黃瓜CsMADS1基因過表達載體及其應用的制作方法

黃瓜CsMADS1基因過表達載體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一個黃瓜E族基因CsMADS1過表達載體及其在花器官改造中的應用，屬于生物【技術領域】。該載體為含有35S啟動子和黃瓜E族基因CsMADS1植物表達載體。在擬南芥中過量表達CsMADS1，獲得的CsMADS1轉基因植株不能正常抽苔開花，頂端分生組織處異位生長出許多簇生的針狀葉片或退化的小花分枝。利用本發明的載體可以調控作物的開花時間，培育特定的轉基因植株，具有一定的農業價值和觀賞價值。
【專利說明】黃瓜CsMADSI基因過表達載體及其應用

【技術領域】
[0001]本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及一種黃瓜E類基因CsMADSI過表達載體及其應用。

【背景技術】
[0002]開花是高等植物由營養生長向生殖生長轉變的一個非常重要的發育過程，在合適的時間開花對大多數植物的生存和成功繁衍極為重要。開花時間的調控是一個非常復雜的過程，受自身遺傳因子和外界環境因素兩方面的共同影響。迄今，已經探明包括光周期、春化、溫度、赤霉素、自主以及年齡等6條遺傳途徑參與調控開花時間。
[0003]MADS-box基因是真核生物中一類重要的轉錄調控因子，在生長發育調控和信號轉導過程中發揮著重要作用,在動物、植物、真菌中都存在。在植物中，MADS-box基因的分布幾乎遍布整個植物界，除在雙子葉植物擬南芥、金魚草、葡萄、矮牽牛和楊樹等植物中廣泛存在外，在單子葉的水稻、玉米、小麥、高粱等中也大量分布。MADS-box基因一般以基因家族的形式存在，在植物生長發育不同階段如苗期、花期、在植物的不同部位，如營養器官根、莖、葉和生殖器官花、果實、種子中MADS-box基因都有不同程度的表達，并在其中起重要的調控作用。
[0004]MADS-box基因作為一類非常重要的轉錄調控因子，在開花植物中，這些蛋白在廣闊的范圍內具有重要的生物學意義。目前的研究表明，MADS-box除在花的發育上的重要作用外，其在調控開花早晚方面也具有一定的作用，目前這方面的實驗依據主要是對模式植物擬南芥和金魚草的研究。目前分離出的促進開花的MADS-box基因包括AGL20、AGL24、C0和SOCl，抑制開花的FLC、FLM、FR1、SVP等。
[0005]Borner等通過轉座子標簽的實驗發現,agl20的突變體會推遲開花,也發現AGL20受GA調控，而且與誘導開花的不同途徑之間相互聯系著，并發現在不依賴光周期長短的條件下AGL20是開花的必需條件。kim等也從十字花科植物中分離出AGL20基因，當其過量表達會使得植物開花提早很長一段時間，而該反義基因轉化植物后出現開花嚴重推遲的現象。Yu等發現AGL24可以調控兩個與開花時間相關的基因SOCl和FT及花序分裂基因LFY，通過RNAi技術，使得AGL24的量減少或者消失，出現了開花推遲的現象，而AGL24的過量表達又會使得開花提前。Onouchi等研究了 CO對植物開花時間的影響，把CO與35S啟動子相連后轉到擬南芥中，發現無論在長日照還是在短日照下，轉基因植物的開花都會提前。Moon等發現在短日照下，gal-3突變體植物不開花，但如果采取一定的措施使得SOCl的表達水平上升，植物會開花。FLC是第一個被鑒定出來的開花抑制子，在擬南芥中會抑制開花，且其抑制的程度與其劑量成正比。FLM的氨基酸序列與FLC的序列的同源性很高，也是一類開花抑制子。Scortecci等在擬南芥中通過使用反向遺傳學的方法鑒定出了由于兩個FLM的T-DNA插入突變體,含有這兩類插入位點的植株都會表現早花。Clarke等在擬南芥中通過用QTL的方法發現FRI是開花推遲的主要抑制基因。Michaels等發現在野生型的晚花植物中，FRI會提高FLC的水平，而自主開花途徑和春化作用會使FLC的水平下降。Hartmann等通過轉座子標簽的方法克隆到SVP基因，分析它的轉錄活性后發現其有不同的轉錄物，僅局限于營養器官和花原基中，沒有在成熟的花中發現。SVP突變體植株會出現早花是由于營養生長期被縮短而造成的，而且純合的突變體比雜和的突變體植株開花更早，這說明SVP不但與開花的早晚相關，而且與其存在著劑量關系，認為SVP的功能就是使植物的營養生長時期變長，而使得植物的生殖生長時期推遲。
[0006]黃瓜屬葫蘆科植物，廣泛分布于中國各地，為主要的溫室產品之一。我國瓜類作物的栽培面積在4，000萬畝以上，僅黃瓜的產量就占世界的一半。對黃瓜開花相關基因的研究具有一定的理論和實踐意義。最近黃瓜全基因組測序的完成標志著黃瓜功能基因組的研究進入了一個全新的階段。盡管目前與黃瓜重要經濟性狀相關的基因正在逐漸被克隆，但與黃瓜開花相關基因的研究還鮮有報道。
[0007]進化樹的分析發現，CsMADSI與E功能基因具有較高的同源性，可能歸屬于E功能基因，但其功能并不清楚，值得進一步的研究。我們克隆出CsMADSI基因并將其連到含35S啟動子的表達載體PCAMBIA1301上，轉化擬南芥后發現，獲得的CsMADSI轉基因植株不能正常抽苔開花，頂端分生組織處異位生長出許多簇生的針狀葉片或退化的小花分枝。利用本發明的載體可以調控作物的開花時間，培育特定的轉基因植株，具有一定的農業價值和觀賞價值。


【發明內容】

[0008]本發明的目的在于提供一種黃瓜CsMADSI基因花特異表達載體及及其在花器官改造中的應用，該載體含有黃瓜E族基因CsMADSI，基因的上游連有35S啟動子。
[0009]本發明的上述植物表達載體為pCAMBIAl301-CsMADSI，由下述方法構建而成:
(O根據 CuGI (http://cucumber, genomics, org.cn/page/cucumber/index, jsp)上公布的黃瓜 CsMADSl 序列(Csa004117)，設計兩端引物:CsMADSl_F:5’-aaaaCCATGGATGGGAAGAGGAAGAGTAG-3’(含 NcoI(含
BglII 位點)。
[0010]以黃瓜花蕾的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，獲得CsMADSl全長。
[0011](2)回收CsMADSl的cDNA全長，將其連接到pMD18載體上，采用堿裂解法提取質粒DNA,通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質粒pMD18-CsMADSl。
[0012](3)使用 NcoI 和 BglII 酶切 pMD18_CsMADSl，回收 CsMADSl 片段，同時用NcoI和BglII酶切pCAMBIA1301，回收后連接，轉化感受態細胞，獲得植物表達載體pCAMBIAl301-CsMADSI。
[0013]本發明的另一目的是公開黃瓜CsMADSl在調控開花時間中的應用，該基因導入擬南芥后，獲得的CsMADSl轉基因植株不能正常抽苔開花，頂端分生組織處異位生長出許多簇生的針狀葉片或退化的小花分枝。利用本發明的載體可以調控作物的開花時間，培育特定的轉基因植株，具有一定的農業價值和觀賞價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為本發明中CsMADSl全長擴增后的電泳示意圖；
圖2為本發明表達載體pCAMBIAl301-CsMADSI的NcoI和BglII雙酶切電泳檢測圖； 圖3為轉基因植株的PCR鑒定圖；
圖4為過量表達CsMADSl的轉基因擬南芥植株的表達分析圖，其中WT為野生型，1-3為轉基因植株；
圖5為過量表達CsMADSl的轉基因擬南芥表型分析。其中(A)為野生型，(B)和(C)為轉基因植株。

【具體實施方式】
[0015]下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，這些實施例僅用于舉例說明本發明，而不對本發明的范圍構成任何限制。
[0016]實施例中所涉及的試劑主要分為分子生物學實驗試劑、各種限制性內切酶、TaqDNA聚合酶、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為日本寶生物工程有限公司(大連)產品，質粒提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取試劑購自invitrogen公司，高保真酶KOD-Plus購于Τ0Υ0Β0公司，DNase I購于天根生化科技(北京)有限公司，DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。其余試劑均為國產分析純；儀器均為分子生物學以及基因工程實驗室常用儀器。所有引物序列均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本發明實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
[0017]實施例1:表達載體pCAMBIAl301-CsMADSI的構建
(O 弓丨物設計:根據 CuGI (http://cucumber, genomics, org.cn/page/cucumber/index, jsp)上公布的黃瓜CsMADSl序列(Csa004117),設計兩端引物:
CsMADS1-F:5，-aaaaCCATGGATGGGAAGAGGAAGAGTAG-3’(含 NcoI 位點)
CsMADS1-R:5，-aaaaAGATCTTCAAAGCATCCAACCAGGGAG-3’(含 BglII 位點)。
[0018](2)黃瓜花蕾總RNA的提取
所用黃瓜品種為華北型黃瓜。取長度約0.7 mm的花蕾I mg，取材后立刻凍到液氨中，米用 TRIzol (Invitrogen,USA)試劑法提取總 RNA:加 1.5 ml Trizol 后，室溫放置 5 min,使其充分裂解。12，OOOrpm離心5 min，棄沉淀。加200 ul氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min。4°C 12, OOOg離心15 min。吸取上層水相，至另一離心管中。加0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置30 min。4°C 12, OOOg離心10 min，棄上清。用I ml 75%乙醇洗滌2次沉淀。4°C 8, OOOg 離心 5 min,棄上清。室溫晾干 10 min。用 50 uL H2O (Rnase free)溶解 RNA。
[0019](3)黃瓜花蕾總cDNA第一鏈的合成
黃瓜花蕾RNA用DNase I處理后用于以Oligo (dT) 18為引物的反轉錄:取RNA 15 uL，加Oligo (dT)18 luL，混勻，70°C保溫5min，立即冰水浴，稍離心，依次加入10XM-MLV Buffer 2uL、dNTP (1mM) I uL、RNasin (40U/uL) I uL、M-MLV (200U/uL) luL，總體積 20 uL，混勻，42°C保溫 60min，95°C 1min 滅活 M-MLV 酶活性，_20°C保存。
[0020](4) CsMADSl 基因的擴增
設計特異性引物:CsMADSl-F:5’-aaaaCCATGGATGGGAAGAGGAAGAGTAG -3’(含 NcoI 位點)CsMADS1-R:5’-aaaaAGATCTTCAAAGCATCCAACCAGGGAG-3’(含 BglII 位點)，以第一鏈產物為模板，用長片段、高保真酶KOD-PIus進行PCR擴增，PCR反應條件為:94°C 5 min ；94°C30 s ；56°C 30 s ；68°C 3.0 min，40 個循環；68°C 5 min。PCR 產物用 1.5% 瓊脂糖進行電泳檢測，擴增片段大小約741bp，與預期大小一致(圖1)。
[0021](5) CsMADSl片段的膠回收
對PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的片段，使用膠回收試劑盒，按照試劑盒說明書對目的片段進行回收。
[0022](6) CsMADSl 片段加尾
取1.5 ml滅菌的eppendorf管,依次加入回收的PCR產物14μ 1、10X Taq DNA聚合酶緩沖液 2 μ l、10mM dNTP 2 μ I, Taq DNA 聚合酶 2 μ I ;72°C處理 45 min ;先加 0.18 mL無菌水，再加20 μ I 3Μ醋酸鈉，混勻，最后加入2倍體積的無水乙醇，-20°C沉淀60 min,12，OOOrpm, 4°C離心lOmin。棄上清，75%乙醇洗滌沉淀2次。DNA晾干后加入20 μ L無菌水溶解沉淀，溶解的DNA置于_20°C保存備用。
[0023](7) CsMADSl片段的T/A克隆和測序
將回收片段連接到PMD18載體上，其具體步驟為:向1.5 ml離心管中分別加入:CsMADSl 片段的 cDNA 5 μ 1、pMD18 載體 0.5 μ 1、1XT4 DNA 連接酶緩沖液 I μ 1，Τ4 DNA連接酶1μ 1，加無菌水至10μ 1，用封口膜封好；置于16°C連接4-6h。將100μ I感受態腸桿菌Ε.coli DH5a加入連接體系中混勻；混合液冰浴30 min，42°C熱刺激90 s后，冰浴5min;加入800μ1 LB液體培養基，37 °C、200 rpm搖床培養45min使菌體復蘇；培養結束后，常溫3，000 rpm離心2 min收集菌體；在超凈臺上吸去上清,剩余約0.1 ml時,使用移液槍混勻，接入帶有Amp抗性的LB固體平板上，用無菌三角棒涂布均勻；37°C過夜培養；挑取菌落接種到帶有Amp抗性的LB液體培養基中培養12h，收集菌體，采用質粒抽提試劑盒提取質粒。通過酶切檢測獲得的重組質粒pMD18-CsMADSl，具體方法為:向0.5 ml的離心管中分別加入:質粒 DNA (50ng/y I) 2 μ l.NcoI 0.5 u 1.BglII 0.5 u 1.10 X buffer (Κ)2μ I,使用無菌水補足20 μ I ;37°C反應4h ;然后將酶切正確的重組質粒pMD18-CsMADSl進行測序驗證插入基因的正確性。
[0024](8)表達載體 pCAMBIAl301-CsMADSI 的構建
使用NcoI和BglII對質粒pMD18-CsMADSl和pCAMBIA1301載體進行雙酶切，分別獲得5’端帶有NcoI和3’端帶有MII的CsMADSl片段和pCAMBIA1301載體，電泳后分別進行膠回收，16°C連接4-6h;將100μl感受態腸桿菌E.COli DH5 a加入6 μ I連接體系中混勻；混合液冰浴30min，42°C熱刺激90s后，冰浴5 min ;加入800 μ I LB液體培養基，37°C >200rpm搖床培養45min使菌體復蘇；培養結束后，常溫3，000 rpm離心I min收集菌體；在超凈臺上吸去上清，剩余約0.1 ml時,使用移液槍混勻,接入帶有Kan抗性的LB固體平板上，用無菌三角棒涂布均勻；37°C過夜培養；挑取菌落接種于LB液體+Kan的培養基，37°C、180rpm培養12h后，提取質粒。通過酶切檢測獲得的重組質粒pCAMBIA1301_CsMADSl，具體方法為:向0.5 ml的離心管中分別加入:質粒DNA(50ng/μ 1)2 μ l、NcoI 0.5 μ l、Bgl II0.5 μ IUOXbuffer (K) 2 μ 1，使用無菌水補足20 μ I ;37°C反應4h ;經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，重組質粒pCAMBIAl301-CsMADSI可酶切出預期大小(741bp)的片段(圖2)。將酶切正確的重組質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序進行序列驗證(其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示)，最后獲得表達載體pCAMBIA1301-CsMADSl。
[0025]實施例2:pCAMBIA1301-CsMADSl轉農桿菌 GV3101 (I)農桿菌感受態細胞制備挑取農桿菌GV3101單菌落接種于5ml YEB培養基中，28°C搖培過夜，按1:100的比例接種于50 ml YEB培養基中擴培，28°C繼續培養約6_7h至0D600=0.4-0.6。將菌液置于冰上30min ；5, 000 rpm, 4°C離心 5min,棄上清，將菌體懸于 10 ml 0.15 M NaCl 中；5，000 rpm,4°C離心5min，棄上清，菌體用I ml 20 mM CaCl2,4°C )輕輕懸浮，每管200μ1分裝，或加入終濃度為20%的無菌甘油，-70°C保存。
[0026](2)農桿菌的轉化及鑒定
將10 μ I質粒DNA加入200 μ I農桿菌感受態中，混勻，冰浴30min，液氮冷凍3_5min，37°C水浴5min,加入I mlYEB培養基，28°C搖培3_4h。10，OOOrpm,室溫離心30s,棄上清，加入200 μ I YEB培養基重懸菌體，涂于YEB培養基上，28°C培養2天；堿裂解法提取農桿菌質粒DNA，酶切驗證。質粒再重新轉化大腸桿菌(DH5 α )，過夜培養后，挑取單菌落液體培養，提取質粒DNA，再用酶切鑒定。
[0027]實施例3:含pCAMBIA1301-CsMADSl的農桿菌GV3101轉化擬南芥 (I)擬南芥的種植
①所用的擬南芥為野生型擬南芥，為江西農業大學作物生理生態與遺傳育種重點實驗室保存。當年收獲的種子種植后4度春化72 h，隔年種子種植后春化24 h。然后轉入人工培養室中在相對濕度80%，恒溫20-24°C，光照強度80-200 μ mol/M2/S,光照周期為8 h黑暗、16 h光照培養。所用的土為3份蛭石，I份珍珠巖和2份黑土混合而成。
[0028]②將營養土用塑料盆裝好，在托盤里加入營養液，待營養土吸水潮濕后，開始點種。
[0029]③將擬南芥的種子放在平鋪的紙上，用牙簽將擬南芥的種子點在土上。用保鮮膜蓋好，暗培養兩天，四天后揭掉保鮮膜正常培養。
[0030]④土稍干時可再澆一次營養液，以后澆水即可。若要做轉化，待抽薹2到3cm時，剪除頂花序，用營養液再澆灌一次。
[0031]⑤種子的收集:擬南芥完全成熟后，停止澆水待植株干燥后將擬南芥剪下放在一張干凈的光面紙上收集種子，盡量將雜物去干凈，便于篩選。
[0032](2)擬南芥的轉化和轉化子的篩選
①制備好已轉化了相應質粒的農桿菌菌液10 ml，在轉化前一天晚上，轉入大瓶培養過夜，第二天取出使用時農桿菌液0D600當在1.2到1.6之間。室溫5，000 rpm離心10min。棄上清，將農桿菌沉淀懸浮于相應體積的滲透培養基里，使0D600在0.8左右。
[0033]②先將植株上已長出的果莢及開放的花剪掉，再將農桿菌懸浮液直接噴灑至整個植株，主要噴灑在花序上。蓋上透明的塑料蓋子以保持濕度，移入恒溫室避光培養，第二天可開蓋，正常光照培養。
[0034]③一周后再噴灑一次，收種子，在相應的抗性1/2 MS平板上篩選轉化子。
[0035]④轉化子的篩選:種子消毒，先用70%乙醇浸泡10 min，在上述處理時要不時地使種子懸浮，并換一次70%乙醇。最后用無菌水洗四次。
[0036]⑤處理后的種子用Top agar (0.1%瓊脂水溶液)均勻涂布在相應的抗性固體篩選培養基表面，每塊150 mm直徑的平皿最多種1500棵。
[0037]⑥4°C春化2到3天，移入22°C恒溫室培養。將篩選出的轉化子長到合適的大小后移栽到土壤中。
[0038]實施例4:轉基因植株的鑒定和分析
(I)擬南芥DNA的提取
將適量的經篩選的擬南芥葉片放入1.5 ml的離心管中，加入400 μ I的SDS抽提緩沖液，用藍色小棒研磨成漿狀，加入等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，猛烈搖勻，12，000rpm，離心10 min。取上清至新的離心管中，加入2倍體積的無水乙醇和0.1倍體積的3M醋酸鈉(PH5.2)，劇烈混勻使DNA成團，放入_20°C沉淀2hr以上。隨后12，000 rpm,離心10 min。棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌一次后室溫晾干，加適量的TE或超純水溶解。
[0039](2)轉基因擬南芥植株的鑒定
以抽提的 DNA 為模板、使用引物 CsMADSl-Fl:GAATTCTTATGGAGCGGTGGAG GTTA 和CsMADSl-Rl:TCTAGATTCCAGTGGCTGAAAGAAGC 擴增 CsMADSl 片段，PCR 的 25 μ I 體系為:PCR緩沖液(10Χ)2.5μ l、Taq 0.5 μ l、cDNA 模板 2μ IUOmM dNTP 0.5 μ IUOyM CsMADS 1-FI引物I μ 1、10 μ M CsMADSl-Rl引物I μ 1、使用無菌水補足25 μ I。反應條件為:94°C5min,35個循環，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，72°C反應lOmin。檢測結果如圖3所示。抽提陽性植株花蕾的總RNA，反轉錄后合成cDNA第一鏈，以CsMADS1-FI和CsMADSl-Rl為引物進行RT-PCR分析，反應體系和程序同上。內參為CsACTIN基因，弓丨物序列為:CsACTIN_F:GACATTCAATGTGCCTGCTATG, CsACTIN-R: CATACCGATGAGAGATGGCTG, PCR 的 25 μ I 體系為:PCR緩沖液(10Χ)2.5μ I, Taq 0.5 μ l、cDNA 模板 2μ IUOmM dNTP 0.5 μ IUOyM CsACTIN-F引物1μ1、10μΜ CsACTIN-R引物I μ 1、使用無菌水補足25 μ I。反應條件為:94°C 5min，26個循環，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，72°C反應1min。檢測結果見圖4所
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[0040](3)轉基因擬南芥植株表型分析
通過PCR和RT-PCR的結果，對獲得的陽性植物進行觀察，獲得的CsMADSl轉基因植株不能正常抽苔開花，頂端分生組織處異位生長出許多簇生的針狀葉片或退化的小花分枝(圖 5)。
【權利要求】
1.黃瓜Cs姻Λ?2基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NOl所示。
2.—種黃瓜CsMADSI基因花特異表達載體，其特征在于，所述表達載體為pCAMBIA1301-CsMADSl，其含有黃瓜E族基因CsMADSI，基因的上游連有35S啟動子。
3.根據權利要求2所述的黃瓜CsMADSl基因花特異表達載體，其特征在于，由下述方法構建而成: 根據CuGI上登錄號為Csa004117的黃瓜CsMADSl序列設計兩端引物，其中CsMADS1-F引物引入了 NcoI位點，CsMADS1-R引物引入了 BglII位點，
CsMADS1-F:5’ -aaaaCCATGGATGGGAAGAGGAAGAGTAG-3’，CsMADS1-R:5’ -aaaaAGATCTTCAAAGCATCCAACCAGGGAG-3’，以黃瓜花蕾的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，獲得CsMADSl全長; 回收CsMADSl的cDNA全長，將其連接到pMD18載體上，采用堿裂解法提取質粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質粒pMD18-CsMADSl ； 使用NcoI和BglII酶切pMD18-CsMADSl，回收CsMADSl片段，同時用NcoI和BglII酶切pCAMBIA1301，回收后連接，轉化感受態細胞，獲得植物表達載體pCAMBIAl301-CsMADSI。
4.如權利要求3所述黃瓜CsMADSl基因花特異表達載體的應用，其特征在于，將獲得的植物表達載體pCAMBIAl301-CsMADSI轉入農桿菌GV3101，再轉入到擬南芥中，收獲植株的種子，晾干后通過潮霉素篩選獲得抗性苗，再通過PCR鑒定和RT-PCR檢測后獲得轉基因植株。
【文檔編號】C12N15/66GK104450735SQ201410659838
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月19日 優先權日:2014年11月19日
【發明者】胡麗芳, 劉世強, 賀浩華, 蔣倫偉, 黃長干, 肖偉 申請人:江西農業大學