一種發酵法制備氨基寡糖素的方法
【專利摘要】一種發酵法制備氨基寡糖素的方法,將產殼聚糖酶假單胞菌按0.1~10×106個/mL接種于發酵培養基中,在發酵溫度25~30℃的條件下,發酵培養2~4天,分離提純,既得氨基寡糖素;其中,所述發酵培養基每升組分包括:殼聚糖10~20g、NaCl 0.1~1g、KH2PO4 0.1~1g、微量金屬離子化合物0.005~0.05g、表面活性劑0.1~1g,水定容至1L,pH5.5~7.0。本發明在大量實驗的基礎上,選擇合適產殼聚糖酶假單胞菌,優化培養基和發酵條件,能夠高產、高效地制備氨基寡糖素,反應條件溫和,容易控制,并避免了寡聚體的破壞。
【專利說明】一種發酵法制備氨基寡糖素的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種發酵法制備氨基寡糖素的方法。
【背景技術】
[0002]氨基寡糖素(殼寡糖)是指0-氨基葡萄糖以0-1,4糖苷鍵連接的低聚糖。殼寡糖可改變土壤微生物區系,促進有益微生物的生長而抑制一些植物病原菌;可刺激植物生長,使農作物和水果蔬菜增產豐收;可誘導植物的抗病性,對多種真菌、細菌和病毒產生免疫和殺滅作用,對小麥花葉病、棉花黃萎病、水稻稻瘟病、番茄疫病等病害具有良好的防治作用。同時,殼寡糖對多種植物病原菌具有一定程度的直接抑制作用。殼寡糖在應用上具有微量
級〉、高效、低成本、無公害等特點,對我國農業可持續性發展具有重要意義。目前,氨基寡糖素殺菌農藥已經在我國進行了大面積的推廣應用,對我國農業的可持續性發展具有重要意義。
[0003]現常用的氨基寡糖素的制備方法有采用酸降解殼聚糖和甲殼素等或者采用酶降解殼聚糖和甲殼素等。采用酸降解殼聚糖和甲殼素等,由于反應條件難控制,并且提純困難,成本高。而采用酶降解殼聚糖和甲殼素等,需要先行制備酶,成分高。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于克服現有技術的不足,提供一種高效、高產的制備氨基寡糖素的方法。
[0005]本發明是這樣實現的:
[0006]一種發酵法制備氨基寡糖素的方法,將產殼聚糖酶假單胞菌按0.1?10乂106個71111接種于發酵培養基中,在發酵溫度25?301:的條件下,發酵培養2?4天,分離提純,既得氨基寡糖素;
[0007]其中,所述發酵培養基每升組分包括:殼聚糖10?20@、版0.1?1邑、狃2?040^ 1?18、微量金屬離子化合物0.005?0.058、表面活性劑0.1?18,水定容至11,口!15.5 ?7.0。
[0008]優選地,產殼聚糖酶假單胞菌的接種量為1?〖X 106個/此。
[0009]優選地,發酵溫度為27?28。〇。
[0010]優選地,發酵培養時間為3天。
[0011]優選地,所述發酵培養基每升組分中含殼聚糖10-158。
[0012]優選地,所述微量金屬離子化合物為能提供胞2\ 2!12\ 032\ ?63\ ^13\附2+或^)2+的化合物中的一種或多種。
[0013]優選地,所述發酵培養基每升組分中含表面活性劑0.2?0.58。
[0014]其中,所述為表面活性劑用于改變培養基表面張力,可以為改變液體表面張力的常用表面活性劑,例如吐溫、脂肪醇聚氧乙烯醚(仙)等。
[0015]優選地,所述表面活性劑為吐溫20或吐溫80。
[0016]優選地,所述產殼聚糖酶假單胞菌為假單胞菌!!3。
[0017]本發明在大量實驗的基礎上,選擇合適產殼聚糖酶假單胞菌,優化培養基和發酵條件,能夠高產、高效地制備氨基寡糖素,反應條件溫和,容易控制,并避免了寡聚體的破壞。
【具體實施方式】
[0018]下面結合具體的實施例對本發明做進一步地描述,以更好地理解本發明。
[0019]實施例1
[0020]取假單胞菌斜面培養菌,按5 X 106個接種于發酵培養基中,在發酵溫度271的條件下,發酵培養3天,離心,取上清液,上清液即為含氨基寡糖素的溶液,進一步分離提純,既得氨基寡糖素;
[0021〕 其中,所述發酵培養基每升組分包括:殼聚糖108、0.58、狃2?0辦58、?63040丨018、吐溫20 0.58,水定容至11,邱6.5。
[0022]將上清液在沸水浴保持501!!,過濾,濾液用鐵氰化鉀測定還原糖,以還原糖計氨基寡糖素的含量經檢測,氨基寡糖素的含量為15.2 V 11101加1。
[0023]實施例2?4
[0024]實施例2?4與實施例1的不同之處,在于假單胞菌!13的接種量不同,分別為
0.1X10^個/01IX 10 6個/11^和10父106個/111匕經檢查,發酵培養后的上清液中氨基寡糖素的含量分別為 3.8 V11101/1111、10.3 V11101/1111 和 8.1 1^ 11101/11110
[0025]實施例5?7
[0026]實施例5?7與實施例1的不同之處,在于發酵溫度不同,分別為251^281和301。經檢查,發酵培養后的上清液中氨基寡糖素的含量分別為5.46 1111101/1111 矛口 7.9 V11101/1111。
[0027]實施例8?9
[0028]實施例8?9與實施例1的不同之處,在于發酵培養時間不同,分別為2天和4天。經檢查,發酵培養后的上清液中氨基寡糖素的含量分別為11.41111101/1111和13.2 1111101/11110
[0029]實施例10?12
[0030]實施例10?12與實施例1的不同之處,在于發酵培養基中殼聚糖的含量不同,每升發酵培養基分別含有128、158和208。經檢查,發酵培養后的上清液中氨基寡糖素的含量分別為14.8 1111101/1111,13.5^11101/1111和10.2 V 11101加1。從產率上看,殼聚糖濃度越大越不利于氨基寡糖素的生產,這可能是殼聚糖濃度大,培養液的粘度也大,從而影響了菌種的生長。
[0031]實施例13?20
[0032]實施例13?20與實施例1的不同之處,實施例1中的?6304分別用能提供^2\ 0112\ 082\ ?63\ ^13\附#或(--的化合物替換。經檢查,發酵培養后的上清液中氨基寡糖素的含量分別為 14.61^ 11101/1111、14 81^ 11101/1111、14 21^ 11101/1111、14 51^ 11101/1111、13.8 60 011101/1111 矛口 13.5 011101/11110
[0033]實施例21?25
[0034]實施例21?25與實施例1的不同之處,在于發酵培養基中表面活性劑種類和含量不同,每升發酵培養基分別含有吐溫20 0.18、吐溫20 18、吐溫80 0.4、吐溫80 和吐溫80 0.58。經檢查,發酵培養后的上清液中氨基寡糖素的含量分別為10.5^11101/1111、6.7 V8 V9 V 11101/1111 矛口 15.0 V 11101/1111。
[0035]以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述,但其只是作為范例,本發明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言,任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的范疇之中。因此,在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和修改,都應涵蓋在本發明的范圍內。
【權利要求】
1.一種發酵法制備氨基寡糖素的方法,其特征在于,將產殼聚糖酶假單胞菌按0.1?1X 16個/mL接種于發酵培養基中,在發酵溫度25?30°C的條件下,發酵培養2?4天,分離提純,既得氨基寡糖素; 其中,所述發酵培養基每升組分包括:殼聚糖10?20g、NaCl 0.1?lg、KH2PO40.1?lg、微量金屬離子化合物0.005?0.05g、表面活性劑0.1?lg,水定容至lL,pH5.5?7.0。
2.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,產殼聚糖酶假單胞菌的接種量為I?5 X 16個 /mL。
3.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,發酵溫度為27?28V。
4.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,發酵培養時間為3天。
5.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述發酵培養基每升組分中含殼聚糖10-15go
6.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述微量金屬離子化合物為能提供Fe2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+、Al3+、Ni2+或 Co 2+的化合物中的一種或多種。
7.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述發酵培養基每升組分中含表面活性劑 0.1 ?0.5go
8.根據權利要求7所述的方法,其特征在于,所述表面活性劑為吐溫20或吐溫80。
9.根據權利要求1?8中任意一項所述的方法,其特征在于,所述產殼聚糖酶假單胞菌為假單胞菌H3。
【文檔編號】C12P19/26GK104480167SQ201410667350
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月20日 優先權日:2014年11月20日
【發明者】張學文 申請人:海南金海岸生物技術研究所