抑制立枯絲核菌的微生物制劑的制備方法
【專利摘要】本發明屬于微生物發酵，特別是指一種抑制立枯絲核菌的微生物制劑的制備方法。在有氧條件下，在含有碳源、氮源及無機組分的無菌發酵培養基中培養哈茨木霉ACCC30371，發酵培養基采用有效量的蔗糖、氯化鉀、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、消泡劑、水組成，將發酵制備的發酵液過濾、濃縮，將濃縮液與過濾得到的菌絲混合后制成微生物制劑。本發明解決了現有技術存在的化學農藥防治中化學農藥對環境的污染問題，具有制備的微生物制劑可有效抑制立枯絲核菌的菌核萌發，經試驗可降低棉花立枯病的發病率等優點。
【專利說明】抑制立枯絲核菌的微生物制劑的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物發酵，特別是指一種抑制立枯絲核菌的微生物制劑的制備方 法。
【背景技術】
[0002] 棉花立枯病是棉花苗期的主要病害之一，其病原菌為立枯絲核菌（Rhizo ctonia solani),立枯絲核菌（Rhizoctonia solani)是一種嚴重為害農作物的土傳病原菌，可引 起稻麥棉和多種蔬菜瓜果等的病害，一般用化學農藥防治。但化學農藥對環境的污染問題 至今很難有效地解決。生物方法進行防治既能達到防治植物病害的作用，又幾乎不存在環 境污染的問題，是當前大力提倡和發展的防治方法。立枯絲核菌的胞壁中含有幾丁質，利用 抗生菌產的幾丁質酶的特點可以抑制真菌生長，在防治植物病蟲害等方面有非常重要的 作用和意義。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于提供一種抑制立枯絲核菌的微生物制劑的制備方法，采用該方 法所制備的微生物制劑能有效抑制立枯絲核菌菌絲生長和菌核萌發，降低棉花立枯病的發 病率。
[0004] 本發明的整體技術構思是：
[0005] 抑制立枯絲核菌的微生物制劑的制備方法，包括在有氧條件下，在含有碳源、氮源 及無機組分的無菌發酵培養基中培養哈茨木霉（Trichoderma harzianum)ACCC30371，培養 過程還包括如下步驟：
[0006] 發酵培養基采用如下質量百分含量的組分組成：
[0007] 蔗糖6 % -8%，氯化鉀0.04 % -0.06%，硝酸鈉0.6 % -0.8%，磷酸氫二鉀 0? 04% -0? 06%，硫酸鎂 0? 04% -0? 06%，磷酸二氫鉀 0? 04% -0? 06%，消泡劑< 0? 01%，余 量為水；
[0008] 發酵的條件是：
[0009] 裝料系數65-75 %，培養溫度為26-28 °C，攪拌速度為240轉/分，通風量為1 : 0. 3vvm，罐壓為0. 5公斤/厘米2,接種量為0. 08-0. 1 %，培養時間為68-72小時；
[0010] 將發酵制備的發酵液過濾、濃縮，將濃縮液與過濾得到的菌絲混合后制成微生物 制劑。
[0011] 本發明的具體技術內容還有：
[0012] 消泡劑優選采用聚醚類消泡劑。
[0013] 為進一步提高抑菌效果，優選的技術方案是，濃縮液與過濾后的菌絲按照質量比 為1:5的比例混合。
[0014] 所述的過濾采用板框壓濾，濃縮采用中空纖維柱。
[0015]為縮短發酵周期，常見且優選的技術實現方式是，將哈茨木霉ACCC30371擴大培 養后制成搖瓶種子，將搖瓶種子接種至無菌發酵培養基進行通氣培養。
[0016] 更為優選的技術實現方式如下：所述的擴大培養是將斜面菌種經擴大培養制成米 孢子，將米孢子擴大培養制成搖瓶種子。
[0017] 所述的斜面培養基采用如下質量百分含量的組分組成：
[0018]葡萄糖4% -6%;硝酸鈉0? 1% -0.3%，硫酸鎂0.04% -0.06%，磷酸氫二鉀 0? 05% -0? 15%，氯化鉀 0? 04% -0? 06%，硫酸鐵 0? 0005% -0? 0015%，瓊脂 2% -2. 5%， 余量為水；
[0019] 斜面菌種的培養條件如下：
[0020] 溫度為26-28 °C，培養時間7-8天。
[0021] 所述的將斜面菌種經擴大培養制成米孢子包括如下工藝步驟：
[0022] 米孢子培養基的制備方法如下：
[0023] 將新鮮小米用清水洗凈盛于淺盤中，加入占小米質量百分含量為75% -85%的 水，置沸水鍋中蒸至水分吸干，取出晾散；
[0024] 取小米質量三分之一的新鮮麩皮，加入占麩皮質量95% -105%的水拌勻，與蒸好 的小米混配均勻制成米孢子培養基；
[0025] 將上述米孢子培養基分裝入1000毫升三角瓶中，每瓶裝55-65克；
[0026] 將斜面菌種中的孢子用無菌水洗下后分別接種于3-6支三角瓶中，或者用接種鏟 接種；
[0027] 培養條件如下：
[0028] 溫度為26_28°C，培養時間7-8天，每天搖瓶一次，使三角瓶中的培養物料不結塊。
[0029] 本發明所取得的實質性特點和顯著的技術進步在于：
[0030] 申請人:經過對發酵條件及培養基組成進行科學的選配，所制備的微生物制劑對立 枯絲核菌菌絲生長抑制率達88. 1%，菌核萌發抑制率為77%，盆栽試驗用發酵液原液施用 防病效果可達70%。
【具體實施方式】
[0031] 以下結合實施例對本發明做進一步描述，但不作為對本發明的限定，本發明的保 護范圍以權利要求記載的內容為準，任何依據說明書做出的等效技術手段替換，均不脫離 本發明的保護范圍。
[0032] 實施例1
[0033]抑制立枯絲核菌的微生物制劑的制備方法，包括在有氧條件下，在含有碳源、氮源 及無機組分的無菌發酵培養基中培養哈茨木霉（Trichoderma harzianum)ACCC30371，培養 過程還包括如下步驟：
[0034] 發酵培養基采用如下質量百分含量的組分組成：
[0035]蔗糖6 %，氯化鉀0? 04 %，硝酸鈉0? 6 % 8 %，磷酸氫二鉀0? 04 %，硫酸鎂0? 04 %，磷酸二氫鉀〇. 04%，聚醚類消泡劑< 0. 01 %，余量為水；
[0036] 發酵的條件是：
[0037] 裝料系數65%，培養溫度為26°C，攪拌速度為240轉/分，通風量為1 :0. 3vvm，罐 壓為0. 5公斤/厘米2,接種量為0. 08%，培養時間為72小時；
[0038] 將發酵制備的發酵液過濾、濃縮，將濃縮液與過濾得到的菌絲混合后制成微生物 制劑。
[0039] 濃縮液與過濾后的菌絲按照質量比為1:5的比例混合。
[0040] 所述的過濾采用板框壓濾，濃縮采用中空纖維柱。
[0041] 將哈茨木霉ACCC30371擴大培養后制成搖瓶種子，將搖瓶種子接種至無菌發酵培 養基進行通氣培養。
[0042] 所述的擴大培養是將斜面菌種經擴大培養制成米孢子，將米孢子擴大培養制成搖 瓶種子。
[0043] 所述的斜面培養基采用如下質量百分含量的組分組成：
[0044]葡萄糖4%;硝酸鈉0? 1%，硫酸鎂0.04%，磷酸氫二鉀0.05%，氯化鉀0.04%， 硫酸鐵0. 0005 %，瓊脂2 %，余量為水；
[0045] 斜面菌種的培養條件如下：
[0046]溫度為26°C，培養時間8天。
[0047] 所述的將斜面菌種經擴大培養制成米孢子包括如下工藝步驟：
[0048] 米孢子培養基的制備方法如下：
[0049] 將新鮮小米用清水洗凈盛于淺盤中，加入占小米質量百分含量為75% -85%的 水，置沸水鍋中蒸至水分吸干，取出晾散；
[0050] 取小米質量三分之一的新鮮麩皮，加入占麩皮質量95% -105%的水拌勻，與蒸好 的小米混配均勻制成米孢子培養基；
[0051] 將上述米孢子培養基分裝入1000毫升三角瓶中，每瓶裝55-65克；
[0052] 將斜面菌種中的孢子用無菌水洗下后分別接種于3-6支三角瓶中，或者用接種鏟 接種；
[0053] 培養條件如下：
[0054] 溫度為26°C，培養時間8天，每天搖瓶一次，使三角瓶中的培養物料不結塊。
[0055] 其中較為優選的實現方式是，所述的擴大培養是將斜面菌種直接制成克氏瓶種 子。
[0056] 實施例2
[0057] 本實施例與實施例1的區別在于：
[0058] 發酵培養基采用如下質量百分含量的組分組成：
[0059] 蔗糖8 %，氯化鉀0. 06 %，硝酸鈉0. 8 %，磷酸氫二鉀0. 06 %，硫酸鎂0. 06 %，磷酸 二氫鉀0. 06 %，聚醚類消泡劑< 0. 01%，余量為水；
[0060] 發酵的條件是：
[0061] 裝料系數75%，培養溫度為28°C，攪拌速度為240轉/分，通風量為1 :0. 3vvm，罐 壓為0. 5公斤/厘米2,接種量為0. 1%，培養時間為68小時；
[0062] 所述的斜面培養基采用如下質量百分含量的組分組成：
[0063] 葡萄糖6%;硝酸鈉0.3%，硫酸鎂0.06%，磷酸氫二鉀0? 15%，氯化鉀0.06%， 硫酸鐵0.0015%，瓊脂2. 5%，余量為水；
[0064] 斜面菌種的培養條件如下：
[0065] 溫度為28°C，培養時間7天。
[0066] 將斜面菌種中的孢子用無菌水洗下后分別接種于3-6支三角瓶中；
[0067] 培養條件如下：
[0068] 溫度為28°C，培養時間7天，每天搖瓶一次，使三角瓶中的培養物料不結塊。
[0069] 實施例3
[0070] 本實施例與實施例1的區別在于：
[0071] 發酵培養基采用如下質量百分含量的組分組成：
[0072]蔗糖7 %，氯化鉀0. 05 %，硝酸鈉0. 7 %，磷酸氫二鉀0. 05 %，硫酸鎂0. 05 %，磷酸 二氫鉀0. 05 %，聚醚類消泡劑< 0. 01%，余量為水；
[0073] 發酵的條件是：
[0074] 裝料系數70%，培養溫度為27°C，攪拌速度為240轉/分，通風量為1 :0. 3vvm，罐 壓為0. 5公斤/厘米2,接種量為0. 09%，培養時間為70小時；
[0075] 所述的斜面培養基采用如下質量百分含量的組分組成：
[0076] 葡萄糖5%;硝酸鈉0? 2%，硫酸鎂0? 05%，磷酸氫二鉀0? 1%，氯化鉀0? 05%， 硫fe鐵0.001%，瓊脂2%，余量為水；
[0077] 斜面菌種的培養條件如下：
[0078]溫度為27°C，培養時間8天。
[0079] 將斜面菌種中的孢子用接種鏟分別接種于3-6支三角瓶中；
[0080] 培養條件如下：
[0081] 溫度為27°C，培養時間8天，每天搖瓶一次，使三角瓶中的培養物料不結塊。
[0082] 實施例4
[0083] 本實施例與實施例1的區別在于：
[0084] 發酵培養基采用如下質量百分含量的組分組成：
[0085] 蔗糖6 %，氯化鉀0. 06 %，硝酸鈉0. 8 %，磷酸氫二鉀0. 05 %，硫酸鎂0. 06 %，磷酸 二氫鉀0. 05 %，聚醚類消泡劑< 0. 01%，余量為水；
[0086] 發酵的條件是：
[0087] 裝料系數75%，培養溫度為28°C，攪拌速度為240轉/分，通風量為1 :0. 3vvm，罐 壓為0. 5公斤/厘米2,接種量為0. 08-0. 1 %，培養時間為68小時；
[0088] 所述的斜面培養基采用如下質量百分含量的組分組成：
[0089] 葡萄糖5 %;硝酸鈉0. 2 %，硫酸鎂0. 06 %，磷酸氫二鉀0. 08 %，氯化鉀0. 05 %， 硫酸鐵0. 0005%，瓊脂2. 2%，余量為水；
[0090] 斜面菌種的培養條件如下：
[0091] 溫度為27°C，培養時間7天。
[0092] 將斜面菌種中的孢子用無菌水洗下后分別接種于3-6支三角瓶中；
[0093] 培養條件如下：
[0094] 溫度為28°C，培養時間7天，每天搖瓶一次，使三角瓶中的培養物料不結塊。
[0095] 實施例5
[0096]本實施例與實施例1的區別在于：
[0097] 發酵培養基采用如下質量百分含量的組分組成：
[0098]蔗糖7 %，氯化鉀0. 05 %，硝酸鈉0. 7 %，磷酸氫二鉀0. 05 %，硫酸鎂0. 06 %，磷酸 二氫鉀0. 05 %，聚醚類消泡劑< 0. 01%，余量為水；
[0099] 發酵的條件是：
[0100] 裝料系數70%，培養溫度為28°C，攪拌速度為240轉/分，通風量為1 :0. 3vvm，罐 壓為0. 5公斤/厘米2,接種量為0. 1%，培養時間為70小時；
[0101] 所述的斜面培養基采用如下質量百分含量的組分組成：
[0102] 葡萄糖6 % ;硝酸鈉0. 1%%，硫酸鎂0.05 %，磷酸氫二鉀0.08%，氯化鉀 0. 05%，硫酸鐵0. 0008%，瓊脂2. 5%，余量為水；
[0103] 斜面菌種的培養條件如下：
[0104] 溫度為28°C，培養時間7天。
[0105] 將斜面菌種中的孢子用接種鏟分別接種于3-6支三角瓶中；
[0106] 培養條件如下：
[0107] 溫度為28°C，培養時間7天，每天搖瓶一次，使三角瓶中的培養物料不結塊。
[0108] 申請人:對實施例1-5中制備的微生物制劑進行了如下試驗，結果如下：
[0109] 一、菌絲生長的影響
[0110] 將發酵液配置成濃度為20U ? ml/1的溶液，用無菌水進行稀釋，稀釋倍數分別為5 倍、10倍、20倍。在PDA平板上滴加2mL不同酶活的幾丁質酶提取液，在平板上涂布均勻， 在平板中央移入一塊直徑5mm培養3天，生長良好的立枯絲核菌。抑菌率=[(對照菌落直 徑一處理菌落直徑）/對照菌落直徑]X 100%。結果見表1。
[0111] 表1不同酶活幾丁質酶對立枯絲核菌菌絲生長的影響
[0112]
【權利要求】
1. 抑制立枯絲核菌的微生物制劑的制備方法，包括在有氧條件下，在含有碳源、氮源及 無機組分的無菌發酵培養基中培養哈茨木霉（Trichoderma harzianum)ACCC30371，其特征 在于培養過程還包括如下步驟： 發酵培養基采用如下質量百分含量的組分組成： 蔗糖6 % -8 %，氯化鉀0? 04 % -0? 06 %，硝酸鈉0? 6 % -0? 8 %，磷酸氫二鉀 0.04% -0.06%，硫酸鎂 0.04% -0.06%，磷酸二氫鉀 0.04% -0.06%，消泡劑<0.01%，余 量為水； 發酵的條件是： 裝料系數65 % -75 %，培養溫度為26°C -28°C，攪拌速度為240轉/分，通風量為1 : 0. 3vvm，罐壓為0. 5公斤/厘米2,接種量為0. 08% -0. 1%，培養時間為68-72小時； 將發酵制備的發酵液過濾、濃縮，將濃縮液與過濾得到的菌絲混合后制成微生物制劑。
2. 根據權利要求1所述的抑制立枯絲核菌的微生物制劑的制備方法，其特征在于消泡 劑選用聚醚類消泡劑。
3. 根據權利要求1所述的抑制立枯絲核菌的微生物制劑的制備方法，其特征在于濃縮 液與過濾后的菌絲按照質量比為1:5的比例混合。
4. 根據權利要求1或3中任一項所述的抑制立枯絲核菌的微生物制劑的制備方法，其 特征在于所述的過濾采用板框壓濾，濃縮采用中空纖維柱。
5. 根據權利要求1所述的抑制立枯絲核菌的微生物制劑的制備方法，其特征在于還包 括如下工藝步驟：將哈茨木霉ACCC30371擴大培養后制成搖瓶種子，將搖瓶種子接種至無 菌發酵培養基進行通氣培養。
6. 根據權利要求5所述的抑制立枯絲核菌的微生物制劑的制備方法，其特征在于所述 的擴大培養是將斜面菌種經擴大培養制成米孢子，將米孢子擴大培養制成搖瓶種子。
7. 根據權利要求6所述的所述的抑制立枯絲核菌的微生物制劑的制備方法，其特征在 于所述的斜面培養基采用如下質量百分含量的組分組成： 葡萄糖4 % -6% ;硝酸鈉0. 1 % -0.3%，硫酸鎂0.04 % -0.06%，磷酸氫二鉀 0? 05% -0? 15%，氯化鉀 0? 04% -0? 06%，硫酸鐵 0? 0005% -0? 0015%，瓊脂 2% -2. 5%， 余量為水； 斜面菌種的培養條件如下： 溫度為26°C -28°C，培養時間7-8天。
8. 根據權利要求6或7中任一項所述的所述的抑制立枯絲核菌的微生物制劑的制備方 法，其特征在于所述的將斜面菌種經擴大培養制成米孢子包括如下工藝步驟： 米孢子培養基的制備方法如下： 將新鮮小米用清水洗凈盛于淺盤中，加入占小米質量百分含量為75% -85 %的水，置 沸水鍋中蒸至水分吸干，取出晾散； 取小米質量三分之一的新鮮麩皮，加入占麩皮質量95% -105%的水拌勻，與蒸好的小 米混配均勻制成米孢子培養基； 將上述米孢子培養基分裝入1000毫升三角瓶中，每瓶裝55-65克； 將斜面菌種中的孢子用無菌水洗下后分別接種于3-6支三角瓶中，或者用接種鏟接 種； 培養條件如下： 溫度為26°C -28°C，培養時間7-8天，每天搖瓶一次，使三角瓶中的培養物料不結塊。
【文檔編號】C12R1/885GK104430549SQ201410673381
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月21日 優先權日:2014年11月21日
【發明者】李賓, 秦艷梅, 劉春卯, 馬清河, 高慶華, 劉麗娜, 李領頗, 鄭翔, 羅同陽, 吳芳彤 申請人:河北省微生物研究所