一種靶向酵母線粒體的穿梭載體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種靶向酵母線粒體的穿梭載體，其是一種用于酵母線粒體復制子、啟動子、蛋白表達等功能研究的線粒體穿梭載體，本發明基于密碼子優化，構建了一種線粒體穿梭載體，利用氯霉素篩選的方法，將線粒體復制子ori5構建到該載體上，驗證了其用于線粒體復制子篩選的功能；結果表明其能夠利用氯霉素篩選轉化到釀酒酵母線粒體中，并檢測到ori5的復制子功能，構建的載體能夠用作靶向酵母線粒體的穿梭載體、線粒體復制子和啟動子的誘捕載體、酵母線粒體復制子和啟動子功能的研究工具。
【專利說明】
一種靶向酵母線粒體的穿梭載體及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子克隆【技術領域】，具體涉及一種靶向酵母線粒體的穿梭載體及其應用。
【背景技術】
[0002]線粒體是一種半自主細胞器，其中含有線粒體DNA (mtDNA)，能夠進行自主復制。根據前人的研究，釀酒酵母線粒體DNA中有8個潛在的復制起始序列(Origin ofRecognit1n, ori)或復制子(replicon) (Tracy R L ei aL, Current genetics, 1995,28(3): 205-216)。1941年就有研究者使用氰化物處理酵母菌，第一次發現了釀酒酵母的呼吸突變現象，隨后發現了釀酒酵母小菌落突變型(petite mutant)，該突變表現為釀酒酵母在酵母浸出粉腺葡萄糖培養基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium ,YPD 或 YPED)上生長產生的菌落較正常菌落小。而隨后的研究發現，該小菌落突變型往往表現為線粒體功能的下降甚至完全缺失，其中有些突變類型涉及到線粒體基因組突變，一般是線粒體基因組編碼基因的大量缺失突變，導致線粒體蛋白合成障礙，進而導致線粒體呼吸鏈破壞引起線粒體氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylat1n , 0XPH0S)水平下降。從而在平板上表現為菌落變小。
[0003]隨后的研究者從酵母小菌落突變型中擴增獲得含有自主復制序列樣片段(autonomously replicating like sequence, ARS - like) (Delouya D et aL, Yeast,1991, 7(1): 51-60),研究者一般使用一種稱為超抑制小菌落(supersuppressivepetites)的技術，通過自發突變獲得的線粒體突變體，該突變體含有一種缺失突變線粒體，因為不能合成線粒體所需的蛋白質，但是可以正常完成突變的線粒體DNA的復制，因此含有復制起始序列。通過對該缺失突變DNA進行分析，獲得預測的復制子序列，利用酵母菌雜交技術與含有正常線粒體的酵母株進行雜交，在雜交后代中出現小菌落的數目和抑制程度，稱為抑制率。因此，如果缺失突變體中含有的復制子復制能力越強，那么我們可以推斷其抑制率越高。對誘變獲得的不同突變株進行的研究最終獲得8種潛在復制子功能的序列。
[0004]該方法通過子代中缺失突變體和正常線粒體基因組復制競爭，推斷突變體中共同含有的復制子序列，是一種有效研究復制子功能的方法。然而該方法屬于非直接的方法，這樣獲得的復制子僅屬于推斷，雖然之后的獲得復制子通過序列分析，發現有高度同源序列。然而并沒有直接的對線粒體復制子進行功能研究。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是為了解決如何利用分子生物學手段對線粒體復制子進行功能研究，提供了一種經過密碼子優化的靶向酵母線粒體的穿梭載體，該穿梭載體包括大腸桿菌的質粒復制子、大腸桿菌抗性篩選基因、酵母線粒體啟動子、酵母線粒體復制子、酵母的抗性篩選基因。
[0006]所述大腸桿菌質粒復制子是？]\^1、？154、？3(:101、&)把1或？1￥01。
[0007]所述大腸桿菌抗性篩選基因是氨芐青霉素基因、四環素基因、氯霉素基因、卡那霉素基因、新霉素基因或紅霉素基因。
[0008]所述酵母線粒體啟動子是p75或Prail。
[0009]所述酵母線粒體復制子是oril、ori2> ori3> ori4> ori5> ori6> ori7 或 ori8。
[0010]所述酵母抗性篩選基因是新霉素基因、Zeocin基因、氯霉素基因、Neocin基因或G418基因。
[0011]所述靶向酵母線粒體的穿梭載體核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0012]本發明另一目的是將靶向酵母線粒體的穿梭載體應用在酵母線粒體轉化中。
[0013](I)本發明提供了一種利用密碼子優化技術對氯霉素抗性基因(CAT)進行優化方法，使得外源基因能夠在線粒體中特異性表達。
[0014](2)本發明通過上述方法進行優化后，提供了用于構建線粒體穿梭載體方法。
[0015](3)基于構建的線粒體穿梭載體,克隆線粒體復制子ori5并構建到上述載體,驗證了其具有線粒體復制子功能。
[0016]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
1、本發明使用一種直接的方法驗證了線粒體復制子功能；比超抑制小菌落技術，提供了更為直接的分子生物學手段驗證線粒體復制子功能；
2、利用該載體可以根據本發明中提供的密碼子優化方案對外源蛋白在線粒體中表達提供方法；
3、使用本發明提供的線粒體穿梭載體和方法，可用于線粒體復制子誘捕，發現新的線粒體復制子甚至增強子等基因元件。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1為本發明中P-CAT’-T-18T測序結果比對結果(上:預期序列；下:實際測得序列)；
圖 2 為 PCR 擴增 pUC，圖中:1: DNA Marker DL5000 ；2:pUC 擴增產物；
圖3為酶切鑒定pMT-D的結果，其中1: pMT-D的酶切產物；2:DNA Marker DL5000 ；圖4為pMT-D質粒圖譜，Amp:氨芐青霉素抗性基因；MCS:多克隆位點；CoIE1:大腸桿菌復制子；P_CAT’ -T:線粒體篩選氯霉素抗性基因；
圖 5 為 PCR 擴增 ori5，其中 1: DNA Marker DL2000 ；2: ori5 擴增產物；
圖6為pMT I載體圖譜，Amp:氨芐青霉素抗性基因；MCS:多克隆位點；CoIE1:大腸桿菌復制子；P_CAT’ -T:線粒體篩選氯霉素抗性基因；mt or1:線粒體復制子；
圖7為PCR鑒定pMT I在線粒體中的復制，其中1: DNA Marker DL2000 ；2:陰性對照；3:陽性對照；4-10: pMT I的PCR產物;
圖8為驗證pMT I在線粒體中的復制，其中A為陽性對照，B為陰性對照，C-D為pMT1/INVSc I 的 mtDNA ；
圖9為酶切驗證來源于酵母線粒體中的pMT 1，其中Lane 1: DNA Marker DL5000 ；2:陽性對照；3-6: pMT I。
【具體實施方式】
[0018]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護范圍不局限于所述內容；實施例中主要采用常規的分子生物學方法，特別是本發明提供的載體構建和密碼子優化方面，這些方法是本領域普通技術人員所熟知的。按照以下實施例，不難根據具體情況略作修改和變換而成功實施本發明，這些修改和變換均落在本申請權利要求的范圍內。
[0019]實施例1:氯霉素抗性基因CAT的線粒體表達優化
為構建用于線粒體載體的穿梭載體，對抗性基因CAT進行了密碼子優化；利用在線工具 Codon Usage Database (http://www.kazusa.0r.jp/codon/)獲得釀酒酵母線粒體密碼子使用頻率，并據此優化CAT基因，獲得線粒體密碼偏好基因CAT’，其序列如序列表SEQID NO:1所示，由上海捷瑞生物工程有限公司進行全基因合成。同時添加細胞色素氧化酶C(cytochrome c oxidase, COX)亞基 II 啟動子 75 bp 序列(p75)(序列見 GenBank,登錄號:V00706.1)，通過延伸PCR的方法將其融合表達于CAT’上游，C0X2終止子120 bp序列，通過延伸PCR的方法將其融合表達于CAT’下游，合成引物為pCOXTl’:5’ -TTTTAATAATTAAAAATATTAATAATAAGTAAATATTAATTACGCTCCACCTTGTCATT-3 ^ ；pC0XTl:5’- ATTTAAGAATATTATTATAATTATTATTATTATT
ATTATTTTTAATAATTAAAAATA -3 ^ ；pC0XT2:5’-TATAAGGTGATTGAATAGAATATAAATCTATATCTTTATTATATTTAAGAATATTATTA-3 ^ ;引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。使用PCR方法融合啟動子、終止子及優化后基因。將擴增產物通過TA克隆到pMD18-T載體(購買于Takara公司，D101A)上，經過測序公司(委托上海生工)測序結果顯示與預期序列一致(見圖1)。
[0020]實施例2:線粒體穿梭載體pMT-D的構建
設計引物 pUl:5’_ GGAATTCGCGGCCGCCATTAATGAATCGGCCAAC -3 ^ ;pU2:5’-CCCAAGCTTGGCACTGGCCGTC -3 '，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。使用PCR擴增的方法，以PUC18 (購買于Takara公司，3218)為模板，反應體系:上、下游引物各0.25pm/ μ L,0.4mmol/μ L 的 dNTP, 2 ng/μ L 的質粒模板，5 U/100 μ L pfu DNA 聚合酶，IXpfu buffer,總體積為25 μ L0按下面進行反應:93°C，3min預變性；93°C,30s ；59°C,40s ;72°C，lmin反應30個循環；最后72°C延伸10mi。反應結束后進行電泳，EB染色，結果與預期結果一致(見圖2)。膠回收后，與實施例1中所得片段分別酶切，體系:片段400ng，I (購買于Takara 公司，1040A)、M/e I (購買于 Takara 公司，1161A)各 5 U/100 μ L，I XH buffer，總體積為200yL。于37°C酶切3h。回收后進行連接，體系片段各lOOng，T4 DNA Ligase (購買于 Takara 公司，2011A)25U/10 μ L, 1XT4 DNA Ligase buffer，總體積為 10 μ L，16°C連接過夜，使用常規熱休克轉化法進行轉化。
[0021]轉化后，對轉化子增菌，抽提質粒，然后進行酶切鑒定，結果與預期一致(圖3)。將構建好的載體命名為PMT-D (圖4)，該載體序列如SEQ ID N0:2所示。
[0022]實施例3:線粒體DNA的提取
為擴增線粒體復制子ori5序列，本發明以釀酒酵母線粒體基因組DNA (mtDNA)為模板擴增ori5片段。
[0023]本發明以釀酒酵母INVSc I (購買于Invitrogen公司，K5050-01)為材料，28°C培養36h。取ImL菌液，9000g離心獲得細胞，用無菌水洗滌菌體。用lmol/L的山梨醇(購買于上海生工，SB0491)溶液懸起細胞，按照30mg每g酵母濕重添加蝸牛酶(購買于上海生工，SB0870)到菌懸液，37°C消化2h。9000g離心收集細胞，用Tr1n裂解緩沖液(I %Tr1n-XlOO, pH:7.2) 0.5mL小心懸起，上下顛倒混勻。室溫靜置10分鐘，5000g離心收集上清，加入等體積酹氯仿，震蕩混勻，12000r/min離心I分鐘，轉移上清，乙醇沉淀DNA,用60 μ L無菌水懸起。
[0024]實施例4:線粒體復制子ori5的擴增及構建
為了驗證實施例2中構建的線粒體穿梭載體能否用于線粒體復制子研究，本發明利用PCR擴增的方法克隆獲得了線粒體復制子ori5序列，將其構建到pMT-D載體。用于進一步驗證其功能。
[0025]設計引物p0RIl:5’- GCATGCAAATTCATATGATTATTAT -3 ^ ;p0RI2:5’-GTCGACTATAAATAAGTTAATATTTTAT _3入引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以實施例3中獲得的mtDNA為模板擴增釀酒酵母線粒體復制子ori5。反應體系:上、下游引物各0.25pm/y L，0.4mmol/y L 的 dNTP，2 ng/μ L 的 mtDNA 模板，5 U/100 μ L taq DNA 聚合酶(購買于Takara公司，DR001A)，I X taq buffer,總體積為25 μ L。按下面進行反應:93°C，3min 預變性；93°C,30s ；43°C,40s ;72°C，Imin 反應 30 個循環，最后 72°C延伸 1min0 反應結束后進行電泳，EB染色。結果顯示，能夠擴增出預期大小條帶，后續測序顯示與預期序列一致(圖5)。
[0026]隨后將上述片段回收，利用限制性酶切對載體及片段進行酶切，體系:片段AQQng,Sal I (購買于 Takara 公司，1080A)、5M I (購買于 Takara 公司，1246A)各 5 U/100UL,IXH buffer，總體積為200 μ L。于37°C酶切3h。回收后進行連接，體系片段各lOOng，T4 DNA Ligase (購買于 Takara 公司，201 lA)25u/10 μ L, 1XT4 DNA Ligase buffer，總體積為10 μ L，16°C連接過夜。
[0027]轉化后，對轉化子增菌，抽提質粒，然后進行酶切鑒定，結果與預期一致。將構建好的載體命名為PMT I (圖6)。
[0028]實施例5:pMT I轉化釀酒酵母線粒體并PCR鑒定
為驗證pMT-D用于線粒體復制子研究的功能，以實施例4中構建的含有ori5的線粒體穿梭載體PMT 1，轉化釀酒酵母INVSc I，篩選獲得轉化子并初步對轉化子進行PCR鑒定。
[0029]將40yg質粒pMT 1，與新制備的感受態細胞混合，通過電轉化(電擊參數:1500V，200V，25 μ F)的方法轉化到釀酒酵母中，在氯霉素濃度為0.lmg/mL的YPG培養基(Peptone2%, Yeast Extract I %、甘油3 %、Agar 2 %)上進行篩選，獲得轉化子。PCR擴增CAT’基因檢驗pMT I是否轉化到線粒體中。反應體系:上、下游引物0.25pm/yL，0.4mmol/yL的dNTP, 2 ng/μ L的線粒體總DNA模板，5 U/100 μ L taq DNA聚合酶，I X buffer，總體積為25 μ Lo 按下面進行反應:93°C，3min 預變性；93°C，30s ；50°C, 40s ；60°C，2min 反應 30 個循環，最后60°C延伸20min。反應結束后進行電泳，EB染色。
[0030]結果顯示，pMT I成功轉化入線粒體中(圖7)，能夠在酵母線粒體中自主復制，ori5具有復制子功能。
[0031]實施例6:進一步驗證pMT I在線粒體中的復制
以實施例5中獲得的線粒體總DNA，取10 μ L轉化大腸桿菌感受態細胞混合，冰浴20min，42°C熱激2min，冰上處理2min，涂布平板。能夠獲得轉化子(圖8)，將上述獲得的轉化子提取質粒，進行酶切鑒定，體系:質粒200ng，I ,Sph I各5 U/100 μ L, I XHbuffer,總體積為 100 μ L。
[0032]結果顯示，酶切獲得片段與pMT I酶切片段大小一致(圖9)，表明該載體在線粒體中獲得復制，而且氯霉素抗性基因也在酵母線粒體中獲得了表達。因此，PMT-D載體可進一步用作靶向酵母線粒體的穿梭載體、線粒體復制子和啟動子的誘捕載體、酵母線粒體復制子和啟動子功能的研究工具。
【權利要求】
1.一種靶向酵母線粒體的穿梭載體，其特征在于:包括大腸桿菌的質粒復制子、大腸桿菌抗性篩選基因、酵母線粒體啟動子、酵母線粒體復制子、酵母線粒體抗性篩選基因。
2.根據權利要求1所述的靶向酵母線粒體的穿梭載體，其特征在于:大腸桿菌質粒復制子是 pMBl、pl5A、pSC101、ColEl 或 pWVOl。
3.根據權利要求1或2所述的靶向酵母線粒體的穿梭載體，其特征在于:大腸桿菌抗性篩選基因是氨芐青霉素基因、四環素基因、氯霉素基因、卡那霉素基因、新霉素基因或紅霉素基因。
4.根據權利要求3所述的靶向酵母線粒體的穿梭載體，其特征在于:酵母線粒體啟動子是p75或Poxil。
5.根據權利要求4所述的靶向酵母線粒體的穿梭載體，其特征在于:酵母線粒體復制子是 oril、ori2、ori3、ori4、ori5、ori6、ori7 或 ori8。
6.根據權利要求5所述的靶向酵母線粒體的穿梭載體，其特征在于:酵母抗性篩選基因是新霉素基因、Zeocin基因、氣霉素基因、Neocin基因或G418基因。
7.根據權利要求1所述的靶向酵母線粒體的穿梭載體，其特征是:靶向酵母線粒體的穿梭載體核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
8.權利要求1所述靶向酵母線粒體的穿梭載體在酵母線粒體轉化中的應用。
【文檔編號】C12N15/81GK104450768SQ201410653603
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月18日 優先權日:2014年11月18日
【發明者】井申榮, 馬貴興, 黃芬, 曾韋錕 申請人:昆明理工大學