一組pcr鑒別引物及以其鑒別白及、黃花白及的方法
【專利摘要】本發明公開了一組PCR鑒別引物，該組引物由三條引物組成，其核苷酸序列分別如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本發明還提供以前述引物組鑒別白及、黃花白及的方法，包括如下步驟：1)提取待鑒定樣品的基因組DNA；2)以步驟1)提取的基因組DNA為模板，使用前述引物組對其進行PCR擴增；3)對步驟2)的PCR擴增產物進行電泳檢測。在354bp處檢測出條帶的待鑒定樣品鑒定為白及，在519bp處檢測出條帶的待鑒定樣品鑒定為黃花白及，在354bp和519bp處均未檢測出條帶的待鑒定樣品鑒定為其他植物材料。本發明提供的方法能快速、準確鑒定白及的原植物、飲片藥材和粉末藥材，又能同步鑒別黃花白及的原植物、飲片藥材和粉末藥材，并能實現與其他植物的鑒別。
【專利說明】-組PCR鑒別引物及以其鑒別白及、黃花白及的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子標記【技術領域】，特別是涉及一組PCR鑒別引物及以其鑒別白及、 黃花白及的方法。
【背景技術】
[0002] 中藥白及具有收斂止血、消腫生肌的功效，可用于咳血吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、 皮膚皸裂的治療。歷版中國藥典收載均為蘭科白及屬植物白及Bletilla striata Rchb. f.，同時，白及作為珍稀瀕危植物，野生資源匱乏，而栽培資源尚難以滿足市場需求，使藥 材價格逐年上漲。但由于該物種的分布具有地域性，一些地區性的中藥材標準以黃花白及 B.ochracea Schltr.植物作為白及的替代藥用品種（《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》 (2003年版），《四川省中藥材標準》（2010年版）），但作為地區性品種其資源使用受到一定 局限。發明人在對白及藥材市場進行實地走訪和調查發現，以黃花白及的塊莖冠以正品白 及藥材出售的現象極為普遍，而且以同屬、同科植物塊莖作為白及藥材混淆使用的現象也 屢見不鮮。
[0003] 由于白及和黃花白及在非花期植物形態很難準確分辨，而且這2種物種的塊莖在 表觀性狀、組織構造、理化成分上也極為相似，當塊莖被加工為飲片、粉末時鑒別難度就更 大，既便是有豐富鑒定學知識和鑒別經驗者也會籌措難定。白及B. striata Rchb. f.是國家 藥典明確規定的中藥白及品種，黃花白及的經濟、藥用價值與白及尚有一定差距。目前，運 用DNA分子標記技術對白及屬植物進行鑒定上，有學者運用過SCAR分子標記方法對黃花白 及 B. ochracea Schltr.與白及 B. striata Rchb. f.、小白及 B. formosana Schltr.和云南 獨蒜蘭（又名獨葉白藍）Pleione yunnnanensis(Rolfe)Rolfe進行鑒定區別（趙爽，黃春 球，楊耀文，等.黃花白及的SCAR分子標記轉化研究.中草藥，2012,43 (10): 2036-2039)， 也有學者采用SRAP標記技術，擬探索建立一個分析白及物種遺傳多樣性的實驗體系（蔣 瑞彬，徐旭棟，藍小明，等.野生白及SRAP-PCR反應體系的優化，中華中醫藥學刊，2013， 31 (2) :353-355)，但以白及B. striata Rchb. f.為研究對象，將之與黃花白及和其他植物進 行鑒別的分子標記鑒定技術的報道尚未見到。本發明提供的一組PCR鑒別引物及以之鑒 別白及、黃花白及的方法，只需在一個擴增體系內進行PCR擴增反應，即能快速、準確鑒定 白及的原植物、飲片藥材和粉末藥材，又能同步鑒別黃花白及的原植物、飲片藥材和粉末藥 材，并能實現白及和黃花白及與其他植物的鑒別。在提交本發明申請之前，尚無任何公開 或報道過本專利申請中所提及的PCR鑒別引物組及同步鑒別白及、黃花白及的分子鑒定方 法。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的之一在于提供一組PCR鑒別引物。
[0005] 本發明的另外一個目的在于提供上述鑒別引物組在白及、黃花白及鑒定中的應 用。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：一組PCR鑒別引物，其核苷酸 序列分別如序列表中SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。
[0007] 前述的PCR鑒別引物組在白及、黃花白及鑒別中的應用。
[0008] 包括前述引物的試劑盒。
[0009] -組PCR鑒別引物及以其鑒別白及、黃花白及的方法，包括如下步驟：1)提取待鑒 定樣品的基因組DNA ;2)以步驟1)提取的基因組DNA為模板，使用前述引物組對其進行PCR 擴增；3)對步驟2)的PCR擴增產物進行電泳檢測。在354bp處檢測出條帶的待鑒定樣品 鑒定為白及，在519bp處檢測出條帶的待鑒定樣品鑒定為黃花白及，在354bp和519bp處均 未檢測出條帶的待鑒定樣品鑒定為其他植物材料。
[0010] 具體的說，所述的一組PCR鑒別引物及以其鑒別白及、黃花白及的方法，優選的， 所述的PCR擴增反應體系為25 μ L，包括Taq酶PCR預混液6?8 μ L，SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 各 2 ?5pmol，模板 DNA 20 ?160ng，CldH2O 補足 25 μ L。所述的 PCR 反 應程序為95°C預變性1?5min，25?40個循環（95°C變性1?20s、52?68°C退火延伸 1 ?30s)。
[0011] 更優選的，所述的PCR反應體系為25 μ L，包括Taq酶PCR預混液7 μ L，SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 各 4pmol，模板 DNA 40ng，CldH2O 補足 25 μ L。所述的 PCR 反應程序為95°C預變性lmin，30個循環（95°C變性2s、66°C退火延伸5s)。
[0012] 一組PCR鑒別引物及以其鑒別白及、黃花白及的方法，所述的步驟3)，其特征在于 對步驟2)的PCR擴增產物進行電泳檢測，在354bp處檢測出條帶的待鑒定樣品鑒定為白 及，在519bp處檢測出條帶的待鑒定樣品鑒定為黃花白及，在354bp和519bp處均未檢測出 條帶的待鑒定樣品鑒定為其他植物材料。
[0013] 發明人進行了一系列實驗，以優選本發明提供的一組PCR鑒別引物及以其鑒別白 及、黃花白及的方法的PCR擴增條件等，證明本發明鑒定方法的有效性。具體技術方案如 下：
[0014] 一、引物設計
[0015] 在 NCBI (National Center for Biotechnology Information，NCBI，美國國立生 物技術信息中心）下載到白及與其近緣物種的核糖體基因序列和葉綠體基因序列，共246 條。另選用通用引物對白及與其近緣物種進行擴增并測序，成功獲取50條rDNA-ITS序列 和15條psbA-trnH序列。運用ClustalX 2. 1軟件對以上序列進行排序、比對、分析，找出白 及、黃花白及的特異性位點，針對此位點設計一組特異性鑒別白及和黃花白及的PCR引物， 該組引物由3條引物組成，其核酸序列分別如下：
[0016] SEQ ID NO. 1 :5'一GCCCAGAACAGCCATCCAAGT-3'
[0017] SEQ ID NO. 2 :5'一TTGGCACGGAGCGACACG-3'
[0018] SEQ ID NO. 3 :5，一GCCGAGCAAGAAACAACGC-3，
[0019] 二、PCR擴增條件優選
[0020] 根據前述的鑒別引物組和擴增產物的Tm值、長度設置PCR擴增反應體系與擴增程 序，以白及、黃花白及和其近緣種（小白及、華白及）的基因組DNA為模板進行PCR擴增。其 具體如下：
[0021] PCR 的反應體系為 25 μ L，包括Taq酶PCR預混液8 μ L，SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 3 各 3pmol，模板 DNA 20ng，ddH20 補足 25 μ L。
[0022] 所述的PCR反應程序為95°C預變性lmin，35個循環（95°C變性20s，62°C退火延伸 30s)。
[0023] a.前述的一組PCR鑒別引物及以其鑒別白及、黃花白及方法的PCR擴增程序優選 如下：
[0024] i退火延伸溫度：考察了 48°〇、521：、561：、601：、641：、681：的退火延伸溫度。結 果顯示，52°C?68°C白及和黃花白及的擴增產物分別在354bp、519bp擴增出目的條帶， 條帶亮度隨溫度的升高而增強，近緣種均未檢測出條帶。為保證退火延伸的有效進行，本 發明選擇退火延伸溫度為66°C。圖1為退火延伸溫度優選的電泳檢測圖譜（M :D2000DNA Marker ;1?4 :白及、黃花白及、小白及、華白及）。
[0025] ii退火延伸時間：基于上述退火延伸溫度的特征，考察ls、2s、5s、10s、20s、30s的 退火延伸時間。結果顯示，各退火延伸時間下，白及、黃花白及均能有效擴增，條帶亮度隨著 時間的延長而增強，5s?30s條帶亮度無明顯差異。為節約時間，本發明優選退火延伸時間 為5s。圖2為退火延伸時間優選的電泳檢測圖譜（M :D2000DNA Marker ;1?4 :白及、黃花 白及、小白及、華白及）。
[0026] iii變性時間：基于上述ii，考察變性時間為lS、2S、5 S、l〇S、15s、2〇S。結果顯示， 各變性時間下，白及、黃花白及均能有效擴增，尤其是2s?IOs時條帶亮度最強。為節約 擴增時間，本發明選擇變性時間為2s。圖3為變性時間優選的電泳檢測圖譜（M :D2000DNA Marker ;1?4 :白及、黃花白及、小白及、華白及）。
[0027] iv變性-退火延伸的循環次數（η):根據上述iii的特征，考察25、28、30、32、35、40 次變性-退火延伸循環次數對PCR擴增的影響。結果顯示，各個循環次數條件下，白及、黃花 白及樣品均能擴增，目的條帶明亮清晰，尤其是在30次循環時的電泳條帶亮度最均一。因 此，本發明優選變性-退火延伸的循環次數為30次。圖4為變性-退火延伸循環次數優選 的電泳檢測圖譜（M:D2000DNA Marker ;1?4:白及、黃花白及、小白及、華白及）。
[0028] V基于上述iv，一組PCR鑒別引物及以其鑒別白及、黃花白及的方法PCR擴增程序 最終優選為：
[0029]
【權利要求】
1. 一組PCR鑒別引物，其核苷酸序列為： SEQ ID NO. 1 ：5'-GCCCAGAACAGCCATCCAAGT-3' SEQ ID NO. 2 ：5'-TTGGCACGGAGCGACACG-3' SEQ ID N0.3:5，一GCCGAGCAAGAAACAACGC-3，
2. 以權利要求1所述PCR引物組鑒別白及、黃花白及的方法，包括如下步驟： 1) 提取待鑒定樣品的基因組DNA ; 2) 以步驟1)提取的基因組DNA為模板，使用前述的鑒別引物組對其進行擴增； 3) 對步驟2)的PCR擴增產物進行電泳檢測。
3. 根據權利要求2所述鑒別白及、黃花白及的方法，其特征在于，步驟2)所述的PCR 反應體系為 25 ii L，包括 Taq 酶 PCR 預混液 6 ?8 ii L，SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3各2pmol?5pmol，模板DNA20ng?160ng，ddH20補足25 y L。所述的PCR反應程序為 95°C預變性lmin?5min，25?40個循環（95°C變性Is?20s、52°C?68°C退火延伸Is? 30s)。
4. 根據權利要求3所述鑒別白及、黃花白及的方法，其特征在于，所述的PCR反應體系 為 25iiL，包括 Taq 酶 PCR 預混液 7iiL，SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 各 4pmol， 模板DNA 40ng，ddH20補足25ii L。所述的PCR反應程序為95°C預變性lmin，30個循環（95°C 變性2s、66°C退火延伸5s)。
5. 根據權利要求2所述鑒別白及、黃花白及的方法，其特征在于，步驟3)對步驟2)的 PCR擴增產物進行電泳檢測，在354bp處檢測出條帶的待鑒定樣品鑒定為白及，在519bp處 檢測出條帶的待鑒定樣品鑒定為黃花白及，在354bp和519bp處均未檢測出條帶的待鑒定 樣品鑒定為其他植物材料。
6. 權利要求2?5任一項所述PCR擴增方法在白及、黃花白及鑒別中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK104388569SQ201410733438
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月4日 優先權日:2014年12月4日
【發明者】周濤, 趙丹, 黃璐琦, 袁媛, 肖承鴻, 江維克 申請人:貴陽中醫學院, 中國中醫科學院中藥研究所