一種谷氨酸脫羧酶的保存液的制作方法
【專利摘要】本發明公布了一種谷氨酸脫羧酶的保存液，該保存液包括：50mM磷酸鹽緩沖液，pH6.0，甘油50％，聚乙二醇辛基苯基醚0.1％-1％，聚山梨酯0.1％-0.2％，NaCl 50-100mM，乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二鈉鹽1-2mM，山梨醇5-10％，蔗糖和或海藻糖，其中蔗糖10％-20％，海藻糖5％-10％；還包括0.01％-0.05％疊氮鈉或0.1％-0.2％麝香草酚和蛋白酶抑制劑為抗痛素和或抑肽酶。利用本發明公布的保存液4℃保存谷氨酸脫羧酶保存1-2個月活性基本不丟失，60℃孵育2小時保留活性為60％。
【專利說明】-種谷氨酸脫錢酶的保存液
【技術領域】
[0001] 本發明涉及酶的保存領域，尤其涉及一種谷氨酸脫駿酶的保存液，屬于生物工程 領域。
【背景技術】
[0002] Y-氨基下酸（GABA)存在于哺乳動物腦、脊髓中，是一種抑制性神經傳遞物質，由 谷氨酸脫駿酶（谷氨酸脫駿酶）催化谷氨酸得到。GABA具有調節血壓與也律、營養神經細 胞、促進精神安定、促進腦部供血、促進長期記憶、促進激素分泌、腎功能活化等作用。
[0003] Y -氨基下酸的生產基本采用化學合成、植物富集法和生物合成法。其中生物合成 法利用谷氨酸脫駿酶催化谷氨酸底物生成Y-氨基下酸，可用于生產Y-氨基下酸。
[0004] 谷氨酸脫駿酶可W利用生物工程的方法獲得高表達谷氨酸脫駿酶的工程菌、擴大 培養，然后通過下游分離純化技術獲得高純度高比活的谷氨酸脫駿酶產品。但是谷氨酸脫 駿酶作為蛋白質，室溫條件下容易變性失活，無法長期保存。因此，如何采用有效的手段延 長其在室溫條件下的保存期限是獲得谷氨酸脫駿酶后需要解決的技術問題。
[0005] 目前，常采用酶的固定化將谷氨酸脫駿酶固定于特定載體W增加其耐熱性和耐酸 堿性等穩定性能。固定化酶主要為催化劑采用填充床反應器或其他方式連續制備Y-氨基 下酸。作為制備固定化酶催化劑的前體，液體谷氨酸脫駿酶仍存在長期保存的問題，待解 決。
【發明內容】
[0006] 為解決上述問題，本發明提供一種谷氨酸脫駿酶的保存液，在本發明公布的保存 液配方中，谷氨酸脫駿酶可在4C保存1-2個月活性基本不丟失。
[0007] 本發明所采用的技術方案如下：
[0008] -種谷氨酸脫駿酶的保存液，該保存液的成分和重量百分比或摩爾濃度為：
[0009] 50mM磯酸鹽緩沖液，P冊.0
[0010] 甘油 50%
[0011] 己二胺四己酸0. 1%-1%
[0012] 聚山梨醋 0. 1%-0. 2%
[0013] NaCl SO-IOOmM
[0014] 己二胺四己酸或己二胺四己酸二軸鹽l-2mM [00巧]山梨醇5%-10%
[0016] 藏糖和或海藻糖，其中藏糖10% -20%，海藻糖5% -10%
[0017] 優選的，本發明公布的保存液中己二胺四己酸的含量為0. 1%。
[0018] 優選的，本發明公布的保存液中聚山梨醋的含量為0. 1%。
[0019] 優選的，本發明公布的保存液中山梨醇的含量為7. 5%。
[0020] 優選的，本發明公布的保存液中藏糖的含量為15%。
[0021] 優選的，本發明公布的保存液中還包括0.01 % -0.05%疊氮軸或0. 1% -0.2%麾 香草酷。
[0022] 優選的，本發明公布的保存液中還包括蛋白酶抑制劑。
[0023] 優選的，本發明公布的保存液中蛋白酶抑制劑為抗痛素和或抑膚酶。
[0024] 優選的，本發明公布的保存液中抗痛素的濃度為50 U g/mL。
[0025] 優選的，本發明公布的保存液中抑膚酶的濃度為1-2 U g/mL。
[0026] 本發明的有益效果是；1、保存液中含有對谷氨酸脫駿酶有特別保護效果的藏糖和 海藻糖，有效提高了谷氨酸脫駿酶的熱穩定性；2、谷氨酸脫駿酶長期保存中活力的丟失的 一個主要原因是由微生物污染引起的，在保存液中增加抑菌劑或防腐劑，能有效避免保存 液中或酶液中存在的微量微生物因從長期保存帶來的活力丟失問題；3、藏糖、海藻糖和山 梨醇亦能穩定液體環境中的谷氨酸脫駿酶，減緩或預防其發生有害的蛋白聚集；4、酶液中 蛋白酶的存在是另一個引起酶活力丟失的原因，適當添加蛋白酶抑制劑能避免或延緩該一 過程的發生；5、同時，在50%甘油中添加的藏糖、海藻糖、山梨醇W及氯化軸，能有效降低 保存液冰點，避免因低溫保存環境中溫度的驟升驟降帶來的活力損傷。
【具體實施方式】
[0027] 下面結合具體的實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限如此。
[0028] 實施例一
[0029] 本實施例中保存液配方如下：
[0030] 50mM磯酸鹽緩沖液，P冊.0,甘油50%，己二胺四己酸0. 1%，聚山梨醋0. 1%，化Cl 50mM，己二胺四己酸二軸鹽ImM,山梨醇5 %，藏糖10 %，海藻糖10 %，疊氮軸0. 05 %，抗痛素 50 U 咨/mL。
[0031] 配置方法；按比例稱量磯酸軸和磯酸氨二軸，甘油，己二胺四己酸，聚山梨醋， 化Cl,己二胺四己酸二軸鹽，山梨醇，藏糖，海藻糖，疊氮軸，混合均勻后肥1調抑至6. 0， 12rc滅菌30min ;冷卻至室溫后加入抗痛素，混合均勻后4C保存備用。整個配液過程無菌 操作。
[0032] 實施例二
[0033] 本實施例中保存液配方如下：
[0034] 50mM磯酸鹽緩沖液，P冊.0,甘油50%，己二胺四己酸0. 5%，聚山梨醋0. 1 %，化Cl IOOmM,己二胺四己酸二軸鹽2mM，山梨醇10%，海藻糖10%,0.2%麾香草酷。
[00巧]配置方法如實施例一所述。麾香草酷常溫配置。
[003引 實施例S
[0037] 本實施例中保存液配方如下：
[003引 50mM磯酸鹽緩沖液，P冊.0,甘油50%，己二胺四己酸0. 5%，聚山梨醋0. 1 %，化Cl IOOmM,己二胺四己酸二軸鹽2mM，山梨醇10%，海藻糖10%，0. 2%麾香草酷，抗痛素50 y g/ 血，抑膚酶2 y g/血。
[0039] 配置方法如實施例一所述。麾香草酷常溫配置，抑膚酶配置方法同抗痛素。
[0040] 實施例四
[0041] 本實施例中保存液配方如下：
[004引 50mM磯酸鹽緩沖液，P冊.0、甘油50 %，己二胺四己酸0. 5 %，聚山梨醋0. I %，化Cl IOOmM,己二胺四己酸二軸鹽2mM，山梨醇5%，海藻糖10%、0. 2%麾香草酷、抗痛素50 y g/ 血、抑膚酶2 y g/血。
[0043] 配置方法如實施例一所述。麾香草酷常溫配置，抑膚酶配置方法同抗痛素。
[0044] 實施例五
[0045] 本實施例中保存液配方如下：
[0046] 50mM磯酸鹽緩沖液，P冊.0,甘油50%，己二胺四己酸0. 1%，聚山梨醋0. 1%，化Cl IOOmM,己二胺四己酸二軸鹽2mM，山梨醇7. 5%，藏糖7. 5%，海藻糖10%，0. 2%麾香草酷， 抗痛素50 y g/mU抑膚酶2 y g/mL。
[0047] 配置方法如實施例一所述。麾香草酷常溫配置，抑膚酶配置方法同抗痛素。
[004引實施例六
[0049] 大腸桿菌谷氨酸脫駿酶在保存液中穩定性測試
[0050] 大腸桿菌谷氨酸脫駿酶酶液；比活為150U/mg，蛋白濃度為0. 5mg/mL。
[0051] 比色法測定固定化谷氨酸脫駿酶活力。1個谷氨酸脫駿酶活力單位扣）定義為： 在37C，P冊.5條件下，每分鐘每毫升酶液中催化谷氨酸脫駿酶發生脫駿反應生成1 U mol 的GABA所需酶量。
[0052] 實驗方法1 ;將大腸桿菌谷氨酸脫駿酶液與實施例5中的保存液W-定比例混合， 超濾或10倍體積透析濃縮，使其蛋白濃度不低于0. 5mg/mL。將所得濃縮酶液室溫6(TC賠 育2小時，對照組為谷氨酸脫駿酶酶液（比活為150U/mg，蛋白濃度為0. 5mg/mL)6(TC賠育 2小時；檢測樣品谷氨酸脫駿酶保留活性。
[0053] 實驗方法2 ;將大腸桿菌谷氨酸脫駿酶液與實施例5中的保存液W-定比例混合， 超濾或10倍體積透析濃縮，使其蛋白濃度不低于0. 5mg/mL。將所得濃縮酶液室溫4C保存 半年，對照組為谷氨酸脫駿酶酶液（比活為150U/mg，蛋白濃度為0. 5mg/mL)4°C保存半年； 每月檢測一次樣品谷氨酸脫駿酶保留活性。
[0054] 測得保存液組谷氨酸脫駿酶6(TC賠育2小時保留活性為60%，對照樣品的保留活 性為21%。
[00巧]測得谷氨酸脫駿酶4C保存保留活性如下表
[0056]
【權利要求】
1. 一種谷氨酸脫羧酶的保存液，其特征在于，該保存液的成分和重量百分比或摩爾濃 度為： 50mM磷酸鹽緩沖液，pH6. 0 甘油50% 乙二胺四乙酸0. 1% -1% 聚山梨酯〇. 1% _〇. 2% NaCl 50-100mM 乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二鈉鹽l-2mM 山梨醇5% -10% 蔗糖和或海藻糖，其中蔗糖10%-20%，海藻糖5%-10%。
2. 根據權利要求1所述的保存液，其特征在于，所述保存液中乙二胺四乙酸的含量為 0? 1%。
3. 根據權利要求1所述的保存液，其特征在于，所述保存液中聚山梨酯的含量為 0? 1%。
4. 根據權利要求1所述的保存液，其特征在于，所述保存液中山梨醇的含量為7. 5%。
5. 根據權利要求1所述的保存液，其特征在于，所述保存液中蔗糖的含量為15%。
6. 根據權利要求1所述的保存液，其特征在于，所述保存液還包括0.01%-0.05%疊氮 鈉或0. 1% -0. 2%麝香草酚。
7. 根據權利要求1所述的保存液，其特征在于，所述保存液還包括蛋白酶抑制劑。
8. 根據權利要求7所述的保存液，其特征在于，所述蛋白酶抑制劑為抗痛素和或抑肽 酶。
9. 根據權利要求8所述的保存液，其特征在于，所述蛋白酶抑制劑抗痛素的濃度為 50 y g/mL〇
10. 根據權利要求8所述的保存液，其特征在于，所述蛋白酶抑制劑抑肽酶的濃度為 1-2 y g/mL〇
【文檔編號】C12N9/88GK104357432SQ201410707603
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月27日 優先權日:2014年11月27日
【發明者】金京勛 申請人:蘇州嘉禧蘿生物科技有限公司