一株降解除草劑乙草胺和雜草焚的細菌及其用途

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一株降解除草劑乙草胺和雜草焚的細菌及其用途
【專利摘要】本發明公開了一株降解除草劑乙草胺和雜草焚的細菌及其用途。該降解乙草胺和雜草焚的細菌是根瘤菌(Rhizobium sp.)198-R-47，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No.9867。本發明提供的根瘤菌(Rhizobium sp.)198-R-47 CGMCC No.9867在無機鹽培養基中7天對50mg/L乙草胺的降解率達到73.65％；對100mg/L雜草焚的降解率達到9.04％。這表明該菌株能夠降解乙草胺和/或雜草焚，在修復土壤除草劑乙草胺和/或雜草焚污染方面具有廣闊的應用前景。CGMCC No986720141028
【專利說明】一株降解除草劑乙草胺和雜草焚的細菌及其用途

【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物領域中一株降解除草劑乙草胺和雜草焚的細菌及其用途。

【背景技術】
[0002] 乙草胺，英文通用名稱acetochlor，化學名稱是2-乙基-6甲基-N-乙氧基甲基_ α _氯代乙酰替苯胺。
[0003] 乙草胺是內吸性酰胺類除草劑，是選擇性的芽前除草劑。能被雜草的幼芽和幼根吸收，抑制雜草蛋白質合成，而使雜草死亡。主要用于大豆、花生、玉米、棉花等作物防除一年生禾本科雜草和部分闊葉雜草，對大豆菟絲子有良好防效，對多年生雜草無效。
[0004] 雜草焚，又名三氟羧草醚，英文名稱acifluorfen，化學名稱5-(2-氯-α，α，三氟對甲苯氧基）2-硝基苯甲酸。
[0005] 雜草焚是二苯醚類除草劑，屬接觸性除草劑，是原卟啉氧化酶抑制劑。通常采用 25%水劑進行大豆苗前表土處理及苗后經葉噴霧，可有效防除大豆田闊葉雜草如蒼耳、苘麻、龍葵、覽、藜、寥、牽牛、豚草、曼陀羅、馬齒覽、鐵覽菜、鬼針草、融瓣花、鴨妬草等，苗后早期處理也可防除包括狗尾草在內的一年生禾本科雜草。噴藥后，大豆會不同程度受害，表現為葉片黃化、皺縮、褐變等，但6?7d后恢復正常。
[0006] 乙草胺和雜草焚半衰期較短，一直被認為是一種低毒的環境友好型農藥，但近年來頻繁、過量或使用不當，對農田土壤和地下水等造成了不同程度的污染，對后茬作物的危害也越來越嚴重。研究表明，在環境中大量施用乙草胺和雜草焚造成一定的殘留毒性，其在地下水、地表水中可以殘留數年，進入到環境中通過食物鏈在生物體內不斷富集，對魚類有較強的毒性，對環境污染很大。尤其乙草胺可以引起生物體的內分泌紊亂，造成不育、不正常的性別差異甚至致癌，已被美國環保局定為致癌物。
[0007] 自然界除草劑殘留的降解主要依靠土壤中微生物來完成，但自然降解十分緩慢。因此，有針對性地篩選高效微生物菌株，研制微生物修復劑，通過人工接種加速土壤除草劑殘留的降解消除農田除草劑殘留藥害是一項十分必要的工作和切實可行的途徑。

【發明內容】

[0008] 本發明所要解決的技術問題是如何降解除草劑乙草胺和雜草焚。
[0009] 為解決上述技術問題，本發明提供了一株可以降解除草劑乙草胺和雜草焚的細菌。
[0010] 本發明提供的細菌是根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-R-47,該菌株已于2014年10月 28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號），保藏編號為CGMCC No. 9867。
[0011] 本發明的另一個目的是提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為所述的根瘤菌 (Rhizobium sp.)198-R-47 CGMCC No. 9867〇
[0012] 上述菌劑可為下述1)或2)所述菌劑：
[0013] 1)用于降解除草劑乙草胺和/或雜草焚的菌劑；
[0014] 2)用于修復土壤除草劑乙草胺和/或雜草焚污染的菌劑。
[0015] 所述菌劑還可以包括載體。所述載體可為固體載體或液體載體。所述固體載體可為礦物材料、植物材料或高分子化合物；所述礦物材料可為粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一種；所述植物材料可為玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一種；所述高分子化合物可為聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液體載體可為有機溶劑、植物油、礦物油或水；所述有機溶劑可為癸烷和/或十二烷。所述菌劑中，所述活性成分可以以被培養的活細胞、活細胞的發酵液、細胞培養物的濾液或細胞與濾液的混合物的形式存在。所述組合物的劑型可為多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可濕性粉劑或水分散粒劑。
[0016] 根據需要，所述菌劑中還可添加表面活性劑（如吐溫20、吐溫80等）、粘合劑、穩定劑（如抗氧化劑）、pH調節劑等。
[0017] 所述的根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-R-47 CGMCC No. 9867 或以根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-R-47 CGMCC No. 9867為活性成分的菌劑在降解除草劑乙草胺和/或雜草焚中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0018] 所述的根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-R-47 CGMCC No. 9867 或以根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-R-47 CGMCC No. 9867為活性成分的菌劑在修復土壤除草劑乙草胺和/或雜草焚污染中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0019] 本發明的再一個目的是提供一種培養根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-R-47 CGMCC No. 9867的方法。
[0020] 本發明所提供的培養根瘤菌（Rhizobium sp.)198-R-47 CGMCC No. 9867的方法，包括將根瘤菌（Rhizobium sp.)198-R-47 CGMCC No. 9867在用于培養根瘤菌的培養基中培養的步驟。
[0021] 本發明的又一個目的是提供一種以根瘤菌（Rhizobium sp.)198-R-47 CGMCC No. 9867為活性成分的菌劑的制備方法。
[0022] 本發明所提供上述菌劑的制備方法，包括如下步驟：將所述的根瘤菌（Rhizobium sp. )198-R-47 CGMCC No. 9867作為活性成分，得到所述菌劑。
[0023] 本發明是從長期受到除草劑污染的農田采集土樣，并從中分離篩選得到的除草劑乙草胺和/或雜草焚降解菌根瘤菌（Rhizobium sp.)198-R-47 CGMCC No. 9867。實驗證明，該菌株在無機鹽培養基中7天對50mg/L乙草胺降解率達到73. 65% ;對100mg/L雜草焚的降解率達到9. 04%。這表明該菌株能降解除草劑乙草胺和/或雜草焚，在修復土壤除草劑乙草胺和雜草焚污染方面具有廣闊的應用前景。
[0024] 保藏說明
[0025] 菌種名稱：根瘤菌
[0026] 拉丁名：（Rhizobium sp.)
[0027] 菌株編號：198-R_47
[0028] 保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0029] 保藏機構簡稱：CGMCC
[0030] 地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號
[0031] 保藏日期：2014年10月28日
[0032] 保藏中心登記入冊編號：CGMCC No. 9867

【具體實施方式】
[0033] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0034] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0035] 下述實施例中所用的培養基如下：
[0036] 無氮液體培養基：溶質及其濃度為蔗糖10g/L，NaCl 0· 12g/L，K2HPO4 · 3H20 0· 5g/ L，CaCO3 lg/L，MgSO4 · 7H20 0· 2g/L ;溶劑為蒸餾水；ρΗ7· 2。
[0037] 無氮固體培養基：向無氮液體培養基中加瓊脂至其含量為15_20g/L得到的培養基。
[0038] 牛肉膏蛋白胨液體培養基：溶質及其濃度為牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaC15g/ L;溶劑為蒸餾水；pH7.2。
[0039] 牛肉膏蛋白胨固體培養基：溶質及其濃度為牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaC15g/ L、瓊脂15-20g/L ;溶劑為蒸餾水；pH7. 2。
[0040] 無機鹽液體培養基：溶質及其濃度為NH4Cl I. Og/L，KH2PO4 0· 5g/L，K2HPO4 I. 5g/ L，MgSO4 0· 2g/L，NaCl 0· 5g/L ;溶劑為蒸餾水；ρΗ7· 0。
[0041] 無機鹽固體培養基：向無機鹽液體培養基中加瓊脂至其含量為2%得到的培養基。
[0042] 下述實施例中的根瘤菌（Rhizobium sp.) LD1616CGMCC No. 7775 (簡稱根瘤菌 (Rhizobium sp.)LD1616)已在中國發明專利文獻CN 103343100B中公開。
[0043] 實施例 1、根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-R-47 CGMCC No. 9867 的分離與鑒定
[0044] 一、乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47的分離
[0045] 1、在IOOrnl無菌水中加入IOg土壤樣品（采自中國黑龍江黑河受除草劑污染的農田），振蕩培養30min制成混濁液。吸取Iml上述混濁液加入盛有9ml無菌水中的試管中充分混勻（此時稀釋度記為KT 1)，然后從此試管中吸取Iml加入到另一盛有9ml無菌水的試管中混合均勻，以此類推制成10_2、10_ 3、10_4、10_5不同稀釋度的菌懸液。將各稀釋度取0.11111 均勻涂布在無氮固體培養基平板上，28°C恒溫靜置培養2- 3天。待菌落形成后，在無氮固體培養基平板上進行菌種純化。
[0046] 2、對除草劑乙草胺、雜草焚、普施特和氯嘧磺隆降解能力的初步篩選采用平板透明圈法。將乙草胺標準品（Fluka公司產品）加入無機鹽固體培養基使其含量為IOOOmg/ L，得到乙草胺平板；將雜草焚標準品（Fluka公司產品）加入無機鹽固體培養基使其含量為 1000mg/L，得到雜草焚平板；將普施特標準品（Fluka公司產品）加入無機鹽固體培養基使其含量為l〇〇〇mg/L，得到普施特平板；將氯嘧磺隆標準品（Fluka公司產品）加入無機鹽固體培養基使其含量為l〇〇〇 mg/L，得到氯嘧磺隆平板。將乙草胺平板、雜草焚平板、普施特平板和氯嘧磺隆平板進行分區，吸取步驟1純化得到的每株菌的菌懸液10 μ L和本實驗室的根瘤菌（Rhizobium sp. )LD1616的菌懸液10μ L(各種菌株菌懸液的菌體含量相同）分別點種到四種平板上（每株菌在一個平板上重復3次），28°C培養、觀察。篩選到一株在乙草胺平板和雜草焚平板上均能形成較大透明圈的菌株，將該菌株其命名為乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47。乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47在普施特平板和氯嘧磺隆平板均不能形成透明圈。根瘤菌（Rhizobium sp.)LD1616只在氯啼磺隆平板上形成較大透明圈，在普施特平板、乙草胺平板和雜草焚平板上均不能形成透明圈。說明乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47 能降解乙草胺和雜草焚，不能降解氯啼磺隆和普施特；根瘤菌（Rhizobium sp.)LD1616能降解氯嘧磺隆，不能降解普施特、乙草胺和雜草焚。
[0047] 表L乙草胺/雜草焚降解菌198-R-47和根瘤菌（Rhizobium sp. )LD1616對四種除草劑降解能力初篩結果

【權利要求】
1. 根瘤菌（Rhizobium sp. )198-R-47,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No. 9867。
2. -種菌劑，其特征在于：所述菌劑的活性成分為權利要求1所述的根瘤菌 (Rhizobium sp.)198-R-47CGMCC No. 9867〇
3. 根據權利要求2所述的菌劑，其特征在于：所述菌劑為下述1)或2)所述菌劑： 1) 用于降解乙草胺和/或雜草焚的菌劑； 2) 用于修復土壤乙草胺和/或雜草焚污染的菌劑。 4?權利要求1所述的根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-R-47CGMCC No. 9867、或權利要求2 或3所述的菌劑在降解乙草胺和/或雜草焚中的應用。 5?權利要求1所述的根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-R-47CGMCC No. 9867、或權利要求2 或3所述的菌劑在修復土壤乙草胺和/或雜草焚污染中的應用。
6. 培養權利要求1所述根瘤菌（Rhizobium sp.)198-R-47CGMCC No. 9867的方法，包括將所述根瘤菌（Rhizobium sp.)198-R-47CGMCC No. 9867在用于培養根瘤菌的培養基中培養的步驟。
7. 權利要求2或3所述菌劑的制備方法，包括如下步驟：將權利要求1所述的根瘤菌 (Rhizobium sp.)198-R-47CGMCC No. 9867作為活性成分，得到所述菌劑。
【文檔編號】C12N1/20GK104388355SQ201410705138
【公開日】2015年3月4日申請日期:2014年11月26日優先權日:2014年11月26日
【發明者】高淼, 孫建光, 孫穎飛, 張磊申請人:中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所

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