輔助診斷阿爾茨海默病的檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明公開了輔助診斷阿爾茨海默病的檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒包含一對G蛋白偶聯受體基因啟動子區甲基化特異性擴增引物及一個甲基化特異性測序引物，所述的一對G蛋白偶聯受體基因啟動子區甲基化特異性擴增引物包括甲基化特異性上游引物和甲基化特異性下游引物；其通過檢測與阿爾茨海默病相關的G蛋白偶聯受體基因啟動子區甲基化程度輔助診斷阿爾茨海默病，簡單、方便，檢測效率高，針對性強，具有準確可靠、靈活快速和經濟節約的優點，有利于阿爾茨海默病的早期發現和及時治療。
【專利說明】輔助診斷阿爾茨海默病的檢測試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及阿爾茨海默病的輔助診斷【技術領域】，特別涉及一種輔助診斷阿爾茨海 默病的檢測試劑盒及其檢測方法，尤其指一種能用于檢測與阿爾茨海默病相關的G蛋白偶 聯受體50基因啟動子區甲基化程度的檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 阿爾茨海默病（Alzheimerdisease,AD)是一種系統性神經退行性疾病，其臨床 表現為高級認知功能低下，主要特征包括腦細胞內神經纖維纏結及細胞外老年斑。阿爾茨 海默病患者需要終生護理，因此給社會和家庭帶來極大的經濟負擔。阿爾茨海默病是一種 由遺傳因素和環境因素共同作用而引起的復雜性疾病，尋找阿爾茨海默病相關基因進而闡 明癡呆癥發病的遺傳機制已經成為目前研究的熱點。雖然有越來越多的醫學研究機構重視 并開展阿爾茨海默病的病因研究，且研究多集中于相關候選基因的單核苷酸多態性與阿爾 茨海默病的關聯性上，但其發病機理仍未被完全闡釋清楚，這無疑妨礙了阿爾茨海默病預 防及治療水平的提高。
[0003] G蛋白偶聯受體50(Gprotein-coupledreceptor50)是G蛋白偶聯受體家族的 成員，GPR50和雙相情感障礙，重度抑郁癥及精神分裂癥存在關系。G蛋白偶聯受體50是由 位于X染色體的G蛋白偶聯受體50基因（Gprotein-coupledreceptor50gene，GPR50) (ChromosomeX: 151176584. ? 151181465)編碼而成的。國內外已有大量研究報道了GPR50 基因表達與阿爾茨海默病發病的關系。
[0004] 目前，國內外還沒有公開任何關于用于檢測與阿爾茨海默病相關的G蛋白偶聯受 體基因啟動子區甲基化程度的檢測試劑盒相關研究報道。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的現狀，提供檢測方便、針對性強、檢 測準確率高的輔助診斷阿爾茨海默病的檢測試劑盒；通過對樣品DNA甲基化水平測定輔助 診斷阿爾茨海默病，檢測方法簡單、檢測效率高。
[0006] 本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為： 輔助診斷阿爾茨海默病的檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒包含一對G蛋白偶聯受體基 因啟動子區甲基化特異性擴增引物及一個甲基化特異性測序引物，所述的一對G蛋白偶聯 受體基因啟動子區甲基化特異性擴增引物包括甲基化特異性上游引物和甲基化特異性下 游引物： 所述的甲基化特異性上游引物包括以下核苷酸序列： 5' _GGGGATTTAGAGAGGTTGTAAAG-3' ； 所述的甲基化特異性下游引物包括以下核苷酸序列： 5' -Biotin-CCAACCTATAAACCCAACTAACTACTCTAC-3' ； 所述的甲基化特異性測序引物包括以下核苷酸序列： 5' -GGGATTTTTTTAGTTGTTAGTTAT-3'。
[0007] 輔助診斷阿爾茨海默病的檢測試劑盒的檢測方法：包括以下步驟： 步驟一：提取樣本的全血基因組DNA，并檢測所得DNA的濃度； 步驟二：采用甲基化試劑盒對樣本DNA進行亞硫酸氫鹽轉化； 步驟三：取步驟二中轉化過的DNA樣本20ng加入到ZymoTaq?PreMix酶，并加入一對G蛋白偶聯受體基因啟動子區甲基化特異性擴增引物，進行PCR擴增； 步驟四：焦磷酸測序的前期準備：在PSQ96板中預先加入45yl含有0. 3yM甲基化特 異性測序引物的退火緩沖液，將需要使用的混勻的瓊脂糖珠轉移到一個微量離心管中，在 瓊脂糖珠中加入結合緩沖液混勻；將以上混合液加入PCR擴增產物中，將PCR產物在常溫下 混勻10分鐘，使得磁珠與生物素結合；在真空預備工作站中，四個樣品板中依次加入180ml 的高純水、70%乙醇、洗滌緩沖液和120ml的變性緩沖液；打開真空預備工作站的泵，將真 空準備工具在高純水中清洗30秒；然后將真空準備工具移到PCR板中，抓取瓊脂糖珠；拿 起PCR板，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空準備工具上；將真空準備工具放入70% 乙醇中5秒；然后移到變性緩沖液中5秒；再移到洗滌緩沖液中清洗5至10秒；關掉泵； 將真空準備工具放入含有甲基化特異性測序引物的板中，搖動，釋放瓊脂糖珠；使用高純水 清洗真空準備工具；將放有樣品的PSQ96板放在加熱板上加熱到80°C2分鐘，再冷卻到室 溫； 步驟五：焦磷酸測序：在焦磷酸測序儀上，采用PyromarkGoldQ24試劑盒對步驟四中 的PSQ96板中的樣本進行測序，然后應用PyroMarkCpG軟件對結果進行甲基化分析。
[0008] 上述的步驟一中采用Lab-Aid820全自動核酸提取儀提取全血基因組DNA，再通 過Nan〇Dr〇p2000超微量分光光度計檢測DNA的濃度。
[0009] 上述的步驟二中采用EZDNA甲基化試劑盒。
[0010] 上述的步驟三中PCR擴增條件為：首先95°ClOmin的變性；接著95°C30s，Tm 40s，72°C50s，共35個循環的退火反應；然后延伸反應72°C7min。
[0011] 上述的步驟五中焦磷酸測序儀采用PyroMarkQ24焦磷酸測序。
[0012] 本發明輔助診斷阿爾茨海默病的檢測試劑盒及其檢測方法，所述的檢測試劑盒包 含一對G蛋白偶聯受體基因啟動子區甲基化特異性擴增引物及一個甲基化特異性測序引 物，所述的一對G蛋白偶聯受體基因啟動子區甲基化特異性擴增引物包括甲基化特異性上 游引物和甲基化特異性下游引物；其優點在于：通過檢測與阿爾茨海默病相關的G蛋白偶 聯受體基因啟動子區甲基化程度輔助診斷阿爾茨海默病，簡單、方便，檢測效率高，針對性 強，具有準確可靠、靈活快速和經濟節約的優點，有利于阿爾茨海默病的早期發現和及時治 療。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013] 圖1為被檢測序列所在區域以及7個CpG位點的相關性示意圖； 圖2為DNA甲基化水平檢測結果示意圖。
【具體實施方式】
[0014] 以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0015] 輔助診斷阿爾茨海默病的檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒包含一對G蛋白偶聯受 體基因啟動子區甲基化特異性擴增引物及一個甲基化特異性測序引物，所述的一對G蛋白 偶聯受體基因啟動子區甲基化特異性擴增引物包括甲基化特異性上游引物和甲基化特異 性下游引物： 所述的甲基化特異性上游引物包括以下核苷酸序列： 5' _ GGGGATTTAGAGAGGTTGTAAAG -3' ； 所述的甲基化特異性下游引物包括以下核苷酸序列： 5' - Biotin-CCAACCTATAAACCCAACTAACTACTCTAC-3' ； 所述的甲基化特異性測序引物包括以下核苷酸序列： 5' - GGGATTTTTTTAGTTGTTAGTTAT-3'。
[0016] 輔助診斷阿爾茨海默病的檢測試劑盒的檢測方法：包括以下步驟： 步驟一：提取樣本的全血基因組DNA，并檢測所得DNA的濃度； 步驟二：采用甲基化試劑盒對樣本DNA進行亞硫酸氫鹽轉化； 步驟三：取步驟二中轉化過的DNA樣本20ng加入到Zymo Taq? PreMix酶，并加入一對 G蛋白偶聯受體基因啟動子區甲基化特異性擴增引物，進行PCR擴增； 步驟四：焦磷酸測序的前期準備：在PSQ96板中預先加入45 yl含有0. 3 y M甲基化特 異性測序引物的退火緩沖液，將需要使用的混勻的瓊脂糖珠轉移到一個微量離心管中，在 瓊脂糖珠中加入結合緩沖液混勻；將以上混合液加入PCR擴增產物中，將PCR產物在常溫下 混勻10分鐘，使得磁珠與生物素結合；在真空預備工作站中，四個樣品板中依次加入180ml 的高純水、70%乙醇、洗滌緩沖液和120ml的變性緩沖液；打開真空預備工作站的泵，將真 空準備工具在高純水中清洗30秒；然后將真空準備工具移到PCR板中，抓取瓊脂糖珠；拿 起PCR板，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空準備工具上；將真空準備工具放入70% 乙醇中5秒；然后移到變性緩沖液中5秒；再移到洗滌緩沖液中清洗5至10秒；關掉泵； 將真空準備工具放入含有甲基化特異性測序引物的板中，搖動，釋放瓊脂糖珠；使用高純水 清洗真空準備工具；將放有樣品的PSQ96板放在加熱板上加熱到80°C 2分鐘，再冷卻到室 溫； 步驟五：焦磷酸測序：在焦磷酸測序儀上，采用PyromarkGoldQ24試劑盒對步驟四中 的PSQ96板中的樣本進行測序，然后應用PyroMarkCpG軟件對結果進行甲基化分析。
[0017] 實施例中，步驟一中采用Lab-Aid820全自動核酸提取儀提取全血基因組DNA，再 通過Nan〇Dr〇p2000超微量分光光度計檢測DNA的濃度。
[0018] 實施例中，步驟二中采用EZDNA甲基化試劑盒。
[0019] 實施例中，步驟三中PCR擴增條件為：首先95°ClOmin的變性；接著95°C30s，Tm 40s，72°C50s，共45個循環的退火反應；然后延伸反應72°C7min。
[0020] 實施例中，步驟五中焦磷酸測序儀采用PyroMarkQ24焦磷酸測序。
[0021] G蛋白偶聯受體基因啟動子區域的甲基化水平不一致導致阿爾茨海默病基因的低 表達，從而影響阿爾茨海默病的發生和發展。因此，G蛋白偶聯受體基因啟動子區甲基化水 平與阿爾茨海默病的患病率在男性中呈負相關，以檢測阿爾茨海默病基因啟動子區甲基化 水平為基礎的診斷試劑盒可以方便快捷地在分子水平上實現對阿爾茨海默病的檢測，檢測 效率高，針對性強。
[0022] 下面通過實驗證明G蛋白偶聯受體基因啟動子區甲基化水平與阿爾茨海默病的 患病率在男性中呈負相關。
[0023] 1、研究對象的收集 從寧波市某三甲醫院收集阿爾茨海默病患者，癡呆診斷標準依據世界衛生組織的國際 疾病分類第10版（ICD-10)，阿爾茨海默病（AD)診斷標準采用NINCDS-ADRDA標準。排除血 管性癡呆，路易體癡呆等疾病后，最后確定阿爾茨海默病人61例作為病例組（79. 78±7. 87 歲），同時收集年齡匹配且無癡呆家族史的63名正常者作為對照組（80. 94±8. 88歲）。對 所有研究對象在知情同意的前提下，抽血檢測載脂蛋白、同型半胱氨酸等一般生化指標，同 時抽取靜脈血3ml入EDTA抗凝管中，-80°C低溫儲存，以備用于標本統一提取基因組DNA。
[0024] 2、基因組DNA的提取 應用Lab-Aid820全自動核酸提取儀（中國廈門，致善生物科技）提取上述步驟得到 的樣本的全血基因組DNA，再通過NanoDrop2000超微量分光光度計（美國，ThermoFisher Scientific)檢測所得DNA的濃度，以供BDNF基因啟動子區DNA甲基化水平的檢測。
[0025] 3、DNA甲基化水平測定 本實驗采用焦磷酸測序技術對基因啟動子區的7個CpG位點（如圖1)進行了 DNA甲基化水平分析。此技術的基本原理：用重亞硫酸鹽處理DNA樣品后，再應用聚合酶鏈 反應（PCR)擴增，可使發生甲基化的胞嘧啶（C)堿基保持不變，而使未發生甲基化的C轉變 成了尿嘧啶（U)，然后通過測序引物進行PCR測序，從而得到哪個位點發生了甲基化。本次 研究采用PyroMark Assay Design軟件進行引物設計，用于實驗的PCR擴增引物和測序引 物如下： (1) 甲基化特異性上游引物（Forwardprimer) 5' _GGGGATTTAGAGAGGTTGTAAAG-3'， (2) 甲基化特異性下游引物（Reverseprimer) 5' - Biotin-CCAACCTATAAACCCAACTAACTACTCTAC-3'， (3) 甲基化特異性測序引物（Sequencingprimer) 5' - GGGATTTTTTTAGTTGTTAGTTAT-3'。
[0026] DNA甲基化水平測定的具體步驟： 第一步：采用 EZ DNA 甲基化試劑盒-Gold(EZ DNA Methylation-Gold? Kit; ZYM0 RESEARCH)對樣本DNA進行亞硫酸氫鹽轉化。
[0027] 第二步：取第一步中轉化過的DNA樣本20ng加入到ZymoTaq?PreMix酶（Zymo Taq?PreMix，ZYM0RESEARCH)，并加入上述一對G蛋白偶聯受體基因啟動子區甲基化特異 性擴增引物，進行PCR擴增，擴增條件：首先95°C10min的變性；接著95°C30s，Tm40s， 72°C50s，共35個循環的退火反應；然后延伸反應72°C7min。（注：Tm在實驗中根據跑 PCR梯度溫度確定） 第三步：焦磷酸測序的前期準備：在PSQ96板中預先加入45yl含有0. 3yM上述甲基 化特異性測序引物的退火緩沖液（PyroMarkAnnealingBuffer;Qiagen);將需要使用的 混勻的瓊脂糖珠總量（每樣本3yl)轉移到一個微量離心管中；在瓊脂糖珠中加入結合緩 沖液（PyroMarkBindingBuffer;Qiagen)，使得平均每個樣品約有50ii1的體積，將混合 物混勻；將以上混合物加入PCR產物（50ill反應體積）中，每樣本50ill;將PCR產物在常 溫下混勻10分鐘，使得磁珠與生物素結合；在真空預備工作站中，四個樣品板中依次加入 180ml的高純水、70%乙醇、洗漆緩沖液（PyroMarkWashBuffer;Qiagen;)和 120ml的變 性緩沖液（PyroMarkDenaturationSolution;Qiagen);打開真空預備工作站的泵，將真 空準備工具在高純水中清洗30秒；然后將真空準備工具（PyroMarkVacuumPr印Filter Probes;Qiagen)移到PCR板中，抓取瓊脂糖珠（在磁珠與PCR產物結合后三分鐘內完成此 操作）；拿起PCR板，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空準備工具上；將真空準備工具 放入70%乙醇中5秒；然后移到變性緩沖液中5秒；再移到洗滌緩沖液中清洗5 - 10秒；關 掉泵；將真空準備工具放入含有測序引物的板中，搖動，釋放瓊脂糖珠（測序引物也可最后 加入）；使用高純水清洗真空準備工具；將放有樣品的PSQ96板放在加熱板上加熱到80°C 2分鐘，再冷卻到室溫，即可進行焦磷酸測序反應。
[0028] 第四步：焦磷酸測序：在PyroMarkQ24焦磷酸測序儀上，采用PyromarkGoldQ24 試劑盒（PyromarkGoldQ24Reagents;Qiagen)對第三步中的PSQ96板中的樣本進行測 序，然后應用PyroMarkCpG軟件對結果進行甲基化分析（甲基化水平檢測結果示例見圖 2)。圖2中所示百分數為對應CpG位點的甲基化程度，如圖2所示CpGl到CpG4的甲基化 程度分別為 39%，36%，50%，48%，37%，33%，35%。
[0029] 4、數據分析 本次實驗采用SPSS16. 0對數據進行整理分析，我們發現：被檢測的7個CpG位點間存 在顯著關聯（相關系數r> 0.691，p〈 0.001，有統計學意義，見圖1)(注：p〈 0.05時表 示有統計學意義，下同），所以我們把CpGl-CpG7求平均值后參與到后續的分析中，在病例 組和對照組之間的DNA甲基化水平不存在顯著差異（p= 0. 893,見表1)。我們分性別比較 了病例組和對照組間阿爾茨海默病基因啟動子區甲基化水平的差異，結果（見表2)發現 在男性中與阿爾茨海默病存在關聯（P= 0.002)，結果(見表3)還表示性別對是該基因甲基 化水平具有顯著影響。
[0030] 圖1為被檢測序列所在區域：具體位置為ChrX: 150346251. . 150346464 ;以及分 性別所檢測的7個CpG點之間的關聯性分析結果(例如男性中CpGl與CpG2的相關系數為 0. 960,CpG2與CpG3的相關系數為0. 954)。
[0031] 表1病例組與對照組間的比較（n=l14)
【權利要求】
1. 輔助診斷阿爾茨海默病的檢測試劑盒，其特征是：所述的檢測試劑盒包含一對G蛋 白偶聯受體基因啟動子區甲基化特異性擴增引物及一個甲基化特異性測序引物，所述的一 對G蛋白偶聯受體基因啟動子區甲基化特異性擴增引物包括甲基化特異性上游引物和甲 基化特異性下游引物： 所述的甲基化特異性上游引物包括以下核苷酸序列： 5' -GGGGAITTAGAGAGGITGTAAAG -3' ； 所述的甲基化特異性下游引物包括以下核苷酸序列： 5' -Biotin-CCAACCTATAAACCCAACTAACTACTCTAC-3' ； 所述的甲基化特異性測序引物包括以下核苷酸序列： 5' - GGGATTTTTTTAGTTGTTAGTTAT-3'。
2. 根據權利要求1所述的輔助診斷阿爾茨海默病的檢測試劑盒的檢測方法：其特征 是：包括以下步驟： 步驟一：提取樣本的全血基因組DNA，并檢測所得DNA的濃度； 步驟二：采用甲基化試劑盒對樣本DNA進行亞硫酸氫鹽轉化； 步驟三：取步驟二中轉化過的DNA樣本20ng加入到Zymo Taq? PreMix酶，并加入一對 G蛋白偶聯受體基因啟動子區甲基化特異性擴增引物，進行PCR擴增； 步驟四：焦磷酸測序的前期準備：在PSQ96板中預先加入45 yl含有0. 3 y M甲基化特 異性測序引物的退火緩沖液，將需要使用的混勻的瓊脂糖珠轉移到一個微量離心管中，在 瓊脂糖珠中加入結合緩沖液混勻；將以上混合液加入PCR擴增產物中，將PCR產物在常溫下 混勻10分鐘，使得磁珠與生物素結合；在真空預備工作站中，四個樣品板中依次加入180ml 的高純水、70%乙醇、洗滌緩沖液和120ml的變性緩沖液；打開真空預備工作站的泵，將真 空準備工具在高純水中清洗30秒；然后將真空準備工具移到PCR板中，抓取瓊脂糖珠；拿 起PCR板，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空準備工具上；將真空準備工具放入70% 乙醇中5秒；然后移到變性緩沖液中5秒；再移到洗滌緩沖液中清洗5至10秒；關掉泵； 將真空準備工具放入含有甲基化特異性測序引物的板中，搖動，釋放瓊脂糖珠；使用高純水 清洗真空準備工具；將放有樣品的PSQ96板放在加熱板上加熱到80°C 2分鐘，再冷卻到室 溫； 步驟五：焦磷酸測序：在焦磷酸測序儀上，采用Pyromark Gold Q24試劑盒對步驟四中 的PSQ96板中的樣本進行測序，然后應用PyroMark CpG軟件對結果進行甲基化分析。
3. 根據權利要求2所述的輔助診斷阿爾茨海默病的檢測試劑盒的檢測方法：所述的步 驟一中采用Lab-Aid 820全自動核酸提取儀提取全血基因組DNA，再通過NanoDrop2000超 微量分光光度計檢測DNA的濃度。
4. 根據權利要求2所述的輔助診斷阿爾茨海默病的檢測試劑盒的檢測方法：所述的步 驟二中采用EZ DNA甲基化試劑盒。
5. 根據權利要求2所述的輔助診斷阿爾茨海默病的檢測試劑盒的檢測方法：所述的步 驟三中PCR擴增條件為：首先95°C lOmin的變性；接著95°C 30s，Tm 40s，72°C 50s，共35 個循環的退火反應；然后延伸反應72°C 7min。
6. 根據權利要求2所述的輔助診斷阿爾茨海默病的檢測試劑盒的檢測方法：所述的步 驟五中焦磷酸測序儀采用PyroMark Q24焦磷酸測序。
【文檔編號】C12Q1/68GK104328200SQ201410657145
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月18日 優先權日:2014年11月18日
【發明者】段世偉, 季慧慧, 王欽文, 劉桂利 申請人:寧波大學