一種酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B及其基因和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種新穎的嗜熱真菌Talaromyces leycettanus來源的酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B及其基因和應用。本發明提供了一種新的酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本發明還提供了編碼上述酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或5所示，以及包含該基因的重組載體和重組菌株及其應用。本發明的酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B最適pH為4.5，最適溫度為65℃；在60℃處理1h基本不失活，具有很好的熱穩定性；在pH 3-9條件下處理1h能夠保留90％以上的活性，具有很好的pH耐受性。該酶優越的穩定性使其在能源、食品和飼料方面具有很好的應用潛力。
【專利說明】一種酸性β-葡萄糖苷酶Bgl 3B及其基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種酸性葡萄糖苷酶Bgl3B及 其基因和應用。
【背景技術】
[0002] 纖維素是多個葡萄糖殘基以β-1，4-糖苷鍵連接而成的多聚物，其基本重復單 位為纖維二糖。纖維素的利用與轉化對于解決世界能源危機、糧食短缺、環境污染等問 題具有重要意義。纖維素可通過纖維素酶的作用降解為葡萄糖，后者可作為重要的工 業原料來生產酒精、丙酮等化工產品。纖維素酶是能將纖維素降解為葡萄糖的三類酶的 總稱，即內切β-1，4-葡聚糖酶（ end〇-f3-l，4-glucanaSe，EC 3.2. 1.4)、外切葡聚糖酶 (exoglucanase，又稱纖維二糖水解酶 cellobiohydrolase，EC 3. 2. 1.91)和 β-葡萄糖昔 酶（β -glucosidase，EC 3. 2. 1. 21)。這三種酶協同作用能夠將纖維素轉化成葡萄糖。
[0003] β-葡萄糖苷酶的分布較為廣泛，特別是植物的種子和微生物中尤為普遍。對微生 物中的β-葡萄糖苷酶的研宄主要在絲狀真菌、酵母、細菌、鏈霉菌等。β-葡萄糖苷酶在生 物技術應用和生物轉化方面也有很重要的應用，在纖維素水解為還原糖的過程中，依靠內 切纖維素酶、外切纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的協同作用，然而β-葡萄糖苷酶最終把纖維 二糖解離成單個的葡萄糖分子，是整個纖維素降解過程的限速步驟，β-葡萄糖苷酶活力 較低就會造成纖維二糖的大量積累，積累的纖維二糖對纖維素內切和外切酶有很強烈的抑 制作用，所以β-葡萄糖苷酶其性質和酶活力的高低在纖維素水解的過程中決定著總體酶 活力。
[0004] 已經報道的β -葡萄糖苷酶pi大多在酸性范圍內，最適的pH值一般在3. 5? 5. 5之間，以pH 4. 5居多。很多的生物應用過程中均需要在酸性環境中進行，比如酸處理 后的汽爆秸桿粉，紡織和造紙工業以及工農業廢料和殘留物的處理等，對反應環境的要求 很高，需要在耐酸和高溫條件下進行反應。本發明的酸性β-葡萄糖苷酶來源于藍狀菌 (Talaromyces leycettanus JCM12802)，可適應復雜的反應環境，具有較好的應用潛力。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種可用于能源、食品和飼料用途的酸性β -葡萄糖苷酶。
[0006] 本發明的再一目的是提供編碼上述β -葡萄糖苷酶的基因。
[0007] 本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
[0008] 本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0009] 本發明的另一目的是提供一種制備上述β -葡萄糖苷酶的基因工程方法。
[0010] 本發明的另一目的提供上述β-葡萄糖苷酶的應用。
[0011] 本發明從嗜熱真菌藍狀菌（Talaromyces leycettanus)中分離得到一種新的酸性 β -葡萄糖苷酶Bgl3B，并構建了能夠高效表達此β -葡萄糖苷酶的重組酵母菌株。
[0012] 本發明提供了一種酸性β -葡萄糖苷酶Bgl3B，其氨基堿序列如SEQ ID NO. 1所 不ο
[0013] SEQ ID NO. I ：
[0014] MRLGWLEVAALAVATVADAKDLAYCPPFYPSPWADGNGEWAEAHSRAVEFV SGLTLAEKVNLTTGVGff MGETCVGNTGSIPRLGFWGFCAQDSPLGVRDTDYNSA FPAGVNVAATWDKNLAYLRGRAMGEEHRDKGVDVQLGPV AGPLGRAPEGGRNW EGFGPDPVLTGQLMAETIKGIQDVGVIACAKHFILNEQEHFRQVGEAQGYGYNIT QAISSN IDDKTLHELYLWPFADAVRAGVGSVMCSYNQINNSYGCSNSYTMNKLLK GELNFQGFIMSDffQAHKSGVGDALAGL DMSMP⑶TTFNTGESYWGTNLTIAVLN GTIPEWRIDDMAVRMSAFYKVGRDHVRTPPNFSSWTTDEYGYEHAAVN QGYTK VNDRVDVRSNHKDIIRQVGSSSVVLLKNQWGALPLTGKEKLVGMGEDAGSNAY GVNGCSDRGCDNGTLA MGWGSGTANFPYLITPEQAIQWEVIESGGEVFAITDNGA LDQMASVASQASVSLVFVNADSGEGYINVDGNE⑶RK NLTLffKNGDEVIKTVAA NCNNTIVVMHTVGPVLVTEWYDNPNITAILWAGLPGEQSGNSLVDVLYGRVNPGG KTP FTWGKSFDSWGSHVMTTPNNGNDAPQLDFSEGVFIDYRWFDKNNETPIYEFG YGLSYTTFKYSNLQVTPLNAPKYT PASGKTDPAPSFGQPGSASQYVFPRTLNRIYE YIYPWLNSTNLRESS⑶PDYGMKASAYIPAGATDGSAQELLPAS GAPGGNPGLYD ELFRVSATITNTGKVAGDEVPQLYVSLGGPNDPKVVLRNFDRINIAPGQSVEWTTT LTRRDLSN WDVAAQDWVISKYPKTVYVGSSSRKLPLQATLPQVN
[0015] 其中，該酶包括860個氨基酸，N端19個氨基酸為其信號肽序列 ^mrlgwlevaalavatvada(SEQ ID NO. 3) 〇
[0016] 因此，成熟的酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B的理論分子量為91. 33kDa，其氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 2 所示：
[0017] KDLAYCPPFYPSPWADGNGEWAEAHSRAVEFVSGLTLAEKVNLTTGVGWMG ETCVGNTGSIPRLGFff GFCAQDSPLGVRDTDYNSAFPAGVNVAATWDKNLAYLR GRAMGEEHRDKGVDVQLGPVAGPLGRAPEGGRNWEGF GPDPVLTGQLMAETIK GIQDVGVIACAKHFILNEQEHFRQVGEAQGYGYNITQAISSNIDDKTLHELYLWPF AD AVRAGVGSVMCSYNQINNSYGCSNSYTMNKLLKGELNFQGFmSDWQAHKS GVGDALAGLDMSMP⑶TTFNTGESY WGTNLTIAVLNGTIPEWRIDDMAVRIMSAF YKVGRDHVRTPPNFSSWTTDEYGYEHAAVNQGYTKVNDRVDVRSN HKDIIRQVG SSSVVLLKNQWGALPLTGKEKLVGMGEDAGSNAYGVNGCSDRGCDNGTLAMG WGSGTANFPYLI TPEQAIQWEVIESGGEVFAITDNGALDQMASVASQASVSLVFVN ADSGEGYINVDGNE⑶RKNLTLWKNGDEVIK TVAANCNNTIVVMHTVGPVLVTE WYDNPNITAILWAGLPGEQSGNSLVDVLYGRVNPGGKTPFTWGKSFDSffGSH VM TTPNNGNDAPQLDFSEGVFIDYRWFDKNNETPIYEFGYGLSYTTFKYSNLQVTPLN APKYTPASGKTDPAPSF GQPGSASQYVFPRTLNRIYEYIYPWLNSTNLRESS⑶PDY GMKASAYIPAGATDGSAQELLPASGAPGGNPGLYDL· LFRVSATITNTGKVA⑶EVP QLYVSLGGPNDPKWLRNFDRINIAPGQSVEWTTTLTRRDLSNWDVAAQDWVISK YPKTVYVGSSSRKLPLQATLPQVN
[0018] 本發明篩選到Talaromyces leycettanus JCM12802所產生的一種第3家族β-葡 萄糖苷酶，其最適pH為4. 5,最適溫度為65°C ;在60°C處理Ih基本不失活，具有很好的熱 穩定性；在PH 3-9條件下處理Ih能夠保留90%以上的活性，具有很好的pH穩定性。
[0019] 本發明提供了編碼上述酸性葡萄糖苷酶基因 bgl3B。具體地，該基因的基因組 序列如SEQ ID NO. 4所示：
[0020] atgaggcttgggtggcttgaggtggccgcacttgcggttgccaccgttgctgatgccaaggacctggct tattgtcccccat tctacccgtcaccatgggcagacggcaatggagagtgggcgggggctcacagtcgtgccgtg gaatttgtgtcaggcctcacgc ttgctgagaaggtcaatctcacgactggtgttgggtaggtcgactgtgattcct ccatttccaagggcaaaccgttgttttcatgagcc attttttactgatatcacatagttggatgggagaaacgtgt gtcggtaataccggtagcattcccagactcggattttggggattttgcg cccaagattctccccttggtgttcgag acagtaaggctcttccttgagttgtctgctttcttcactgtcttttattgacattcctcctccagc tgattacaat tccgctttccccgcgggtgtcaatgttgccgctacctgggacaagaaccttgcctacctccggggtagagccatgg gtgaagaacacccaaacaaaagcgcggacgtccaaacccgcccaggaccgggcaatcgaggcaggacaccagaaagg gga agaaacagggagggcttagggcctgaccctgtcttgaccggtcaattgatggcggagaccatcaagggtattc aggatgtcggt gttattgcctgtgcaaagcatgacagcccaaacgagcacgaacaccatcgccaggttggggaggc tcaaggctatggctacaat attacgcaagccattagctccaacattgacgacaagacccttcacgaattgtacctg tggccctttgcggatgccgtgcgtgctggc gtgggctcggtgatgtgctcttacaaccagatcaacaacagttacg gatgctcgaacagctacacgatgaacaagctgctcaaag gtgaactcaactttcagggcttcatcatgagcgactg gcaggcgcataaaagtggtgttggcgacgccttggctggtctggacatg gccatgccgggtgacactaccttcaac accggagagtcctactggggcaccaacctgactattgccgtcttgaacggcaccatcc ctgagtggcgtattgacg acatggccgtccgcatcatgtcggctttctacaaggtcggccgtgaccgtgtccgcactcctccaaac ttcagctc atggaccaccgacgaatatggctacgagcatgctgctgtcaaccagggctatacgaaggtcaacgacagagttgatg tgcgctctaaccataaagatattattcgccaggttggctcttccagcgtcgtccttttgaaaaaccagtggggagca cttcccttgact ggcaaggagaagcttgttggtatcatgggtgaagacgcaggatccaatgcttatggcgttaatg gctgcagtgaccgcggctgcg acaacggcactttggccatgggctggggcagtggcaccgcaaacttcccttacct catcactcccgagcaggccatccaatggg aagtcatcgagagcgggggtgaggtcttcgcgatcaccgacaacggg gcccttgaccagatggcgtctgttgcatctcaggcta gcgtgtcccttgtgttcgtgaacgccgactctggagaag gttacatcaatgtcgatggcaatgagggagatcgtaagaacctcact ctctggaagaacggagatgaggttatcaa gactgtcgcggccaactgcaacaacaccattgtggtgatgcataccgccggacct gttcttgtcactgagtggtac gacaaccccaacatcaccgcaattctctgggctggtcttcctggcgagcagagcggcaactctttg gtcgatgtgc tctacggccgtgtcaaccctggcggcaagactccattcacctggggcaagagtttcgactcgtggggttctcatgt aatgactacgcccaacaacggcaatgatgcgccacagctggatttctcggaaggcgttttcatcgactacagatggt ttgacaaga acaacgagactcccatttacgagttcggttacggtctgagctacaccacgttcaagtactccaacct tcaggtcacgcccttgaatg cccccaagtacacccctgctagtggaaagaccgaccctgctcccagtttcggacag cctggcagcgcgtcccaatatgtgttccc acgtacactgaacagaatctacgagtacatctacccgtggttgaact cgaccaacctcagggagtcgtcgggagatcccgactat ggcatgaaggcgtctgcatacatcccggccggcgcaac agatggatctgcgcaagagctgcttccagccagcggtgctcctggt ggcaaccctggtctttatgacgagctgttc agggtctctgctaccatcactaacaccggcaaagtcgctggtgatgaggttccccaa ttgtatgtctctcttggcg gtcctaacgaccccaaggttgttctccgcaacttcgaccgcatcaacattgctccgggccagtccgtcg agtggac taccactctgacccgacgtgacctctccaactgggatgttgcggcccaggactgggtcattagcaagtaccccaag ac ggtctatgttggtagctcttctcgcaagcttcctctgcaggcgacattgcctcaggtcaactga
[0021] 本發明基于PCR的方法分離克隆了 β-葡萄糖苷酶基因 bgl3B，DNA全序列分析結 果表明，去除內含子后的β-葡萄糖苷酶基因 bgl3B cDNA全長2583bp。其中，信號肽的堿 基序列為：
[0022] atgaggcttgggtggcttgaggtggccgcacttgcggttgccaccgttgctgatgcc(SEQ ID NO. 6) 〇
[0023] 成熟的β -葡萄糖苷酶基因 Bgl3B的基因序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0024] SEQ ID NO. 5
[0025] aaggacctggcttattgtcccccattctacccgtcaccatgggcagacggcaatggagagtgggcggag gctcacagtcgtgccgtggaatttgtgt caggcctcacgcttgctgagaaggtcaatctcacgactggtgttggt tggatgggagaaacgtgtgtcggtaataccggtagcattcccagactcgga ttttggggattttgcgcccaagatt ctccccttggtgttcgagacactgattacaattccgctttccccgcgggtgtcaatgttgccgctacctgggacaa gaaccttgcctacctccggggtagagccatgggtgaagaacaccgtgacaaaggcgtggacgttcaacttggcccag tcgctggtcctctcggcag agcgcccgaaggtggcagaaactgggagggcttcggtcctgaccctgtcttgaccgg tcaattgatggcggagaccatcaagggtattcaggatgt cggtgttattgcctgtgcaaagcattttatcctcaac gagcaggagcactttcgccaggttggggaggctcaaggctatggctacaatattacgcaagc cattagctccaaca ttgacgacaagacccttcacgaattgtacctgtggccctttgcggatgccgtgcgtgctggcgtgggctcggtgatg tgctcttac aaccagatcaacaacagttacggatgctcgaacagctacacgatgaacaagctgctcaaaggtgaac tcaactttcagggcttcatcatgagcgactg gcaggcgcataaaagtggtgttggcgacgccttggctggtctgga catgtcgatgccgggtgacactaccttcaacaccggagagtcctactgggg caccaacctgactattgccgtcttg aacggcaccatccctgagtggcgtattgacgacatggccgtccgcatcatgtcggctttctacaaggtcggccg tg accatgtccgcactcctccaaacttcagctcatggaccaccgacgaatatggctacgagcatgctgctgtcaaccag ggctatacgaaggtcaac gacagagttgatgtgcgctctaaccataaagatattattcgccaggttggctcttcca gcgtcgtccttttgaaaaaccagtggggagcacttcccttgac tggcaaggagaagcttgttggtatcatgggtga agacgcaggatccaatgcttatggcgttaatggctgcagtgaccgcggctgcgacaacggcact ttggccatgggc tggggcagtggcaccgcaaacttcccttacctcatcactcccgagcaggccatccaatgggaagtcatcgagagcgg gggtgag gtcttcgcgatcaccgacaacggggcccttgaccagatggcgtctgttgcatctcaggctagcgtgtcc cttgtgttcgtgaacgccgactctggaga aggttacatcaatgtcgatggcaatgagggagatcgtaagaacctca ctctctggaagaacggagatgaggttatcaagactgtcgcggccaactgc aacaacaccattgtggtgatgcatac cgtcggacctgttcttgtcactgagtggtacgacaaccccaacatcaccgcaattctctgggctggtcttcctg gc gagcagagcggcaactctttggtcgatgtgctctacggccgtgtcaaccctggcggcaagactccattcacctgggg caagagtttcgactcgtg gggttctcatgtaatgactacgcccaacaacggcaatgatgcgccacagctggatttc tcggaaggcgttttcatcgactacagatggtttgacaagaa caacgagactcccatttacgagttcggttacggtc tgagctacaccacgttcaagtactccaaccttcaggtcacgcccttgaatgcccccaagtacac ccctgctagtgg aaagaccgaccctgctcccagtttcggacagcctggcagcgcgtcccaatatgtgttcccacgtacactgaacagaa tctacgagt acatctacccgtggttgaactcgaccaacctcagggagtcgtcgggagatcccgactatggcatgaa ggcgtctgcatacatcccggccggcgcaa cagatggatctgcgcaagagctgcttccagccagcggtgctcctggt ggcaaccctggtctttatgacgagctgttcagggtctctgctaccatcacta acaccggcaaagtcgctggtgatg aggttccccaattgtatgtctctcttggcggtcctaacgaccccaaggttgttctccgcaacttcgaccgcatcaa cattgctccgggccagtccgtcgagtggactaccactctgacccgacgtgacctctccaactgggatgttgcggccc aggactgggtcattagcaag taccccaagacggtctatgttggtagctcttctcgcaagcttcctctgcaggcgac attgcctcaggtcaactga
[0026] 成熟蛋白理論分子量為91. 33kDa，將β -葡萄糖苷酶基因 bgl3B成熟編碼序列及 推導出的氨基酸序列進行BLAST比對，確定Bgl3B是一種新的β-葡萄糖苷酶。
[0027] 本發明提供了包含上述酸性β-葡萄糖苷酶基因 bgl3B的重組載體，選為 pPIC-bgl3B。將本發明的β-葡萄糖苷酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之 間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選的實施方 案，優選為將本發明的β -葡萄糖苷酶基因插入到質粒PPIC9上的EcoR I和Not I限制性 酶切位點之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動子的下游并受其調控，得到重組酵母表達質 粒 pPIC9-bgl3B。
[0028] 本發明還提供了包含上述酸性β -葡萄糖苷酶基因 bgl3B的重組菌株，優選所述 菌株為大腸桿菌、酵母菌，優選為重組菌株GS115/bgl3B。
[0029] 本發明還提供了一種制備β -葡萄糖苷酶基因 Bgl3B的方法，包括以下步驟：
[0030] 1)用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；
[0031] 2)培養重組菌株，誘導重組β-葡萄糖苷酶基因 Bgl3B表達；
[0032] 3)回收并純化所表達的β -葡萄糖苷酶基因 Bgl3B。
[0033] 其中，優選所述宿主細胞為畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞或多型遜酵母細胞，優選 將重組酵母表達質粒轉化畢赤酵母細胞（Pichia pastoris)GS115,得到重組菌株GS115/ bgl3B〇
[0034] 本發明還提供了上述β-葡萄糖苷酶Bgl3B的應用。
[0035] 本發明首先所要解決的技術問題是克服現有微生物來源的β -葡萄糖苷酶普遍 酶活不高，催化效率偏低且熱穩定性和耐酸能力不足的問題，從而提供一種新的能夠成功 應用于生物質能源、食品工業和飼料工業中的高催化效率的葡萄糖苷酶。本發明的 β -葡萄糖苷酶Bgl3B最適pH為4. 5,最適溫度為65°C ;在60°C處理Ih基本不失活，具有 很好的熱穩定性；在pH 3-9條件下處理Ih能夠保留90%以上的活性，具有很好的pH穩定 性。可見，本發明的β-葡萄糖苷酶基因 Bgl3B能夠在較為復雜多變的條件下發揮水解作 用，將纖維素類生物質水解為葡萄糖和將異黃酮、人森皂甙等天然苷元類物質轉化為活性 糖苷，在能源、秸桿處理、食品和飼料行業都有較好的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0036] 圖1 β -葡萄糖苷酶的最適pH。
[0037] 圖2重組β -葡萄糖苷酶的pH穩定性。
[0038] 圖3重組β -葡萄糖苷酶的最適溫度。
[0039] 圖4重組β -葡萄糖苷酶的熱穩定性。
【具體實施方式】
[0040] 試驗材料和試劑
[0041] 1、菌株及載體：本發明從嗜熱真菌藍狀菌（Talaromyces Ieycettanus)中分離得 到一種新的酸性β-葡萄糖苷酶Bgl3B。畢赤酵母表達載體pPIC9及菌株GS115購自于 Invitrogen 公司。
[0042] 2、酶類及其它生化試劑：內切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。 pNPG購自Sigma公司，其它都為國產試劑（均可從普通生化試劑公司購買得到）。
[0043] 3、培養基：
[0044] (1)嗜熱真菌藍狀菌（Talaromyces leycettanus JCM12802)培養基為馬鈴薯汁培 養基：1000mL馬鈴薯汁，IOg葡萄糖，25g瓊脂，pH自然。
[0045] (2)大腸桿菌培養基LB(1 %蛋白胨、0.5%酵母提取物、1 % NaCl，pH自然）。
[0046] (3)BMGY 培養基：1 %酵母提取物，2% 蛋白胨，L 34% ΥΝΒ，(λ 00004% Biotin，I % 甘油（V/V)。
[0047] ⑷BMMY培養基：除以0. 5 %甲醇代替甘油，其余成份均與BMGY相同，pH自然。
[0048] 說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗 指南》（第三版）J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書 進行。
[0049] 實施例1藍狀菌（Talaromyces leycettanus JCM12802) β -葡萄糖苷酶編碼基因 bgl3B的克隆
[0050] 提取嗜熱真菌藍狀菌（Talaromyces Ieycettanus)基因組DNA :
[0051] 將液體培養3天的菌絲體用無菌濾紙過濾放入研缽中，加入2mL提取液，研磨 5min，然后將研磨液置于50mL離心管中，65°C水浴鍋裂解120min，每隔20min混勻一次， 在4°C下13000rpm離心lOmin。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體 積異丙醇，于-20 <€靜置30111；[11后，4<€下13000印1]1離心10111；[11。棄上清，沉淀用70%的 乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于-20°C備用。
[0052] 根據第三家族β -葡萄糖苷酶基因的保守區SSNIDD和GLDMT (A)MP⑶(S)序列設 計合成了簡并引物Ρ1，Ρ2
[0053] Pl:5' -GGCCGCAAYTGGGARGGNTT-3'；
[0054] Ρ2:5'-GTCACCAGGCATNGHCATRTC-3'
[0055] 以 Talaromyces leycettanus JCM12802 總 DNA 為模板進行 PCR 擴增。PCR 反應參 數為：94°C變性5min ;然后94°C變性30sec，45°C退火30sec，72°C延伸lmin，30個循環后 72°C保溫lOmin。得到一約475bp片段，將該片段回收后與pEASY-T3載體相連送睿博新科 生物技術有限公司測序。
[0056] 根據測序得到的核苷酸序列，設計上游和下游各三條TAIL-PCR特異性引物：設計 方向為需要擴增的未知區域方向，sp2的位置設計在spl的內側，sp3位于sp2的內側。每 兩個引物之間的距離沒有嚴格規定，引物長度一般22?30nt，退火溫度
[0057] 在60?65°C。并將它們分別命名為SF1，SF2 (上游特異性引物），SR1，SR2 (下游 特異性引物）見表1。
[0058] 表1. β -葡萄糖苷酶BGL3B TAIL-PCR特異性引物
[0059]
【權利要求】
1. 一種酸性e -葡萄糖苷酶Bgl3B，其特征在于，其氨基堿序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2 所示。
2. -種酸性0 -葡萄糖苷酶基因 bgl3B，其特征在于，編碼權利要求1所述的酸性 0-葡萄糖苷酶Bgl3B。
3. 如權利要求2所述的酸性0 -葡萄糖苷酶基因 bgl3B，其特征在于，其堿基序列如 SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示。
4. 包含權利要求2所述酸性0 -葡萄糖苷酶基因 bgl3B的重組載體。
5. 包含權利要求2所述酸性0 -葡萄糖苷酶基因 bgl3B的重組載體pPIC-bgl3B。
6. 包含權利要求2所述酸性0 -葡萄糖苷酶基因 bgl3B的重組菌株。
7. -種制備重組酸性0 -葡萄糖苷酶Bgl3B的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 用權利要求4的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株； 2) 培養重組菌株，誘導酸性0 -葡萄糖苷酶基因 bgl3B表達； 3) 回收并純化所表達的重組酸性0-葡萄糖苷酶Bgl3B。
8. 權利要求1所述酸性0 -葡萄糖苷酶Bgl3B的應用。
9. 權利要求1所述酸性0 -葡萄糖苷酶Bgl3B在能源、食品和飼料方面的應用。
【文檔編號】C12N15/63GK104498456SQ201410718610
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月1日 優先權日:2014年12月1日
【發明者】姚斌, 石鵬君, 夏偉, 羅會穎, 黃火清, 蘇小運, 柏映國, 楊培龍, 王亞茹, 孟昆, 師霞, 馬銳 申請人:中國農業科學院飼料研究所