一株產游離葡萄糖醛酸的糖精葡糖醋桿菌的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株產游離的葡萄糖醛酸的糖精葡糖醋桿菌，屬于發酵【技術領域】。糖精葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter saccharivorans)L4，已于2014年7月23日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2014352。該葡萄糖酸桿菌能夠以葡萄糖為底物生產葡萄醛酸，對微生物法生產葡萄糖醛酸奠定了基礎。CCTCC No.20143522014.07.23
【專利說明】一株產游離葡萄糖醛酸的糖精葡糖醋桿菌
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株產游離葡萄糖醛酸的糖精葡糖醋桿菌，屬于發酵【技術領域】。
【背景技術】
[0002]葡萄糖醒酸(Glucuronic acid)是一種糖醒酸化合物，因其分子中同時存在高反應活性的醛基和羧基，可作為受體與多種人體內源性及外源性有毒物質結合，提高毒性物質的水溶性使其易于隨尿與膽汁排出體外，發揮排毒功能，提高機體免疫功能。
[0003]葡萄糖醛酸在醫藥和保健品等領域也有著廣泛的應用，可作為中間物質合成具有防癌抗癌作用的D-葡糖二酸鈣、D-葡萄糖二酸1，4-內酯和L-抗壞血酸等，也可作為食品添加劑加入到功能性飲料中。其優勢作用正在不斷被發掘，有巨大的潛在經濟效益。
[0004]目前葡萄糖醛酸主要以淀粉為原料在酸性條件下通過硝酸氧化來實現生產。該工藝存在能耗高、選擇性差、產品收率低、環境污染嚴重等問題。以葡萄糖為底物用發酵法生產葡萄糖醛酸成本較低，對環境污染也較小，并且發酵生產葡萄糖醛酸可以大大減輕原料來源的限制。由于缺少能夠產游離葡萄糖醛酸的獨立菌株，目前，還沒有利用單一微生物發酵生產葡萄糖醛酸的方法。
[0005]本發明篩選到以葡萄糖為底物生產游離葡萄糖醛酸的微生物菌株，對該菌株進行了鑒定，確定其為糖精葡糖酸醋桿菌，對其發酵條件進行了初步研究，為微生物發酵法產葡萄糖醛酸奠定了基礎。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一株產葡萄糖醒酸的糖精葡糖醋桿菌(Gluconacetobactersaccharivorans)L4，已于2014年7月23日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC N0.M2014352。
[0007]所述糖精葡糖醋桿菌L4，用GY培養基培養時，菌落呈圓形，表面干燥光滑，邊緣規則，培養時間小于5天菌落為白色，培養時間大于5天菌落逐漸變黃色，菌落直徑為0.2-0.5_。菌體革蘭氏陰性，100X顯微鏡下觀察細胞呈短桿狀。
[0008]所述糖精葡糖醋桿菌L4能夠發酵生產葡萄糖醛酸，所得葡萄糖醛酸游離于發酵上清液中，而不在胞外多糖中。
[0009]所述糖精葡糖醋桿菌L4的篩選是以從新疆長生堂紅茶菌中分離的菌株為生產菌株，在初始的發酵培養基(糖茶水，含L 5?3% (m/v)蔗糖的茶葉水)中30°C、200rpm的條件下培養5天，通過液質聯用(LC-MS)定性檢測發酵上清液中葡萄糖醛酸，再通過離子色譜定量檢測發酵上清液中物質的含量，篩選出能以葡萄糖為底物發酵生產游離葡萄糖醛酸的菌株。
[0010]本發明要解決的第二個技術問題是提供一種應用所述糖精葡糖醋桿菌L4的方法，是將菌株活化后，接種于GY培養基，28-30 0C，200-220r/min搖床培養4_5天。發酵上清液中含有葡萄糖醛酸。
[0011]所述GY培養基含有葡萄糖100g/L，酵母提取物10g/L。
[0012]本發明提供的菌株能將較廉價的底物葡萄糖轉化成具有高附加值的葡萄糖醛酸，葡萄糖醛酸直接分離到發酵上清液中，而不是混于胞外多糖，較化學生產法具有反應條件溫和，產品工藝簡單，生產過程易于控制，可用于食品和藥物生產等優點，同時有利于保護環境，易于推廣使用。
[0013]生物材料保藏
[0014]一株糖精葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter saccharivorans) L4,已于 2014年 7 月23日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCCNo:M2014352o
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1葡萄糖醒酸質譜圖，A:葡萄糖醒酸標樣一級質譜圖；B:Gluconacetobactersaccharivorans L4發酵上清液中葡萄糖醒酸質譜圖。
[0016]圖2葡萄糖醛酸離子色譜圖，A:葡萄糖醛酸標樣，出峰時間10.117min ；B:Gluconacetobacter saccharivorans L4發酵上清液中葡萄糖醒酸離子色譜圖，出峰時間10.150mino
【具體實施方式】
[0017]胞外多糖中葡萄糖醛酸的檢測方法:
[0018]將菌體在GY培養基中30°C、200r/min條件下培養72h，以8000rpm離心15min，取清液。將4倍上清液體積的乙醇加入到上清液中，并將混合物保持在4°C下過夜。以8000r/min離心15分鐘收集沉淀。將沉淀干燥，加入5倍上清液體積的0.5mol/L的H2SO4溶液，在70°C反應3h。將水解液通過0.45 μ m濾膜過濾，LCMS檢測產物。
[0019]葡萄糖醛酸檢測方法的確定:
[0020]葡萄糖醒酸的標樣在Shimadzu Shim-Pack VP-0DS (150mmX 2.0mm, 5 μ m)柱上通過離子阱-飛行時間液質聯用儀(LCMS-1T-T0F)進行分析，保留時間為1.85-2.48min。所用的液質聯用儀為日本島津(Shimaduz)公司制造，確定的色譜條件為:流動相:含0.01%甲酸和lmmol/L甲酸銨的75%的甲醇水溶液；流速:0.75mL/min ;平衡溫度:40°C ;進樣量:5μ L ;質譜條件:干燥氣流速10L/min，噴霧器1.5L/min，氣體溫度200°C，電離方式為ESI負極模式，單反應監測離子150-300m/z，累積時間30ms，ESI電壓170kV，碎裂能量60%。
[0021]產物的定性檢測:采用LCMS-1T-T0F液質聯用鑒定產物中是否有葡萄糖醛酸，將發酵液在1000g離心5min后，取上清液，用超純水稀釋10倍，0.22 μ m孔徑的微濾膜過濾，進樣檢測。液相色譜條件:流動相為含0.01%甲酸、ImM甲酸銨的75%的甲醇水溶液，流速
0.75mL/min,柱溫40°C,進樣量5 μ L。質譜條件:干燥氣流速10L/min,噴霧器1.5L/min,氣體溫度200°C，電離方式為ESI負極模式，單反應監測離子150-300m/z，累積時間30ms，ESI電壓170kV，碎裂能量60%。
[0022]產物的定量檢測:用離子色譜法(IC)檢測發酵液中產葡萄糖醛酸的生成量。將發酵液在1000g離心5min后，取上清液，用超純水稀釋10倍，0.22 μ m孔徑的微濾膜過濾。離子色譜條件:采用戴安ICS-5000離子色譜儀，脈沖安培檢測器，CarboPac PA200分析柱(3mmX 250mm),流動相為250mmol/L氫氧化鈉-水；流速:0.5mL/min。葡萄糖醒酸在離子色譜上保留時間為1.85-2.48min。
[0023]GYC培養基:葡萄糖100g/L，酵母提取物10g/L，碳酸鈣20g/L。添加瓊脂20g/L得到GYC固體培養基。
[0024]GY培養基:葡萄糖100g/L，酵母提取物10g/L，去離子水1L。
[0025]實施例1糖精葡糖醋桿菌的篩選
[0026]取少量紅茶菌菌膜在GYC培養基中富集，30°C，200r/min搖床培養48h，依次稀釋成10' 10' 10' 10' 10〃5個梯度，分別取稀釋后的樣品各200 μ L涂布于加入100mg/mL納他霉素的GYC固體培養基，每個稀釋梯度重復2次。挑單菌落在30°C培養72h。挑選有透明圈的單菌落接種于GY培養基，300C，200r/min搖床培養至對數期取樣保藏，收集培養72h發酵液，離心，取上清液以備檢測。從篩選得到的諸多菌中篩選得到一株產量最高的葡糖醋桿菌進行下一步的菌株鑒定。
[0027]實施例2目的菌株的鑒定:
[0028](I) 16S rDNA 比對鑒定
[0029]提取出發菌株的基因組DNA，以出發菌株的基因組DNA為模板，使用細菌16S rDNAPCR通用引物27F、1492R進行擴增。
[0030]PCR方法如下:50 μ L反應體系中加入:10mol/L的引物27F和1492R各
1.5 μ L, 2X Super Pfu Mixture25 μ L,模板 I μ L，加雙蒸水補齊至 50 μ L: ;PCR 條件為:94°C，3min, 94°C變性 30s，55。。退火 30s，68。。延伸 1.5min, 30 循環，68°C延伸 8min.
[0031]用膠回收試劑盒純化PCR產物，核酸電泳驗證。16S rDNA測序由上海生工生物科技有限公司完成，將測序結果在NCBI中與已有序列進行Blast比對分析，結果表明其與Gluconacetobacter saccharivorans的16S rDNA序列相似性最高，將其命名為:Gluconacetobacter saccharivorans L4。
[0032](2)形態生理生化分析
[0033]該菌株的形態學特征為菌落圓形，表面干燥光滑，邊緣規則，培養時間小于5天菌落為白色，培養時間大于5天菌落逐漸變黃色,菌落大小0.2-0.5mm,用GY培養基培養。菌體革蘭氏陰性，100X顯微鏡下觀察細胞呈短桿狀。
[0034]實施例3胞外多糖中葡萄糖醛酸檢測方法的確定:
[0035]將菌體在GY培養基中30°C、200r/min條件下培養72h，以8000rpm離心15min，取上清液。用4倍上清液體積的乙醇加入到上清液中，并將混合物保持在4°C下過夜。以8000r/min離心15分鐘收集沉淀。將沉淀干燥，加入5倍上清液體積的0.5mol/L的H2SO4溶液，在70V反應3h。將水解液通過0.45 μ m濾膜過濾，LCMS檢測產物，檢測結果顯示胞外多糖中不含有葡萄糖醛酸。
[0036]實施例4產物的定性檢測:
[0037]測定葡萄糖醒酸標樣LC-MS圖譜,并將實施例1中得到的G.saccharivorans L4的發酵液上清稀釋10倍后用于LC-MS檢測，與標樣圖譜進行對比分析，如圖1所示，在2min處質譜掃描圖中葡萄糖醛酸標樣的分子量大小為193.0369，樣品在同一時間處檢測到相同分子量(193.0370)的物質，確定發酵液中含有葡萄糖醛酸。
[0038]實施例5用離子色譜法(IC)檢測發酵液中產葡萄糖醛酸的生成量。
[0039]實施例1中得到的G.saccharivorans L4的發酵液上清用超純水稀釋10倍，0.22μπι孔徑的微濾膜過濾。如圖2所示，定量檢測顯示發酵液中葡萄糖醛酸含量為15.88mg/L。
[0040]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
【權利要求】
1.一株產葡萄糖醒酸的糖精葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter saccharivorans) L4,已于2014年7月23日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為 CCTCC N0.M2014352。
2.權利要求1所述的糖精葡糖醋桿菌L4在葡萄糖醛酸生產中的應用方法。
3.根據權利要求2所述的應用方法，其特征在于，是將菌株活化后，接種于GY培養基，28-30 0C，200-220r/min 搖床培養 4-5 天。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述GY培養基含有葡萄糖100g/L，酵母提取物10g/L。
5.權利要求1所述的糖精葡糖醋桿菌L4的應用。
【文檔編號】C12P19/02GK104357365SQ201410659766
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月18日 優先權日:2014年11月18日
【發明者】方芳, 仇鈺瑩, 劉曉慧, 陳堅 申請人:江南大學