度低、易受人為及環境等諸多因素 的干擾，不能在病害潛伏期和發病初期做出診斷，很難對病害發生進行及時的監測和有效 控制。隨著分子生物學的發展，PCR技術為植物病原診斷提供了快速、靈敏、準確的優勢。普 通PCR的方法已經成功用于檢測樟疫霉菌，雖然PCR法在特異性和敏感性上有較大的提高， 但是檢測時間仍然比較長，大概4?5h，同時PCR法依賴精密的溫度循環裝置，其檢測靈敏 度比較高、檢測過程復雜，不能滿足快速檢測的需求。
[0004] 環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種 新的核酸擴增技術，因其操作簡單、快速、特異性高、成本低等優點，成為可以替代PCR的新 的核酸擴增技術。它是針對靶基因的6個區域設計4種特異的引物，在Bst大片段聚合酶 的作用下引起自循環鏈置換反應，60?65°C范圍80min內，大量合成目標DNA的同時伴隨 有副產物一白色的焦磷酸鎂沉淀產生。由于LAMP擴增過程依賴識別靶序列6個獨立區 域，所以反應特異性很強，并且核酸擴增過程是在恒溫條件下進行，普通水浴鍋或有穩定熱 源的設備就能滿足反應要求，檢測成本大大降低。由于LAMP反應簡單、快速、高效、經濟等 特征，因而具有極為廣泛的應用前景。自LAMP檢測技術建立14年以來，該技術已經廣泛應 用于對病毒、細菌、寄生蟲、真菌等病原菌的檢測研究，但在植物病原卵菌的檢測報道很少， 樟疫霉菌的檢測國內外均未見報道。
【發明內容】
[0005] 發明目的：針對現有技術中樟疫霉菌生物學檢測方法所需周期長、檢測方法特異 性差、靈敏度低的問題，本發明的目的是提供一種樟疫霉菌的LAMP檢測引物組合物。本發 明的另一目的是提供上述樟疫霉菌的LAMP檢測試劑盒。本發明另一目的是提供上述樟疫 霉菌的LAMP檢測方法。
[0006] 技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：
[0007] -種用于檢測樟疫霉菌的LAMP檢測引物組合物：由正向內引物FIP、反向內引物 BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向環引物LF和反向環引物LB組成；各引物序列具體 如下：
[0008] FIPji -CAGTCAGCTCCACGAAC-AGCTCCAGATTGTACGTCCTTCGC-3，；
[0009] BIPji -AGGAGCGTTTCCGCACGATC-CGTGACGTCGTACACCAC-3，；
[0010] F3:5，-ACGGCAAGACCATCAAGC-3，；
[0011] B3 :5' -ACGTTGTTGAACGACTCCTG-3';
[0012] LF:5，-TCCAACAGGCGAATAGGACC-3，；
[0013] LB:5' -ACTAGCAGCTACTACCGCG-S'。
[0014] 所述的LAMP檢測引物組合物在檢測樟疫霉菌中的應用。
[0015] 一種檢測樟疫霉菌的LAMP檢測試劑盒：包含ImL檢測溶液，所述的檢測溶液包括： 32mM正向內引物FIP、32mM反向內引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM正 向環引物LF、8mM環引物LB、48mM dNTPs、0.8M Tris-HC、0.4mM KCl、0.4mM(NH4)2S04、0.24mM MgS0 4、4% Triton X-100、Bst DNA polymerase 320 單位，200mM 羥基萘酚藍；其中，各引物 序列具體如下：
[0016] FIPji -CAGTCAGCTCCACGAAC-AGCTCCAGATTGTACGTCCTTCGC-3，；
[0017] BIPji -AGGAGCGTTTCCGCACGATC-CGTGACGTCGTACACCAC-3，；
[0018] F3:5，-ACGGCAAGACCATCAAGC-3，；
[0019] BS=Si -ACGTTGTTGAACGACTCCTG-3;；
[0020] LF:5，-TCCAACAGGCGAATAGGACC-3，；
[0021] LB:5' -ACTAGCAGCTACTACCGCG-S'。
[0022] 所述的檢測樟疫霉菌的LAMP試劑盒在檢測樟疫霉菌中的應用。
[0023] -種檢測樟疫霉菌的LAMP檢測方法：包括提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA 為模板，利用LAMP檢測引物組合物或LAMP檢測試劑盒進行LAMP ;擴增產物觀察LAMP反應 溶液顏色變化，天藍色表示陽性結果，存在樟疫霉菌；紫色表示檢測結果為陰性，不存在樟 疫霉菌。
[0024] 所述的檢測樟疫霉菌的LAMP檢測方法：提取待檢微生物的DNA，取1 μ L DNA溶液， 加入23 μ L LAMP試劑盒中的檢測溶液和1 μ L滅菌去離子水進行LAMP，LAMP反應程序為： 60°C?65°C,60 ?80min。
[0025] 本發明的檢測樟疫霉菌的方法，包括提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA為模 板，利用所述的LAMP引物組合物進行LAMP ;輕基萘酚藍（hydroxylnaphthol blue，HNB)屬 于金屬離子指示劑的一種。HNB是Mg2+的滴定劑，其顏色隨溶液PH變化而改變，因此可以 通過監測LAMP反應體系中Mg 2+濃度的變化及溶液PH而起到顏色指示劑的作用。反應前 將HNB加入到反應液中，反應體系呈紫色，反應過程中Mg2+與LAMP反應的副產物P2O廣結合 產生大量沉淀，溶液中Mg2+濃度降低，pH發生變化，從而使HNB的顏色由紫色變為天藍色。 因此，反應結束后通過反應體系的顏色變化，來判斷樟疫霉菌的有無：天藍色表示檢測為陽 性，存在樟疫霉菌；紫色表示檢測結果為陰性，不存在樟疫霉菌。
[0026] 本發明的關鍵性技術之一是樟疫霉菌的高效特異擴增的引物序列及其擴增方法。 為了驗證樟疫霉菌的特異性引物序列，本發明以10株樟疫霉菌菌株和14種其它卵菌以及 17種病原真菌為供試材料（表1)，采用CTAB法提取發病組織中樟疫霉菌的DNA。具體方法 如下：取少量菌絲粉，加900 μ L 2% CTAB提取液和90 μ L 10% SDS，漩渦混勻，于55°C水浴 lh，中間每IOmin上下顛倒幾次。12000rpm離心lOmin，取上清加等體積酚/氯仿/異戊醇 (25 :24 :1)，顛倒混勻，12000rpm離心IOmin ;將上清轉移至新管，加等體積氯仿，輕輕顛倒 混勻，12000rpm離心5min。上清轉移至新管中，加2倍體積的無水乙醇和1/10體積的3M 似八(：(?!15.2)，-201：沉淀（>111)。12000印111離心101^11，傾去上清，沉淀用70%乙醇洗滌兩 次，室溫晾干。加適量滅菌超純水或TE (pH 8.0)溶解沉淀（含20 μ g/mL RNase)，37°C處理 Ih后，-20°C保存備用。所有的土壤樣品采用FastDNAK SPIN試劑盒（Q-Biogene Ltd，USA) 進行DNA的提取。土壤DNA提取步驟參見試劑盒說明書。這一商用土壤微生物DNA提取試 劑盒可以在〇. 5h內提取到土壤中的微生物。
[0027] 表1用于檢測樟疫霉菌特異性的真菌和卵菌菌株
[0028]
[0029]
【權利要求】
1. 一種用于檢測樟疫霉菌的LAMP引物組合物，其特征在于：由正向內引物FIP、反向內 引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向環引物LF和反向環引物LB組成；各引物序 列具體如下： FIP^' - CAGTCAGCTCCACGAAC-AGCTCCAGATTGTACGTCCTTCGC -3'； BIP^' - AGGAGCGTTTCCGCACGATC-CGTGACGTCGTACACCAC -3'； F3:5， -ACGGCAAGACCATCAAGC-3，； B3:5' -ACGTTGTTGAACGACTCCTG-3'; LF# -TCCAACAGGCGAATAGGACC-3，； LB:5' - ACTAGCAGCTACTACCGCG -3'。
2. 權利要求1所述的LAMP引物組合物在檢測樟疫霉菌中的應用。
3. -種檢測樟疫霉菌的LAMP試劑盒，其特征在于：包含lmL檢測溶液，所述的檢測溶 液包括：32mM正向內引物FIP、32mM反向內引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物 B3、8mM 正向環引物 LF、8mM 環引物 LB、48mM dNTPs、0.8M Tris-HC、0.4mM KCl、0.4mM (NH4)2S04、0.24mM MgS04、4%Triton X-100、Bst DNA polymerase 320 單位，200mM羥基萘酚藍；其 中，各引物序列具體如下： FIP^' - CAGTCAGCTCCACGAAC-AGCTCCAGATTGTACGTCCTTCGC -3'； BIP^' - AGGAGCGTTTCCGCACGATC-CGTGACGTCGTACACCAC -3'； F3:5， -ACGGCAAGACCATCAAGC-3，； B3:5' -ACGTTGTTGAACGACTCCTG-3'; LF# -TCCAACAGGCGAATAGGACC-3，； LB:5' - ACTAGCAGCTACTACCGCG -3'。
4. 權利要求3所述的檢測樟疫霉菌的LAMP試劑盒在檢測樟疫霉菌中的應用。
5. -種檢測樟疫霉菌的方法，其特征在于：包括提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA 為模板，利用LAMP引物組合物或LAMP試劑盒進行LAMP ;觀察LAMP反應溶液顏色變化，天 藍色表示檢測為陽性，存在樟疫霉菌；紫色表示檢測結果為陰性，不存在樟疫霉菌。
6. 根據權利要求5所述的檢測樟疫霉菌的方法，其特征在于：提取待檢微生物的DNA， 取2 ii L DNA溶液，加入23 ii L LAMP試劑盒中的檢測溶液進行LAMP，LAMP反應程序為： 60°C?65°C，60-80 min，擴增產物進行顏色變化的觀察。
【文檔編號】C12Q1/68GK104372104SQ201410742299
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年12月8日 優先權日:2014年12月8日
【發明者】戴婷婷, 葉建仁, 吳小芹, 李明杰, 付歡 申請人:南京林業大學