一種惡疫霉菌的lamp檢測引物組合物及其lamp檢測試劑盒和lamp檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種惡疫霉菌的LAMP檢測引物組合物及其LAMP檢測試劑盒和LAMP檢測方法。該LAMP檢測引物組合物由正向內引物FIP、反向內引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向環引物LB組成；各引物序列具體如下：FIP：5′-TCTGGGCACAACCGCAAAAA-TTTGCGAGCTCCAGATTTCC-3′；BIP：5′-AATCCGTACGATCGAGCTGGAC-ACACGCCACGTCTGCT-3′；F3：5′-TTCTGCGCTAGGCGACC-3′；B3：5′-CACACAAGTGGACCGTTAG-3′；LB：5′-GGAAAGACCATCAAGCTCCAGAT-3′。本發明的檢測方法準確性高、特異性強、操作方便、實用性好、實現了恒溫擴增，同時還為惡疫霉菌的檢測提供了新的技術平臺，可用于惡疫霉菌的高靈敏度快速檢測，同時在病害侵染初期鑒定出病原物，能夠對田間土壤中的惡疫霉菌進行檢測。本發明對惡疫霉菌引起的疫病防治和對減少農藥盲目使用，降低生產成本，減少農藥的環境污染也具有重要意義。
【專利說明】-種惡疫霉菌的LAMP檢測引物組合物及其LAMP檢測試劑 盒和LAMP檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種惡疫霉菌的LAMP檢測引物組合物及其 LAMP檢測試劑盒和LAMP檢測方法。
【背景技術】
[0002] 惡疫霉（Phytophthora cactorum)侵染引起的植物疫病是一種世界性分布的 土傳毀滅性病害，危害超過200種植物，常給多種經濟作物（如草莓、蘋果、梨、人參等） 的生產帶來嚴重損失。惡疫霉菌屬于卵菌門（Oomycota)、卵菌綱（Oomycetes)、霜霉目 (Peronosporales)、腐霉科（Pythiaceae)、疫霉屬（Phytophthora)。惡疫霉引起的植物病 害分布廣泛，所以建立惡疫霉的快速分子檢測技術對于其引起疫病的早期控制具有重要意 義。目前對該病害還沒有快速有效的防治措施，控制該病的最有效途徑就是加強檢疫，防止 病原菌的傳播和阻礙其擴散方式。
[0003] 傳統的惡疫霉菌的分類鑒定主要是基于形態學特征、致病性測定、生理生化特征 等。傳統方法在惡疫霉菌檢測中發揮了重要作用，但是費時費力而且要求操作者具備專業 的疫霉菌分離、形態學鑒定知識和豐富的經驗；同時傳統分類鑒定方法耗時長、靈敏度低、 易受人為及環境等諸多因素的干擾，不能在病害潛伏期和發病初期做出診斷，很難對病害 發生進行及時的監測和有效控制。隨著分子生物學的發展，PCR技術為植物病原診斷提供 了快速、靈敏、準確的優勢。普通PCR的方法已經成功用于檢測惡疫霉菌，雖然PCR法在特 異性和敏感性上有較大的提高，但是檢測時間仍然比較長，大概4?5h，同時PCR方法依賴 精密的溫度循環裝置，其檢測靈敏度比較高、檢測過程復雜，不能滿足快速檢測的需求。
[0004] 環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種 新的核酸擴增技術，因其操作簡單、快速、特異性高、成本低等優點，成為可以替代PCR的新 的核酸擴增技術。它是針對靶基因的6個區域設計4種特異的引物，在Bst大片段聚合酶的 作用下引起自循環鏈置換反應，60?65°C范圍80min內，大量合成目標DNA的同時伴隨有 畐IJ產物一白色的焦磷酸鎂沉淀產生。由于LAMP擴增過程依賴識別靶序列6個獨立區域， 所以反應特異性很強，并且核酸擴增過程是在恒溫條件下進行，普通水浴鍋或者有穩定熱 源的設備就能滿足反應要求，檢測成本大大降低。由于LAMP反應簡單、快速、高效、經濟等 特征，因而具有極為廣泛的應用前景。自LAMP檢測技術建立14年以來，該技術已經廣泛應 用于對病毒、細菌、寄生蟲、真菌等病原菌的檢測研究，但在植物病原卵菌的檢測報道很少， 惡疫霉菌的檢測國內外均未見報道。
【發明內容】
[0005] 發明目的：針對現有技術中惡疫霉菌生物學檢測方法所需周期長、檢測方法特異 性差、靈敏度低的問題，本發明的目的是提供一種惡疫霉菌的LAMP檢測引物組合物。本發 明的另一目的是提供上述惡疫霉菌的LAMP檢測試劑盒。本發明還有一目的是提供上述惡 疫霉菌的LAMP檢測方法。
[0006] 技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：
[0007] -種用于檢測惡疫霉菌的LAMP檢測引物組合物：由正向內引物FIP、反向內引物 BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向環引物LB組成；各引物序列具體如下：
[0008] FIP -TCTGGGCACAACCGCAAAAA-TTTGCGAGCTCCAGATTTCC-3 / ；
[0009] BIPji -AATCCGTACGATCGAGCTGGAC-ACACGCCACGTCTGCT-3';
[0010] F3:5' -TTCTGCGCTAGGCGACCHV ;
[0011] B3 :5，-CACACAAGTGGACCGTTAG-3，；
[0012] LB:5，-GGAAAGACCATCAAGCTCCAGAT-3，。
[0013] 所述的LAMP檢測引物組合物在檢測惡疫霉菌中的應用。
[0014] 一種檢測惡疫霉菌的LAMP檢測試劑盒：包含ImL檢測溶液，所述的檢測溶液包括： 32mM正向內引物FIP、32mM反向內引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM環 引物 LB、50mM dNTPs、0.8M Tris-HC、0.4mM KCl、0.4mM(NH4)2S04、0.24mM MgS04、4% Triton X_100、Bst DNA polymerase 320單位，200mM輕基萘酚藍；其中，各引物序列具體如下：
[0015] FIP -TCTGGGCACAACCGCAAAAA-TTTGCGAGCTCCAGATTTCC-3 / ；
[0016] BIPiSi -AATCCGTACGATCGAGCTGGAC-ACACGCCACGTCTGCT-3/ ；
[0017] F3:5' -TTCTGCGCTAGGCGACCHV ;
[0018] B3:5，-CACACAAGTGGACCGTTAG-S，；
[0019] LB:5， -GGAAAGACCATCAAGCTCCAGAT-3，。
[0020] 所述的檢測惡疫霉菌的LAMP試劑盒在檢測惡疫霉菌中的應用。
[0021] 一種檢測惡疫霉菌的LAMP檢測方法：包括提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA 為模板，利用LAMP檢測引物組合物或LAMP檢測試劑盒進行LAMP ;擴增產物進行瓊脂糖凝 膠電泳，在紫外光下檢測結果，如果存在特征性階梯狀條帶，則證明所檢測樣品中存在惡疫 霉菌；無特征性階梯狀條帶，則所檢測樣品中無惡疫霉菌；或觀察LAMP反應溶液顏色變化， 天藍色表示檢測為陽性，存在惡疫霉菌；紫色表示檢測結果為陰性，不存在惡疫霉菌。
[0022] 所述的檢測惡疫霉菌的LAMP檢測方法：提取待檢微生物的DNA，取1 μ L DNA溶液， 加入23 μ LLAMP試劑盒中的檢測溶液和1 μ L滅菌去離子水進行LAMP，LAMP反應程序為： 60°C?65°C,50 ?70min。
[0023] 本發明的檢測惡疫霉菌的方法，包括提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA為模 板，利用所述的LAMP引物組合物進行LAMP ;輕基萘酚藍（hydroxylnaphthol blue，HNB)屬 于金屬離子指示劑的一種。HNB是Mg2+的滴定劑，其顏色隨溶液PH變化而改變，因此可以 通過監測LAMP反應體系中Mg 2+濃度的變化及溶液PH而起到顏色指示劑的作用。反應前 將HNB加入到反應液中，反應體系呈紫色，反應過程中Mg 2+與LAMP反應的副產物P2O廣結合 產生大量沉淀，溶液中Mg2+濃度降低，pH發生變化，從而使HNB的顏色由紫色變為天藍色。 因此，反應結束后通過反應體系的顏色變化，來判斷惡疫霉菌的有無：天藍色表示檢測為陽 性，存在惡疫霉菌；紫色表示檢測結果為陰性，不存在惡疫霉菌。
[0024] 本發明的關鍵性技術之一是惡疫霉菌的高效特異擴增的引物序列及其擴增方法。 為了驗證惡疫霉菌的特異性引物序列，本發明以15株惡疫霉菌菌株和13種其它卵菌以及 19種病原真菌為供試材料（表1)，采用CTAB法提取發病組織中惡疫霉菌的DNA。具體方法 如下：取少量菌絲粉，加900 μ L 2% CTAB提取液和90 μ L 10% SDS，漩渦混勻，于55°C水浴 lh，中間每IOmin上下顛倒幾次。12000rpm離心lOmin，取上清加等體積酚/氯仿/異戊醇 (25 :24 :1)，顛倒混勻，12000rpm離心IOmin ;將上清轉移至新管，加等體積氯仿，輕輕顛倒 混勻，12000rpm離心5min。上清轉移至新管中，加2倍體積的無水乙醇和1/10體積的3M 似八(：(?!15.2)，-201：沉淀（>111)。12000印111離心101^11，傾去上清，沉淀用70%乙醇洗滌兩 次，室溫晾干。加適量滅菌超純水或TE (pH 8.0)溶解沉淀（含20 μ g/mL RNase)，37°C處理 Ih后，-20°C保存備用。所有的土壤樣品采用FastDNAli SPIN試劑盒（Q-Biogene Ltd, USA) 進行DNA的提取。土壤DNA提取步驟參見試劑盒說明書。這一商用土壤微生物DNA提取試 劑盒可以在〇. 5h內提取到土壤中的微生物。
[0025] 當發生LAMP擴增反應時，產生大量的焦磷酸鎂白色沉淀導致反應液的濁度上升， 通過HNB的顯色反應結果所示，惡疫霉菌的反應管里均呈天藍色，其為陽性結果，而其它疫 霉種、真菌、腐霉和陰性對照菌反應管均呈紫色，為陰性結果，證明所設計的LAMP特異性引 物具有種的特異性。同時，反應產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，成像觀察擴增的反應產物，惡 疫霉菌的反應管中的反應液出現了典型階梯形狀條帶，而其它疫霉種、真菌、腐霉和陰性對 照菌反應管沒有出現梯形條帶。這說明該引物組可被用于生產實踐中發病組織及土壤中惡 疫霉菌的快速可靠的檢測鑒定。當用于發病組織中存在惡疫霉菌時，采用NaOH快速裂解法 提取惡疫霉菌的DNA，具體過程如下：取一段發病的植株組織，每毫克組織加入10 μ L 0. 5M NaOH,在研缽中充分研磨后轉移至I. 5mL的EP管中，12000rpm離心5min，取5 μ L上清液加 入495 μ L 0. ImM Tris (pH 8.0)，混勻后取IyL直接用于PCR反應。每個反應至少重復三 次，同時為確定植株中無 PCR抑制物存在。
[0026] 表1用于檢測惡疫霉菌特異性的真菌和卵菌菌株
[0027]
[0028]
【權利要求】
1. 一種用于檢測惡疫霉菌的LAMP引物組合物，其特征在于：由正向內引物FIP、反向內 引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向環引物LB組成；各引物序列具體如下： FIP^' - TCTGGGCACAACCGCAAAAA-TTTGCGAGCTCCAGATTTCC-3'； BIP:5' -AATCCGTACGATCGAGCTGGAC-ACACGCCACGTCTGCT-3'; F3:5' -TTCTGCGCTAGGCGACC-3'; 83:5' -CACACAAGTGGACCGTTAG-3,; LB:5, -GGAAAGACCATCAAGCTCCAGAT-3，。
2. 權利要求1所述的LAMP引物組合物在檢測惡疫霉菌中的應用。
3. -種檢測惡疫霉菌的LAMP試劑盒，其特征在于：包含lmL檢測溶液，所述的檢測溶 液包括：32mM正向內引物FIP、32mM反向內引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物 B3、8mM 環引物 LB、50mM dNTPs、0.8M Tris-HC、0.4mM KCl、0.4mM (NH4)2S04、0.24mM MgS04、 4%Triton X_100、Bst DNA polymerase 320單位，200mM輕基萘酌?藍；其中，各引物序列具體 如下： FIP:5' -TCTGGGCACAACCGCAAAAA-TTTGCGAGCTCCAGATTTCC-3'; BIP:5' -AATCCGTACGATCGAGCTGGAC-ACACGCCACGTCTGCT-3，； - TTCTGCGCTAGGCGACC -3'； B3:5， -CACACAAGTGGACCGTTAG-3，； LB# - GGAAAGACCATCAAGCTCCAGAT -3，。
4. 權利要求3所述的檢測惡疫霉菌的LAMP試劑盒在檢測惡疫霉菌中的應用。
5. -種檢測惡疫霉菌的方法，其特征在于：包括提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA 為模板，利用LAMP引物組合物或LAMP試劑盒進行LAMP ;觀察LAMP反應溶液顏色變化，天 藍色表示檢測為陽性，存在惡疫霉菌；紫色表示檢測結果為陰性，不存在惡疫霉菌。
6. 根據權利要求5所述的檢測惡疫霉菌的方法，其特征在于：提取待檢微生物的DNA， 取2 ii L DNA溶液，加入23 ii L LAMP試劑盒中的檢測溶液進行LAMP，LAMP反應程序為： 60°C?65°C，50-70min，擴增產物進行顏色變化的觀察。
【文檔編號】C12Q1/68GK104372099SQ201410699942
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月27日 優先權日:2014年11月27日
【發明者】戴婷婷, 吳小芹, 葉建仁 申請人:南京林業大學