一種檢測牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量rt-pcr檢測試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒及其應用，該試劑盒用于臨床及科研領域，可以廣泛用于BVDV的快速檢測，特別是對BVDV感染的快速檢測及其對牛源原材料、豬瘟弱毒活疫苗中是否污染BVDV的快速監測。本發明還提供了用于檢測牛病毒性腹瀉病毒感染的熒光定量RT-PCR方法，該方法檢測結果準確，具有特異性高，靈敏度高，重復性好，擴增與檢測一步完成，操作更簡單，檢測可在兩個小時內完成的優點。
【專利說明】-種檢測牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測試劑 盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于獸用生物制品領域，具體涉及一種檢測牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量 RT-PCR檢測試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV),又稱牛病毒性腹 瀉-粘膜病病毒（Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus，BVD_MDV)，屬于黃病毒 科（Flavivixidae)、癌病毒屬（Pestivirus)的成員。該病毒與豬癌病毒（Classical swine fever virus，CSFV)為同一個屬。牛血清、冷凍胚胎、牛精液等牛源產品都可能污染BVDV， 造成BVDV的傳播。在獸用疫苗生產中，常使用牛血清、牛睪丸細胞、胰酶等牛源材料作為原 材料。因此，一旦這些原材料中若有BVDV病原，會導致疫苗污染，尤其是豬用疫苗污染后， 會導致免疫豬感染BVDV，造成自身類似豬瘟的臨床癥狀給豬瘟的診斷帶來困難外，還會成 為BVDV的污染源。
[0003] 國內對于豬瘟苗原材料中檢測BVDV的方法主要有Vero傳代細胞檢測法、致細胞 病變和紅細胞吸附外源病毒檢驗法、熒光抗體檢測法、微量血清中和試驗、酶聯免疫吸附試 驗、PCR技術等。常規的檢測方法存在費時費力，靈敏度低等缺點。隨著生物技術水平的 發展，熒光定量RT-PCR方法的出現，為BVDV的檢測提供了一種有力的工具。而熒光定量 RT-PCR與普通RT-PCR相比具有靈敏性更強、特異性更好、污染幾率小、自動化高、高通量等 優勢，因而成為一種越來越重要的檢測技術。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于克服現有技術的缺點，提供一種檢測牛病毒性腹瀉病毒的熒光 定量RT-PCR檢測試劑盒，該試劑盒能夠快速準確的對牛病毒性腹瀉病毒進行定量檢測。
[0005] 本發明的另一目的在于提供檢測牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測試劑 盒的應用，包括臨床及科研中對于牛病毒性腹瀉病毒感染的快速定量檢測盒對牛血清及豬 瘟弱毒活疫苗等生物制品中是否污染牛病毒性腹瀉病毒進行監測。
[0006] 本發明的目的通過以下技術方案來實現：一種檢測牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量 RT-PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括一對BVDV的特異性引物及一條特異性探針，其中所 述引物對的上游序列（BVDV-P1)為 5 ' -GGG (A/G/T) AGTCGTCA (A/G) TGGTTCG-3 '，下游序列 (BVDV-P2)為 5 ' -CCTATCAGGC TGT (A/G) T (C/T) C (A/G) TA (A/G) C-3 '，所述的特異性探針序列 (BVDV-MGB)為 5' -FAM-CGTCCAC(A/G)TGGCATCTCGAG-NFQ-MGB-3'。
[0007] 進一步地，所述RT-PCR反應液包括以下組分：2XRT-PCR Buffer緩沖液、DNA聚合 酶、反轉錄酶、上游引物BVDV-P1、下游引物BVDV-P2、特異性探針、Total RNA、RNase Free dH20。
[0008] 作為最優方案，所述RT-PCR反應液的總體積為25 μ L，所述RT-PCR反應液包括以 下組分：2X0ne st印 RT-PCR BufTerIII:12.5yL;5U/yL Takara Ex Taq HS:0.5yL; PrimeScript RT enzyme MixII :0·5μ L ;10μ M上游引物 BVDV-Pl :1. 5μ L ;10μ M下游引 物 BVDV-P2 :1. 5 μ L ;特異性探針：1 μ L ;Total RNA :5 μ L、RNase Free dH20 :2. 5 μ L。
[0009] 所述試劑盒還包括陰性對照和陽性對照。
[0010] 所述的檢測牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的應用，該試劑盒 使用時包括如下步驟：
[0011] SI.提取待檢樣品的RNA ;
[0012] S2. -步法PCR，利用反轉錄過程將RNA反轉錄成cDNA，同時進行熒光定量PCR ;
[0013] S3.對數據進行處理、判定檢測結果；
[0014] 其中，所述應用不用于診斷目的。
[0015] 本發明所述的RNA提取是指商品化病毒RNA試劑盒提取RNA。
[0016] 本發明中最優反應程序是指1個循環反轉錄42°C，5min ;40個循環95°C，IOsec ; 95°C，5sec ;60°C，30sec，于60°C進行熒光信號采集。
[0017] 本發明所述的結果判定：點擊PCR儀分析界面，取3?15個循環熒光信號為基線。 閾值為閾值線剛好超過正常陰性對照品的擴增曲線的最高點，無 Ct值并且與陽性對照的 指數期相交為準。當檢測樣Ct值< 35. 0,且曲線有明顯的指數增長期，結果可直接判定為 陽性；當檢測樣35〈Ct值〈40,需重檢一次，若Ct值仍〈40,且擴增曲線有明顯的指數增長 期，可判定結果為陽性，否則為陰性；檢測結果無 Ct值或Ct值為40,結果判定為陰性。
[0018] 用于檢測BVDV的方法，包括應用熒光定量RT-PCR方法檢測待測樣本中是否存在 BVDV的RNA步驟，其中所述RT-PCR方法應用了以下引物對和探針：序列為5' -GGG(A/G/ T)AGTCGTCA(A/G)TGGTTCG-3' 的上游引物，序列為 5' -CCTATCAGGC TGT(A/G)T(C/T)C(A/G) TA(A/G)C-3' 的下游引物，以及序列為 5' -FAM-CGTCCAC(A/G)TGGCATCTCGAG-NFQ-MGB-3' 的 探針，所述用于檢測BVDV的方法不用于診斷目的。
[0019] 用于檢測BVDV的方法，包括應用上述熒光定量RT-PCR檢測試劑盒檢測待測樣本 中是否存在BVDV的RNA的步驟。
[0020] 本發明具有以下優點：本發明根據GenBank中的牛病毒性腹瀉病毒和豬瘟病毒的 基因序列設計一對BVDV的特異性引物，通過對熒光定量RT-PCR反應條件進行相應的優化， 具有較好的重復性、靈敏度和特異性，可以廣泛用于BVDV的快速檢測，特別是對BVDV感染 的快速檢測及其對牛源原材料、豬瘟弱毒活疫苗中是否污染BVDV的快速監測；本發明采用 探針法熒光定量RT-PCR方法其假陽性率低于SYBR Green染料法，其檢測結果更加準確，與 普通的PCR檢測方法相比，本發明的方法具有特異性高，靈敏度高，重復性好，擴增與檢測 一步完成，操作更簡單，檢測可在兩個小時內完成。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發明方法特異性的動力學曲線。圖中a是BVDV，b-g分別是豬圓環病 毒2型（PCV2)、豬偽狂犬病病毒（PRV)、豬胃腸炎病毒（TGEV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV)、CSFV和陰性對照；
[0022] 圖2為本發明方法重復性的動力學曲線。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合附圖及實施例對本發明做進一步的描述，本發明的保護范圍不局限于以 下所述。
[0024] 實施例1 :檢測牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒
[0025] 1 · 一對BVDV的特異性引物：引物對的上游序列（BVDV-P1)為5 ' -GGG (A/G/T) AGTCGTCA (A/G) TGGTTCG-3 '，下游序列（BVDV-P2)為 5 ' -CCTATCAGGC TGT (A/G) T (C/T) C (A/ G)TA(A/G)C-3,；
[0026] 2. -條特異性探針：特異性探針序列（BVDV-MGB)為5 ' -FAM-CGTCCAC (A/G) TGGCATCTCGAG-NFQ-MGB-3,；
[0027] 3. RT-PCR反應液組分（總體積為25 μ L):
[0028] 2 X One step RT-PCR Buffer III ： 12. 5 μ L ；
[0029] 5U/ μ L Takara Ex Taq HS ：0. 5 μ L ；
[0030] PrimeScript RT enzyme Mix II :0· 5 μ L ;
[0031] ΙΟμΜ上游引物 BVDV-Pl :1.5yL;
[0032] 10 μ M 下游引物 BVDV-P2 :1. 5 μ L ;
[0033] 特異性探針：IyL ;
[0034] Total RNA ：5μ L>
[0035] RNase Free dH20 :2· 5 μ L。
[0036] 4.陽性對照：BVDV C24V毒株MDBK細胞系產物，其病毒滴度為106 5TCID5Q/ml，滅 活提取RNA分裝。
[0037] 5.陰性對照：MDBK細胞培養產物，滅活提取RNA分裝。
[0038] 實施例2 :牛病毒性腹瀉病毒熒光定量RT-PCR檢測方法的建立
[0039] 1.材料
[0040] 根據BVDV核苷酸序列，利用DNAStar軟件進行序列分析，利用Oligo 6. 0引物設 計軟件設計一對引物及探針用于鑒定BVDV及CSFV病毒。引物由上海英駿公司合成，探針 由 ABI 公司合成。One Step PrimeScript? RT-PCR Kit (Perfect Real Time)購置寶生物 (大連）有限公司；病毒RNA提取試劑盒購置天根生化科技（北京）有限公司。
[0041] 2.方法與結果
[0042] (1)最佳反應條件的確立
[0043] 為了確定引物的最佳反應體系，對引物和探針的濃度進行了相應的優化。反應程 序為：42°C，5min (-個循環）；95°C，10sec ;95°C，5sec ;60°C，30sec，反應進行 40 個循環， 于60 °C進行突光信號米集。反應25 μ L體系如表1所不：
[0044] 表1 :最佳反應體系表
[0045]
【權利要求】
1. 一種檢測牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述 試劑盒包括一對BVDV的特異性引物及一條特異性探針，其中所述引物對的上游序列 (BVDV-Pl)為 5' - GGG (A/G/T)AGTCGTCA (A/G)TGGITCG-3'，下游序列（BVDV-P2)為5'-〇7^11^66(：161'仏/6)1'((：/1')(：仏/6)了六仏/6)(：-3'，所述的特異性探針序列（8￥0￥-]\?^)為 5' -FAM-CGTCCAC(A/G)TGGCATCTCGAG -NFQ-MGB-3'。
2. 如權利要求1所述的一種檢測牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其 特征在于所述引物對和探針被包括在RT-PCR反應液中，所述RT-PCR反應液包括以下組分 ： 2X RT-PCR Buffer緩沖液、DNA聚合酶、反轉錄酶、上游引物BVDV-P1、下游引物BVDV-P2、 特異性探針、Total RNA、RNase Free dH20。
3. 如權利要求2所述的一種檢測牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其 特征在于所述RT-PCR反應液的總體積為25 ii L，所述RT-PCR反應液包括以下組分：2XOne step RT-PCR Buffer III ： 12. 5 u L ；5U/u L Takara Ex Taq HS ：0. 5 u L ；PrimeScript RT enzyme Mix II :0? 5 ii L ; 10 ii M 上游引物 BVDV-Pl : I. 5 ii L ; 10 ii M 下游引物 BVDV-P2 : I. 5 ii L ;特異性探針：1 ii L ;Total RNA :5 ii L、RNase Free dH20 :2. 5 ii L。
4. 如權利要求2或3所述的一種檢測牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測試劑 盒，其特征在于所述試劑盒還包括陰性對照和陽性對照。
5. 如權利要求1-4中任一項所述的檢測牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測試 劑盒的應用，其特征在于該試劑盒使用時包括如下步驟：
51. 提取待檢樣品的RNA ;
52. -步法PCR，利用反轉錄過程將RNA反轉錄成cDNA，同時進行熒光定量PCR ;
53. 對數據進行處理、判定檢測結果； 其中，所述應用不用于診斷目的。
6. 用于檢測BVDV的方法，其特征在于，包括應用熒光定量RT-PCR方法檢測待測樣本 中是否存在BVDV的RNA步驟，其中所述RT-PCR方法應用了以下引物對和探針：序列為5'_ GGG (A/G/T)AGTCGTCA (A/G)TGGITCG-3' 的上游引物，序列為 5'- CCTATCAGGC TGT(A/G) T (C/T)C(A/G)TA(A/G)C-3,的下游引物，以及序列為 5' -FAM-CGTCCAC(A/G)TGGCATCTCGAG -NFQ-MGB-3'的探針，所述用于檢測BVDV的方法不用于診斷目的。
7. 用于檢測BVDV的方法，其特征在于，包括應用權利要求1-4中任一項的熒光定量 RT-PCR檢測試劑盒檢測待測樣本中是否存在BVDV的RNA的步驟。
【文檔編號】C12R1/93GK104313192SQ201410658803
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月18日 優先權日:2014年11月18日
【發明者】徐宏軍, 岳豐雄, 黃杰, 張奕強, 柏菊, 王潔清, 胡來根, 王家福 申請人:成都天邦生物制品有限公司