一種拯救流感病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種拯救重組流感病毒的方法。該方法包括：1)將編碼流感病毒雞胚適應株中PB2、PB1、PA、NP、NA、M1和M2、NS1和NS2的cDNA分子以及編碼待拯救流感病毒毒株中PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1和M2、NS1和NS2的cDNA分子這15個cDNA分子每個單獨插入真核細胞表達載體，得到15個重組表達載體。2)將所述15個重組表達載體導入包裝細胞中，得到重組流感病毒。從該拯救重組流感病毒的方法中得到的重組流感病毒疫苗株在雞胚中具有高復制力，比傳統疫苗在雞胚中的生長滴度也要高，通過對疫苗種子毒進行抗原性檢測發(fā)現，疫苗種子毒的抗原性與親本病毒沒有明顯差異。
【專利說明】一種拯救流感病毒的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒疫苗生產領域中一種拯救流感病毒的方法，特別涉及在雞胚中具 有高繁殖力的流感病毒疫苗株的制備方法。
【背景技術】
[0002] H9N2亞型禽流感病毒是一種低致病性禽流感病毒，主要感染雞、鴨、鵝、候鳥等禽 類，但可造成蛋雞的產蛋量嚴重下降，肉雞和青年雞的復合型呼吸道疾病和死淘率升高，造 成嚴重的經濟損失，目前H9N2亞型禽流感病毒已經成為流行于我國雞群中的主要流感病 毒亞型。值得注意的是，H9N2亞型禽流感病毒不僅可以感染禽類，而且無需經過中間宿主 即可突破種間屏障感染哺乳動物和人，自1998年全球首次發(fā)現人感染H9N2亞型禽流感病 毒病例后，人感染H9N2亞型禽流感病毒病例時有發(fā)生，凸顯出其公共衛(wèi)生學意義。因此，對 禽流感病毒進行連續(xù)的分子病毒學監(jiān)測，分析禽流感病毒變異規(guī)律，篩選出合適的疫苗株， 研制出高效、安全、工藝簡單、價格低廉的禽流感病毒疫苗是急需的。
[0003] 全病毒滅活苗是人們主要使用的禽流感疫苗，多用雞胚制備而成。因此，一個理想 的疫苗株首先應該在雞胚中生長良好而且安全，然而，絕大多數流感病毒自然株對雞胚有 致病性，而且病毒的生長滴度也較低，這為大批量生產禽流感疫苗帶來了諸多不便。為了克 服這一缺點，目前多用遺傳重組方法制備高繁殖力的預備疫苗株。
[0004] H9N2亞型禽流感病毒為A型流感病毒，A型流感病毒的基因組為單股負鏈、分節(jié)段 的RNA，共有8個獨立的RNA片段組成，編碼10種蛋白質。片段1-3編碼RNA依賴的RNA聚 合酶，片段1編碼聚合酶亞基PB2,片段2編碼聚合酶亞基PBl，片段3編碼聚合酶亞基PA ; 片段4編碼血凝素 HA，是一種與病毒附著感染有關的表面糖蛋白；片段5編碼核蛋白NP，是 病毒RNA的主要結構部分；片段6編碼神經氨酸酶NA，是一種包膜糖蛋白；片段7編碼兩種 基質蛋白Ml和M2,是非糖基化的結構蛋白；片段8編碼兩種非結構蛋白NSl和NS2。血凝 素 HA和神經氨酸酶NA經常發(fā)生抗原漂移和轉換，是導致流感暴發(fā)的主要原因。
[0005] 人HlNl流感病毒A/PR/8/34(簡稱PR8)是一株雞胚適應病毒株，能在雞胚中有 效地復制。因此，疫苗研制中常常將PR8的6個內部基因與流行毒株的HA和NA基因重組 (6+2模式）構建8質粒拯救系統，將重組病毒作為疫苗株來提高病毒滴度。
【發(fā)明內容】
[0006] 本發(fā)明所要解決的技術問題是如何制備出在雞胚中繁殖力高于傳統6+2模式得 到的重組病毒毒株。
[0007] 為解決上述技術問題，本發(fā)明首先提供了 8+7模式拯救流感病毒的方法，該方法 將流感病毒雞胚適應株的7個基因片段（HA除外）與待拯救流感病毒毒株的8個基因片段 共轉染包裝細胞，使除待拯救流感病毒毒株的編碼HA的RNA片段外的14個RNA片段自由 組合，進行病毒拯救，得到重組流感病毒。
[0008] 本發(fā)明所提供的拯救流感病毒的方法（也就是構建重組流感病毒的方法），包括 以下步驟：
[0009] 1)將編碼流感病毒雞胚適應株中PB2的cDNA分子、編碼所述流感病毒雞胚適應 株中PBl的cDNA分子、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的cDNA分子、編碼所述流感病 毒雞胚適應株中NP的cDNA分子、編碼所述流感病毒雞胚適應株中NA的cDNA分子、編碼所 述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的cDNA分子和編碼所述流感病毒雞胚適應株中NSl和 NS2的cDNA分子，以及編碼待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子、編碼所述待拯救流感 病毒毒株中PBl的cDNA分子、編碼所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子、編碼所述 待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子、編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子、 編碼所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子、編碼所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2 的cDNA分子和編碼所述待搖救流感病毒毒株中NSl和NS2的cDNA分子這15個cDNA分子 每個單獨插入真核細胞表達載體，得到15個重組表達載體，所述15個重組表達載體為下述 al-al5中的重組表達載體：al、含有編碼所述流感病毒雞胚適應株中PB2的cDNA分子的重 組表達載體，其名稱為雞胚適應株PB2基因表達載體；a2、含有編碼所述流感病毒雞胚適應 株中PBl的cDNA分子的重組表達載體，其名稱為雞胚適應株PBl基因表達載體；a3、含有編 碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的cDNA分子的重組表達載體，其名稱為雞胚適應株PA基 因表達載體；a4、含有編碼所述流感病毒雞胚適應株中NP的cDNA分子的重組表達載體，其 名稱為雞胚適應株NP基因表達載體；a5、含有編碼所述流感病毒雞胚適應株中NA的cDNA 分子的重組表達載體，其名稱為雞胚適應株NA基因表達載體；a6、含有編碼所述流感病毒 雞胚適應株中Ml和M2的cDNA分子的重組表達載體，其名稱為雞胚適應株M基因表達載體； a7、含有編碼所述流感病毒雞胚適應株中NSl和NS2的cDNA分子的重組表達載體，其名稱 為雞胚適應株NS基因表達載體；a8、含有編碼所述待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子 的重組表達載體，其名稱為待拯救流感病毒毒株PB2基因表達載體；a9、含有編碼所述待拯 救流感病毒毒株中PBl的cDNA分子的重組表達載體，其名稱為待拯救流感病毒毒株PBl基 因表達載體；alO、含有編碼所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子的重組表達載體，其 名稱為待拯救流感病毒毒株PA基因表達載體；all、含有編碼所述待拯救流感病毒毒株中 HA的cDNA分子的重組表達載體，其名稱為待拯救流感病毒毒株HA基因表達載體；al2、含 有編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子的重組表達載體，其名稱為待拯救流感 病毒毒株NP基因表達載體；al3、含有編碼所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子的重 組表達載體，其名稱為待拯救流感病毒毒株NA基因表達載體；al4、含有編碼所述待拯救流 感病毒毒株中Ml和M2的cDNA分子的重組表達載體，其名稱為待拯救流感病毒毒株M基因 表達載體；al5、含有編碼所述待拯救流感病毒毒株中NSl和NS2的cDNA分子的重組表達載 體，其名稱為待拯救流感病毒毒株NS基因表達載體；
[0010] 2)將所述15個重組表達載體導入包裝細胞中，得到重組流感病毒。
[0011] 上述拯救流感病毒的方法中，所述流感病毒可為A型流感病毒。
[0012] 上述拯救流感病毒的方法中，所述流感病毒雞胚適應株可為A/PR/8/34,所述待拯 救流感病毒毒株可為 A/chicken/Hebei/YT/2010(H9N2)。
[0013] 上述拯救流感病毒的方法中，所述流感病毒雞胚適應株中PB2是SEQ ID No. 9的 第1-2280位核苷酸序列編碼的蛋白質，SEQ ID No. 9由2280個核苷酸組成，其編碼序列是 第1-2280位核苷酸；所述流感病毒雞胚適應株中PBl是SEQ ID No. 15的第1-2274位核苷 酸序列編碼的蛋白質，SEQ ID No. 15由2274個核苷酸組成，其編碼序列是第1-2274位核苷 酸；所述流感病毒雞胚適應株中PA是SEQ ID No. 14的第1-2151位核苷酸序列編碼的蛋白 質，SEQ ID No. 14由2151個核苷酸組成，其編碼序列是第1-2151位核苷酸；所述流感病毒 雞胚適應株中NP是SEQ ID No. 12的第1-1497位核苷酸序列編碼的蛋白質，SEQ ID No. 12 由1497個核苷酸組成，其編碼序列是第1-1497位核苷酸；所述流感病毒雞胚適應株中NA 是SEQ ID No. 11的第1-1365位核苷酸序列編碼的蛋白質，SEQ ID No. 11由1365個核苷酸 組成，其編碼序列是第1-1365位核苷酸；所述流感病毒雞胚適應株中Ml是SEQ ID No. 10的 第1-759位核苷酸序列編碼的蛋白質，所述流感病毒雞胚適應株中M2的氨基酸序列如SEQ ID No. 18所示，所述流感病毒雞胚適應株中M2是SEQ ID No. 10的第1-26位和第715-982 位核苷酸序列編碼的蛋白質，SEQ ID No. 10由982個核苷酸組成，其編碼序列是第1-982 位核苷酸；所述流感病毒雞胚適應株中NSl是SEQ ID No. 13的第1-693位核苷酸序列編碼 的蛋白質，所述流感病毒雞胚適應株中NS2的氨基酸序列如SEQ ID No. 19所示，所述流感 病毒雞胚適應株中NS2是SEQ ID No. 13的第1-30位和第503-838位核苷酸序列編碼的蛋 白質，SEQ ID No. 13由838個核苷酸組成，其編碼序列是第1-838位核苷酸；所述待拯救流 感病毒毒株中PB2是SEQ ID No. 3的第1-2280位核苷酸序列編碼的蛋白質，SEQ ID No. 3 由2280個核苷酸組成，其編碼序列是第1-2280位核苷酸；所述待拯救流感病毒毒株中PBl 是SEQ ID No. 4的第1-2274位核苷酸序列編碼的蛋白質，SEQ ID No. 4由2274個核苷酸 組成，其編碼序列是第1-2274位核苷酸；所述待拯救流感病毒毒株中PA是SEQ ID No. 5的 第1-2151位核苷酸序列編碼的蛋白質，SEQ ID No. 5由2151個核苷酸組成，其編碼序列是 第1-2151位核苷酸；所述待拯救流感病毒毒株中HA是SEQ ID No. 1的第1-1683位核苷 酸序列編碼的蛋白質，SEQ ID No. 1由1683個核苷酸組成，其編碼序列是第1-1683位核苷 酸；所述待拯救流感病毒毒株中NP是SEQ ID No. 6的第1-1497位核苷酸序列編碼的蛋白 質，SEQ ID No. 6由1497個核苷酸組成，其編碼序列是第1-1497位核苷酸；所述待拯救流 感病毒毒株中NA是SEQ ID No. 2的第1-1401位核苷酸序列編碼的蛋白質，SEQ ID No. 2由 1401個核苷酸組成，其編碼序列是第1-1401位核苷酸；所述待拯救流感病毒毒株中Ml是 SEQ ID No. 7的第1-759位核苷酸序列編碼的蛋白質，所述待拯救流感病毒毒株中M2的氨 基酸序列如SEQ ID No. 16所示，所述待拯救流感病毒毒株中M2是SEQ ID No. 7的第1-26 位和第715-982位核苷酸序列編碼的蛋白質，SEQ ID No. 7由982個核苷酸組成，其編碼序 列是第1-982位核苷酸；所述待拯救流感病毒毒株中NSl是SEQ ID No. 8的第1-654位核 苷酸序列編碼的蛋白質，所述待拯救流感病毒毒株中NS2的氨基酸序列如SEQ ID No. 17所 示，所述待拯救流感病毒毒株中NS2是SEQ ID No. 8的第1-30位和第503-838位核苷酸序 列編碼的蛋白質，SEQ ID No. 8由838個核苷酸組成，其編碼序列是第1-838位核苷酸。
[0014] 編碼所述流感病毒雞胚適應株中PB2的cDNA分子是CPB21、CPB22、CPB23或CPB24 的cDNA分子：CPB21、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 9的第1-2280位核苷酸的cDNA 分子；CPB22、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 9的cDNA分子；CPB23、在嚴格條件下與 所述CPB21或所述CPB22限定的cDNA分子雜交且編碼RNA聚合酶PB2亞基的cDNA分子； CPB24、與所述CPB21或所述CPB22限定的cDNA分子具有90 %以上的同一性且編碼所述RNA 聚合酶PB2亞基的cDNA分子；
[0015] 編碼所述流感病毒雞胚適應株中PBl的cDNA分子是CPB11、CPB12、CPB13或CPB14 的cDNA分子：CPBlI、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 15的第1-2274位核苷酸的cDNA 分子；CPB12、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 15的cDNA分子；CPB13、在嚴格條件下與 所述CPBll或所述CPB12限定的cDNA分子雜交且編碼RNA聚合酶PBl亞基的cDNA分子； CPB14、與所述CPBll或所述CPB12限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述RNA 聚合酶PBl亞基的cDNA分子；
[0016] 編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的cDNA分子是CPA1、CPA2、CPA3或CPA4的 cDNA分子：CPA1、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 14的第1-2151位核苷酸的cDNA分 子；CPA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 14的cDNA分子；CPA3、在嚴格條件下與所 述CPAl或所述CPA2限定的cDNA分子雜交且編碼RNA聚合酶PA亞基的cDNA分子；CPA4、 與所述CPAl或所述CPA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述RNA聚合酶 PA亞基的cDNA分子；
[0017] 編碼所述流感病毒雞胚適應株中NP的cDNA分子是CNPl、CNP2、CNP3或CNP4的 cDNA分子：CNPl、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 12的第1-1497位核苷酸的cDNA分 子；CNP2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 12的cDNA分子；CNP3、在嚴格條件下與所述 CNPl或所述CNP2限定的cDNA分子雜交且編碼核蛋白NP的cDNA分子；CNP4、與所述CNPl 或所述CNP2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述核蛋白NP的cDNA分子；
[0018] 編碼所述流感病毒雞胚適應株中NA的cDNA分子是CNAl、CNA2、CNA3或CNA4的 cDNA分子：CNA1、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 11的第1-1365位核苷酸的cDNA分 子；CNA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 11的cDNA分子；CNA3、在嚴格條件下與所 述CNAl或所述CNA2限定的cDNA分子雜交且編碼神經氨酸酶NA的cDNA分子；CNA4、與所 述CNAl或所述CNA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述神經氨酸酶NA的 cDNA分子；
[0019] 編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的cDNA分子是CMl、CM2或CM3的cDNA 分子：CM1、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 10的cDNA分子；CM2、在嚴格條件下與所 述CMl限定的cDNA分子雜交且編碼基質蛋白Ml和M2的cDNA分子；CM3、與所述CMl限定 的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述基質蛋白Ml和M2的cDNA分子；
[0020] 編碼所述流感病毒雞胚適應株中NSl和NS2的cDNA分子是CNSUCNS2或CNS3的 cDNA分子：CNSl、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 13的cDNA分子；CNS2、在嚴格條件 下與所述CNSl限定的cDNA分子雜交且編碼非結構蛋白NSl和NS2的cDNA分子；CNS3、與 所述CNSl限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述非結構蛋白NSl和NS2的 cDNA分子；
[0021] 編碼所述待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子是RPB21、RPB22、RPB23或RPB24 的cDNA分子：RPB21、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 3的第1-2280位核苷酸的cDNA 分子；RPB22、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 3的cDNA分子；RPB23、在嚴格條件下與 所述RPB21或所述RPB22限定的cDNA分子雜交且編碼RNA聚合酶PB2亞基的cDNA分子； RPB24、與所述RPB21或所述RPB22限定的cDNA分子具有90 %以上的同一性且編碼所述RNA 聚合酶PB2亞基的cDNA分子；
[0022] 編碼所述待拯救流感病毒毒株中PBl的cDNA分子是RPB11、RPB12、RPB13或RPB14 的cDNA分子：RPBll、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 4的第1-2274位核苷酸的cDNA 分子；RPB12、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 4的cDNA分子；RPB13、在嚴格條件下與 所述RPBll或所述RPB12限定的cDNA分子雜交且編碼RNA聚合酶PBl亞基的cDNA分子； RPB14、與所述RPB11或所述RPB12限定的cDNA分子具有90 %以上的同一性且編碼所述RNA 聚合酶PBl亞基的cDNA分子；
[0023] 編碼所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子是RPA1、RPA2、RPA3或RPA4的 cDNA分子：RPA1、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 5的第1-2151位核苷酸的cDNA分子； RPA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 5的cDNA分子；RPA3、在嚴格條件下與所述RPAl 或所述RPA2限定的cDNA分子雜交且編碼RNA聚合酶PA亞基的cDNA分子；RPA4、與所述 RPAl或所述RPA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述RNA聚合酶PA亞基 的cDNA分子；
[0024] 編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子是RHA1、RHA2、RHA3或RHA4的 cDNA分子：RHA1、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 1的第1-1683位核苷酸的cDNA分子； RHA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 1的cDNA分子；RHA3、在嚴格條件下與所述RHAl 或所述RHA2限定的cDNA分子雜交且編碼血凝素 HA的cDNA分子；RHA4、與所述RHAl或所 述RHA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述血凝素 HA的cDNA分子；
[0025] 編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子是RNP1、RNP2、RNP3或RNP4的 cDNA分子：RNPl、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 6的第1-1497位核苷酸的cDNA分子； RNP2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 6的cDNA分子；RNP3、在嚴格條件下與所述RNPl 或所述RNP2限定的cDNA分子雜交且編碼核蛋白NP的cDNA分子；RNP4、與所述RNPl或所 述RNP2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述核蛋白NP的cDNA分子；
[0026] 編碼所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子是RNA1、RNA2、RNA3或RNA4的 cDNA分子：RNA1、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 2的第1-1401位核苷酸的cDNA分子； RNA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 2的cDNA分子；RNA3、在嚴格條件下與所述RNAl 或所述RNA2限定的cDNA分子雜交且編碼神經氨酸酶NA的cDNA分子；RNA4、與所述RNAl 或所述RNA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述神經氨酸酶NA的cDNA分 子；
[0027] 編碼所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的cDNA分子是RMl、RM2或RM3的cDNA 分子：RMl、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 7的cDNA分子；RM2、在嚴格條件下與所述 RMl限定的cDNA分子雜交且編碼基質蛋白Ml和M2的cDNA分子；RM3、與所述RMl限定的 cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述基質蛋白Ml和M2的cDNA分子；
[0028] 編碼所述待拯救流感病毒毒株中NSl和NS2的cDNA分子是RNSl、RNS2或RNS3的 cDNA分子：RNSl、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 8的cDNA分子；RNS2、在嚴格條件下 與所述RNSl限定的cDNA分子雜交且編碼非結構蛋白NSl和NS2的cDNA分子；RNS3、與所 述RNSl限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述非結構蛋白NSl和NS2的cDNA 分子。
[0029] 上述拯救流感病毒的方法中，所述包裝細胞可為293T細胞、C0S7細胞、MDCK細胞、 VERO細胞、WI-38、HL-8、HeLa細胞和Chang C/I/L/K細胞中的一種或兩種以上。
[0030] 上述拯救流感病毒的方法中，所述真核細胞表達載體可為PLLB-A或PLLB-G，所述 15個重組表達載體可為如下15個重組表達載體：所述雞胚適應株PB2基因表達載體可為 將編碼所述流感病毒雞胚適應株中PB2的cDNA分子插入pLLB-G的StuI切割位點間得到 的重組表達載體；所述雞胚適應株PBl基因表達載體可為將編碼所述流感病毒雞胚適應株 中PBl的cDNA分子插入pLLB-G的StuI切割位點間得到的重組表達載體；所述雞胚適應 株PA基因表達載體可為將編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的cDNA分子插入pLLB-G的 StuI切割位點間得到的重組表達載體；所述雞胚適應株NP基因表達載體可為將編碼所述 流感病毒雞胚適應株中NP的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位點間得到的重組表達載 體；所述雞胚適應株NA基因表達載體可為將編碼所述流感病毒雞胚適應株中NA的cDNA分 子插入pLLB-A的StuI切割位點間得到的重組表達載體；所述雞胚適應株M基因表達載體 可為將編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位 點間得到的重組表達載體；所述雞胚適應株NS基因表達載體可為將編碼所述流感病毒雞 胚適應株中NSl和NS2的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位點間得到的重組表達載體； 所述待拯救流感病毒毒株PB2基因表達載體可為將編碼所述待拯救流感病毒毒株中PB2的 cDNA分子插入pLLB-G的StuI切割位點間得到的重組表達載體；所述待拯救流感病毒毒株 PBl基因表達載體可為將編碼所述待拯救流感病毒毒株中PBl的cDNA分子插入pLLB-G的 StuI切割位點間得到的重組表達載體；所述待拯救流感病毒毒株中PA基因表達載體可為 將編碼所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子插入pLLB-G的StuI切割位點間得到的 重組表達載體；所述待拯救流感病毒毒株中HA基因表達載體可為將編碼所述待拯救流感 病毒毒株中HA的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位點間得到的重組表達載體；所述待 拯救流感病毒毒株中NP基因表達載體可為將編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA 分子插入pLLB-A的StuI切割位點間得到的重組表達載體；所述待拯救流感病毒毒株中NA 基因表達載體可為將編碼所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子插入pLLB-A的StuI 切割位點間得到的重組表達載體；所述待拯救流感病毒毒株中M基因表達載體可為將編碼 所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位點間得到的 重組表達載體；所述待拯救流感病毒毒株中NS基因表達載體可為將編碼所述待拯救流感 病毒毒株中NSl和NS2的cDNA分子插入pLLB-A的StuI切割位點間得到的重組表達載體。
[0031] 上述拯救流感病毒的方法中，將所述15個重組表達載體按照等質量混合后導入 所述包裝細胞中，得到所述重組流感病毒。
[0032] 由上述拯救流感病毒的方法制備的重組流感病毒也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0033] 上述重組流感病毒中，所述重組流感病毒可為Rl-Rll中任一種重組流感病毒：
[0034] 所述Rl是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述 待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PBl的RNA片段 2、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、編碼所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述待 拯救流感病毒毒株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0035] 所述R2是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述 流感病毒雞胚適應株中PB2的RNA片段1、編碼所述待拯救流感病毒毒株中PBl的RNA片段 2、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述流感病毒雞胚適應株中NP的RNA片段5、編碼所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述待 拯救流感病毒毒株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0036] 所述R3是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述 待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、編碼所述待拯救流感病毒毒株中PBl的RNA片段 2、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、編碼所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述待 拯救流感病毒毒株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0037] 所述R4是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述 待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、編碼所述待拯救流感病毒毒株中PBl的RNA片段 2、編碼所述待拯救流感病毒毒株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、編碼所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述流 感病毒雞胚適應株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0038] 所述R5是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述 流感病毒雞胚適應株中PB2的RNA片段1、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PBl的RNA片段 2、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述流感病毒雞胚適應株中NP的RNA片段5、編碼所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、編碼所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述待 拯救流感病毒毒株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0039] 所述R6是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述 待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PBl的RNA片段 2、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、編碼所述流感病毒雞胚適應 株中NA的RNA片段6、編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述待 拯救流感病毒毒株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0040] 所述R7是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述 待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、編碼所述待拯救流感病毒毒株中PBl的RNA片段 2、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、編碼所述流感病毒雞胚適應 株中NA的RNA片段6、編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述流 感病毒雞胚適應株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0041] 所述R8是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述 待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PBl的RNA片段 2、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、編碼所述流感病毒雞胚適應 株中NA的RNA片段6、編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述流 感病毒雞胚適應株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0042] 所述R9是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述 流感病毒雞胚適應株中PB2的RNA片段I、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PBl的RNA片段 2、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、編碼所述流感病毒雞胚適應 株中NA的RNA片段6、編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述待 拯救流感病毒毒株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0043] 所述RlO是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所 述流感病毒雞胚適應株中PB2的RNA片段1、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PBl的RNA片 段2、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA 的RNA片段4、編碼所述流感病毒雞胚適應株中NP的RNA片段5、編碼所述流感病毒雞胚適 應株中NA的RNA片段6、編碼所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述 待拯救流感病毒毒株中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0044] 所述Rll是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所 述待拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PBl的RNA片 段2、編碼所述待拯救流感病毒毒株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA 的RNA片段4、編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、編碼所述流感病毒雞胚適 應株中NA的RNA片段6、編碼所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述 流感病毒雞胚適應株中NSl和NS2的RNA片段8。
[0045] 本發(fā)明還保護從上述拯救流感病毒的方法（本發(fā)明的8+7模式拯救流感病毒的方 法）中獲得流感病毒疫苗株的方法。
[0046] 本發(fā)明獲得流感病毒疫苗株的方法，包括從上述拯救流感病毒的方法制備的所述 重組流感病毒中篩選得到流感病毒疫苗株的步驟。
[0047] 由上述獲得流感病毒疫苗株的方法制備的流感病毒疫苗株也屬于本發(fā)明的保護 范圍。
[0048] 上述流感病毒疫苗株中，所述流感病毒疫苗株具體可為上述Rl或R2。
[0049] 本發(fā)明還保護在雞胚中繁殖上述重組流感病毒的方法。
[0050] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明的8+7模式將流感病毒雞胚適應株的7個基因片段（HA 除外）與待拯救流感病毒毒株的8個基因片段共轉染包裝細胞，使除HA的RNA片段外的14 個RNA片段自由組合，增加了基因片段的組合方式，使疫苗株的選擇范圍更加廣泛，具有操 作簡便、成本較低等優(yōu)點。從本發(fā)明的8+7模式拯救流感病毒方法得到的重組流感病毒中 能得到在雞胚中具有高效復制力的疫苗株，如本發(fā)明的8+7模式得到的上述Rl和R2疫苗 株在雞胚中的生長滴度比親本毒株（即待拯救毒株）高出10倍之多，比傳統6+2模式得到 的疫苗株在雞胚中的生長滴度也要高出10倍（Rl和R2的生長滴度均為IO 9 8EID5cZmL，待 拯救流感病毒毒株A/chicken/Hebei/YT/2010 (H9N2)的生長滴度為108_ 5EID5qAiL，傳統6+2 模式得到的疫苗株R37的生長滴度為108_ 8EID5ciAiL)。通過對疫苗種子毒進行抗原性檢測發(fā) 現，本發(fā)明的8+7模式得到的疫苗種子毒的抗原性與親本病毒沒有明顯差異。用本發(fā)明的 8+7模式得到的疫苗種子毒免疫SPF雞后HI抗體水平都達到2 8以上。本發(fā)明的8+7模式 拯救流感病毒的方法可在拯救流感病毒和制備流感病毒疫苗中得到廣泛的應用。
【具體實施方式】
[0051] 下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0052] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0053] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0054] 下述實施例中所用的 A/PR/8/34(Abt. M, dejongej, etal. Improvement of H5N1influenza vaccine viruses:Influence of internal gene segments of avian and human origin on production and hemagglutinin content. Vaccine. 2011，29:5153-5162)，公眾可從中國農業(yè)大學獲得，該生物材料只為重復本發(fā)明 的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。
[0055] 下述實施例中所用的 A/chicken/Hebei/YT/2〇10(H9N2) (GenBank:KC82l269· 1) 公眾可從中國農業(yè)大學獲得，該生物材料只為重復本發(fā)明的相關實驗所用，不可作為其它 用途使用。
[0056] 下述實施例中所用的表達載體pLLB-A和pLLB-G (劉金華等，用于構建流感病毒的 反向遺傳系統的載體及應用，CN 101343636A)，公眾可從中國農業(yè)大學獲得，該生物材料只 為重復本發(fā)明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。
[0057] 下面以A/PR/8/34(簡稱PR8)作為流感病毒雞胚適應株，以A/chicken/Hebei/ YT/2010(H9N2)(簡稱YT)作為待拯救流感病毒毒株，闡述本申請的拯救流感病毒的方法。
[0058] 實施例1、利用本發(fā)明的反向遺傳操作技術進行流感病毒的拯救
[0059] 一、8+7模式構建重組流感病毒
[0060] 本步驟采用8+7模式進行流感病毒的拯救，其方法如下：將編碼PR8中PB2的cDNA 分子、編碼PR8中PBl的cDNA分子、編碼PR8中PA的cDNA分子、編碼PR8中NP的cDNA分 子、編碼PR8中NA的cDNA分子、編碼PR8中Ml和M2的cDNA分子和編碼PR8中NSl和NS2 的cDNA分子，以及編碼YT中PB2的cDNA分子、編碼YT中PBl的cDNA分子、編碼YT中PA 的cDNA分子、編碼YT中HA的cDNA分子、編碼YT中NP的cDNA分子、編碼YT中NA的cDNA 分子、編碼YT中Ml和M2的cDNA分子和編碼YT中NSl和NS2的cDNA分子這15個cDNA 分子每個單獨插入真核細胞表達載體，得到15個重組表達質粒，所述15個重組表達質粒為 下述al_al5中的重組表達質粒：
[0061] al、含有編碼PR8中PB2的cDNA分子的重組表達質粒，其名稱為PR8-PB2基因表 達質粒；
[0062] a2、含有編碼PR8中PBl的cDNA分子的重組表達質粒，其名稱為PR8-PB1基因表 達質粒；
[0063] a3、含有編碼PR8中PA的cDNA分子的重組表達質粒，其名稱為PR8-PA基因表達 質粒；
[0064] a4、含有編碼PR8中NP的cDNA分子的重組表達質粒，其名稱為PR8-NP基因表達 質粒；
[0065] a5、含有編碼PR8中NA的cDNA分子的重組表達質粒，其名稱為PR8-NA基因表達 質粒；
[0066] a6、含有編碼PR8中Ml和M2的cDNA分子的重組表達質粒，其名稱為PR8-M基因 表達質粒；
[0067] a7、含有編碼PR8中NSl和NS2的cDNA分子的重組表達質粒，其名稱PR8-NS基因 表達質粒；
[0068] a8、含有編碼YT中PB2的cDNA分子的重組表達質粒，其名稱為YT-PB2基因表達 質粒；
[0069] a9、含有編碼YT中PBl的cDNA分子的重組表達質粒，其名稱為YT-PBl基因表達 質粒；
[0070] alO、含有編碼YT中PA的cDNA分子的重組表達質粒，其名稱為YT-PA基因表達質 粒；
[0071] all、含有編碼YT中HA的cDNA分子的重組表達質粒，其名稱為YT-HA基因表達質 粒；
[0072] al2、含有編碼YT中NP的cDNA分子的重組表達質粒，其名稱為YT-NP基因表達質 粒；
[0073] al3、含有編碼YT中NA的cDNA分子的重組表達質粒，其名稱為YT-NA基因表達質 粒；
[0074] al4、含有編碼YT中Ml和M2的cDNA分子的重組表達質粒，其名稱為YT-M基因表 達質粒；
[0075] al5、含有編碼YT中NSl和NS2的cDNA分子的重組表達質粒，其名稱為YT-NS基 因表達質粒；
[0076] 將所述15個重組表達質粒導入包裝細胞中，得到重組流感病毒。
[0077] 其中，編碼PR8中PB2的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 9的第 1-2280位核苷酸的cDNA分子；編碼PR8中PBl的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 15的第1-2274位核苷酸的cDNA分子；編碼PR8中PA的cDNA分子的核苷酸序列是 序列表中SEQ ID No. 14的第1-2151位核苷酸的cDNA分子；編碼PR8中NP的cDNA分子的 核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 12的第1-1497位核苷酸的cDNA分子；編碼PR8中NA 的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 11的第1-1365位核苷酸的cDNA分子； 編碼PR8中Ml和M2的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 10的cDNA分子；編 碼PR8中NSl和NS2的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 13的cDNA分子；編 碼YT中PB2的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 3的第1-2280位核苷酸的 cDNA分子；編碼YT中PBl的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 4的第1-2274 位核苷酸的cDNA分子；編碼YT中PA的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 5 的第1-2151位核苷酸的cDNA分子；編碼YT中HA的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中 SEQ ID No. 1的第1-1683位核苷酸的cDNA分子；編碼YT中NP的cDNA分子的核苷酸序列 是序列表中SEQ ID No. 6的第1-1497位核苷酸的cDNA分子；編碼YT中NA的cDNA分子的 核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 2的第1-1401位核苷酸的cDNA分子；編碼YT中Ml和 M2的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 7的cDNA分子；編碼YT中NSl和NS2 的cDNA分子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 8的cDNA分子。
[0078] 真核細胞表達載體為pLLB-G或pLLB-A，包裝細胞為293T細胞。
[0079] 具體方法如下：
[0080] 1、制備15個重組表達質粒
[0081] 制備PB2基因的重組表達質粒pLLB-PR8-PB2，pLLB-PR8-PB2是在pLLB-G的 StuI切割位點間插入SEQ ID No. 9所示的cDNA分子，其它核苷酸不變得到的重組表達質 粒；制備PBl基因的重組表達質粒pLLB-PR8-PBl，pLLB-PR8-PBl是在pLLB-G的StuI切 割位點間插入SEQ ID No. 15所示的cDNA分子，其它核苷酸不變得到的重組表達質粒；制 備PA基因的重組表達質粒pLLB-PR8-PA，pLLB-PR8-PA是在pLLB-G的StuI切割位點間插 入SEQ ID No. 14所示的cDNA分子，其它核苷酸不變得到的重組表達質粒；制備NP基因 的重組表達質粒PLLB-PR8-NP，pLLB-PR8-NP是在pLLB-A的StuI切割位點間插入SEQ ID No. 12所示的cDNA分子，其它核苷酸不變得到的重組表達質粒；制備NA基因的重組表達 質粒 PLLB-PR8-NA，pLLB-PR8-NA 是在 pLLB-A 的 StuI 切割位點間插入 SEQ ID No. 11 所 示的cDNA分子，其它核苷酸不變得到的重組表達質粒；制備Ml和M2基因的重組表達質 粒PLLB-PR8-M，pLLB-PR8-M是在pLLB-A的StuI切割位點間插入SEQ ID No. 10所示的 cDNA分子，其它核苷酸不變得到的重組表達質粒；制備NSl和NS2基因的重組表達質粒 pLLB-PR8-NS，pLLB-PR8-NS 是在pLLB-A 的 StuI 切割位點間插入 SEQ ID No. 13 所示的 cDNA 分子，其它核苷酸不變得到的重組表達質粒；制備PB2基因的重組表達質粒pLLB-YT-PB2， PLLB-YT-PB2是在pLLB-G的StuI切割位點間插入SEQ ID No. 3所示的cDNA分子，其它核 苷酸不變得到的重組表達質粒；制備PBl基因的重組表達質粒pLLB-YT-PBl，pLLB-YT-PBl 是在pLLB-G的StuI切割位點間插入SEQ ID No. 4所示的cDNA分子，其它核苷酸不變得 到的重組表達質粒；制備PA基因的重組表達質粒pLLB-YT-PA，pLLB-YT-PA是在pLLB-G的 StuI切割位點間插入SEQ ID No. 5所示的cDNA分子，其它核苷酸不變得到的重組表達質 粒；制備HA基因的重組表達質粒pLLB-YT-HA，pLLB-YT-HA是在pLLB-A的StuI切割位點間 插入SEQ ID No. 1所示的cDNA分子，其它核苷酸不變得到的重組表達質粒；制備NP基因的 重組表達質粒pLLB-YT-NP，pLLB-YT-NP是在pLLB-A的StuI切割位點間插入SEQ ID No. 6 所示的cDNA分子，其它核苷酸不變得到的重組表達質粒；制備NA基因的重組表達質粒 pLLB-YT-NA，pLLB-YT-NA 是在 pLLB-A 的 StuI 切割位點間插入 SEQ ID No. 2 所示的 cDNA 分 子，其它核苷酸不變得到的重組表達質粒；制備Ml和M2基因的重組表達質粒pLLB-YT-M， pLLB-YT-M是在pLLB-A的StuI切割位點間插入SEQ ID No. 7所示的cDNA分子，其它核苷酸 不變得到的重組表達質粒；制備NSl和NS2基因的重組表達質粒pLLB-YT-NS，pLLB-YT-NS 是在pLLB-A的StuI切割位點間插入SEQ ID No. 8所示的cDNA分子，其它核苷酸不變得到 的重組表達質粒。
[0082] 2、反向遺傳操作技術制備重組流感病毒進行病毒的拯救
[0083] 1)包裝細胞的準備：將293T細胞和MDCK細胞按照2:1的比例鋪于6孔細胞板， 鋪板后18-24h進行轉染，此時細胞85%左右融合，進行轉染前用PBS緩沖液輕輕洗兩次細 胞。
[0084] 2)混合重組表達質粒：將步驟1中的15個重組表達質粒等質量混合（500ng)加 入I. 5mL離心管中。
[0085] 3)轉染：向已加入重組表達載體的I. 5mL離心管中加入200 μ L Opti-MEM培養(yǎng)基 (無血清、無抗生素）和IOuL Lipofectmine 2000轉染試劑，瞬時離心以混勻，室溫放置 45min后再加入700 μ L Opti-MEM培養(yǎng)基于離心管中。吸凈6孔板中的細胞液，用PBS緩沖 液洗兩次后，吸凈殘余的PBS ;將I. 5mL離心管中的液體全部移入6孔板中，37°C培養(yǎng)6h，隨 后加入含有2 μ g/mL TPCK-胰酶的Opti-MEM培養(yǎng)基于6孔板中，ImL/孔，37°C培養(yǎng)48-72h 后，置于_80°C保存?zhèn)溆?。轉染40塊6孔板,共240個孔。
[0086] 4)重組流感病毒毒株的增殖：將轉染后凍存的細胞液從-80°C冰箱中取出，待其 融化后吹打混勻細胞液，接種雞胚，35°C孵化箱中培養(yǎng)48-72h后，將雞胚置于4°C冰箱中凍 過夜，收獲尿囊液，測定其凝集紅細胞的活性。若無血凝活性，則盲傳一代，放棄仍無血凝活 性的樣本，得到重組流感病毒。
[0087] 3、重組流感病毒的傳代與鑒定
[0088] 1)、重組流感病毒的傳代
[0089] 將步驟2的重組流感病毒在雞胚上進行連續(xù)傳代，將含重組流感病毒的尿囊液分 別以10'10'KT 4稀釋度接種雞胚，挑選出HA效價最高的重組流感病毒尿囊液再以相同 的方式接種雞胚，在雞胚中連續(xù)傳10代。
[0090] 2)重組流感病毒的鑒定
[0091] 在MDCK細胞長至90%時鋪板，將傳代的重組流感病毒尿囊液用含有1 %雙抗（青 霉素和鏈霉素）的DMEM進行10倍倍比稀釋。用PBS緩沖液洗兩次后，每孔加入400-600 μ L 重組流感病毒尿囊液，輕搖混勻，使重組流感病毒尿囊液均勻覆蓋，置于CO2培養(yǎng)箱37°C孵 育lh。在孵育終止前5-10min，將含有TPCK-胰酶的雙抗DMEM與4%瓊脂按照3:1比例混 合，吹吸混勻，使覆蓋液中TPCK-胰酶終濃度為2-5 μ g/mL。孵育終止后，將細胞板中重組流 感病毒尿囊液棄掉，每孔加入3mL覆蓋液，置于4°C冰箱15-20min使之凝固，之后移入CO 2 培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)，24h后開始觀察空斑形成情況（每12h觀察一次）。待出現空班后，用白 槍頭將斑挑下，置于含雙抗DMHM的I. 5mL離心管中，震蕩混勻后接種雞胚，收獲尿囊液，對 病毒進行全基因組序列測定。
[0092] 測序結果表明按照上述8+7模式得到了 36種重組流感病毒，其病毒名稱分別為 R1-R36,如表1所示：
[0093] Rl的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中PB2 的RNA片段1、編碼PR8中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml和M2 的RNA片段7、編碼YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0094] R2的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼PR8中PB2 的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼PR8中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml和M2 的RNA片段7、編碼YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0095] R3的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中PB2 的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼所述YT中 HA的RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml 和M2的RNA片段7、編碼YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0096] R4的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中PB2 的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼YT中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml和M2 的RNA片段7、編碼PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0097] R5的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼PR8中PB2 的RNA片段1、編碼PR8中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼PR8中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼YT中Ml和M2 的RNA片段7、編碼YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0098] R6的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中PB2 的RNA片段1、編碼PR8中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼PR8中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml和M2 的RNA片段7、編碼YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0099] R7的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中PB2 的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼PR8中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml和M2 的RNA片段7、編碼PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0100] R8的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中PB2 的RNA片段1、編碼PR8中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼PR8中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml和M2 的RNA片段7、編碼PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0101] R9的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼PR8中PB2 的RNA片段1、編碼PR8中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼PR8中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml和M2 的RNA片段7、編碼YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0102] RlO的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼PR8中 PB2的RNA片段1、編碼PR8中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中 HA的RNA片段4、編碼PR8中NP的RNA片段5、編碼PR8中NA的RNA片段6、編碼YT中Ml 和M2的RNA片段7、編碼YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0103] Rll的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中PB2 的RNA片段1、編碼PR8中PBl的RNA片段2、編碼YT中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼PR8中NA的RNA片段6、編碼YT中Ml和M2 的RNA片段7、編碼PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0104] R12的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中PB2 的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼YT中Ml和M2的 RNA片段7、編碼PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0105] R13的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼PR8中 PB2的RNA片段1、編碼PR8中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中 HA的RNA片段4、編碼PR8中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml 和M2的RNA片段7、編碼PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0106] R14的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中PB2 的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼YT中Ml和M2的 RNA片段7、編碼YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0107] R15的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中 PB2的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼YT中PA的RNA片段3、編碼YT中HA 的RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml和 M2的RNA片段7、編碼YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0108] R16的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼PR8中 PB2的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中HA 的RNA片段4、編碼PR8中NP的RNA片段5、編碼PR8中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml和 M2的RNA片段7、編碼PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0109] R17的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼PR8中 PB2的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中HA 的RNA片段4、編碼PR8中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼YT中Ml和 M2的RNA片段7、編碼YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0110] R18的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中PB2 的RNA片段1、編碼PR8中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml和M2 的RNA片段7、編碼PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0111] R19的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中PB2 的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼PR8中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml和M2 的RNA片段7、編碼PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0112] R20的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中PB2 的RNA片段1、編碼PR8中PBl的RNA片段2、編碼YT中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml和M2 的RNA片段7、編碼PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0113] R21的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中PB2 的RNA片段1、編碼PR8中PBl的RNA片段2、編碼YT中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼YT中Ml和M2的 RNA片段7、編碼YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0114] R22的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中 PB2的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼YT中PA的RNA片段3、編碼YT中HA 的RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼YT中Ml和M2 的RNA片段7、編碼PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0115] R23的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中PB2 的RNA片段1、編碼PR8中PBl的RNA片段2、編碼YT中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼YT中Ml和M2的 RNA片段7、編碼PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0116] R24的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼PR8中 PB2的RNA片段1、編碼PR8中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中 HA的RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼PR8中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml 和M2的RNA片段7、編碼PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0117] R25的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中 PB2的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼YT中PA的RNA片段3、編碼YT中HA 的RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼PR8中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml和 M2的RNA片段7、編碼YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0118] R26的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼PR8中 PB2的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼YT中PA的RNA片段3、編碼YT中HA 的RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml和 M2的RNA片段7、編碼PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0119] R27的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中PB2 的RNA片段1、編碼PR8中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼YT中Ml和M2的 RNA片段7、編碼PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0120] R28的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼PR8中 PB2的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中HA 的RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml和 M2的RNA片段7、編碼PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0121] R29的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼PR8中 PB2的RNA片段1、編碼PR8中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中 HA的RNA片段4、編碼PR8中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml 和M2的RNA片段7、編碼YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0122] R30的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼PR8中 PB2的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼YT中PA的RNA片段3、編碼YT中HA 的RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼YT中Ml和M2 的RNA片段7、編碼YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0123] R31的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中PB2 的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼PR8中NA的RNA片段6、編碼YT中Ml和M2 的RNA片段7、編碼YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0124] R32的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中PB2 的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼PR8中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml和M2 的RNA片段7、編碼YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0125] R33的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼PR8中 PB2的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中HA 的RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼PR8中NA的RNA片段6、編碼PR8中Ml和 M2的RNA片段7、編碼PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0126] R34的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中PB2 的RNA片段I、編碼PR8中PBl的RNA片段2、編碼YT中PA的RNA片段3、編碼YT中HA的 RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼所述YT中NA的RNA片段6、編碼所述PR8中 Ml和M2的RNA片段7、編碼所述YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0127] R35的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼YT中 PB2的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼YT中PA的RNA片段3、編碼YT中HA 的RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼PR8中NA的RNA片段6、編碼YT中Ml和 M2的RNA片段7、編碼YT中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0128] R36的基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼PR8中 PB2的RNA片段1、編碼YT中PBl的RNA片段2、編碼PR8中PA的RNA片段3、編碼YT中HA 的RNA片段4、編碼YT中NP的RNA片段5、編碼YT中NA的RNA片段6、編碼YT中Ml和M2 的RNA片段7、編碼PR8中NSl和NS2的RNA片段8 ;
[0129] 上述36種重組流感病毒中，編碼PR8中PB2的RNA片段1的核苷酸序列均是將 SEQ ID No. 9的第1-2280位核苷酸所示單鏈的反向互補鏈中的T均替換為U得到的單鏈 核糖核酸；編碼PR8中PBl的RNA片段2的核苷酸序列均是將SEQ ID No. 15的第1-2274 位核苷酸所示單鏈的反向互補鏈中的T均替換為U得到的單鏈核糖核酸；編碼PR8中PA的 RNA片段3的核苷酸序列均是將SEQ ID No. 14的第1-2151位核苷酸所示單鏈的反向互補 鏈中的T均替換為U得到的單鏈核糖核酸；編碼PR8中NP的RNA片段5的核苷酸序列均是 將SEQ ID No. 12的第1-1497位核苷酸所示單鏈的反向互補鏈中的T均替換為U得到的單 鏈核糖核酸；編碼PR8中NA的RNA片段6的核苷酸序列均是將SEQ ID No. 11的第1-1365 位核苷酸所示單鏈的反向互補鏈中的T均替換為U得到的單鏈核糖核酸；編碼PR8中Ml和 M2的RNA片段7的核苷酸序列均是將SEQ ID No. 10的第1-982位核苷酸所示單鏈的反向 互補鏈中的T均替換為U得到的單鏈核糖核酸；編碼PR8中NSl和NS2的RNA片段8的核 苷酸序列均是將SEQ ID No. 13的第1-838位核苷酸所示單鏈的反向互補鏈中的T均替換 為U得到的單鏈核糖核酸；編碼YT中PB2的RNA片段1的核苷酸序列均是將SEQ ID No. 3 的第1-2280位核苷酸所示單鏈的反向互補鏈中的T均替換為U得到的單鏈核糖核酸；編碼 YT中PBl的RNA片段2的核苷酸序列均是將SEQ ID No. 4的第1-2274位核苷酸所示單鏈 的反向互補鏈中的T均替換為U得到的單鏈核糖核酸；編碼YT中PA的RNA片段3的核苷 酸序列均是將SEQ ID No. 5的第1-2151位核苷酸所示單鏈的反向互補鏈中的T均替換為U 得到的單鏈核糖核酸；編碼YT中HA的RNA片段4的核苷酸序列均是將SEQ ID No. 1的第 1-1683位核苷酸所示單鏈的反向互補鏈中的T均替換為U得到的單鏈核糖核酸；編碼YT中 NP的RNA片段5的核苷酸序列均是將SEQ ID No. 6的第1-1497位核苷酸所示單鏈的反向 互補鏈中的T均替換為U得到的單鏈核糖核酸；編碼YT中NA的RNA片段6的核苷酸序列 均是將SEQ ID No. 2的第1-1401位核苷酸所示單鏈的反向互補鏈中的T均替換為U得到 的單鏈核糖核酸；編碼YT中Ml和M2的RNA片段7的核苷酸序列均是將SEQ ID No. 7的第 1-982位核苷酸所示單鏈的反向互補鏈中的T均替換為U得到的單鏈核糖核酸；編碼YT中 NSl和NS2的RNA片段8的核苷酸序列均是將SEQ ID No. 8的第1-838位核苷酸所示單鏈 的反向互補鏈中的T均替換為U得到的單鏈核糖核酸。
[0130] 二、6+2模式構建重組流感病毒
[0131] 按照現有的6+2模式構建重組流感病毒，具體方法如下：將步驟一中的15個重 組表達質粒替換為步驟一中的如下8個重組表達質粒制備重組流感病毒：pLLB-PR8-PB2、 PLLB-PR8-PB1、pLLB-PR8-PA、pLLB-YT-HA、pLLB-PR8-NP、pLLB-YT-NA、pLLB-PR8-M 和 PLLB-PR8-NS。除了用上述8個重組表達質粒轉染包裝細胞外，其它操作與步驟一相同，得 到的重組流感病毒只有一種，其名稱為R37,其基因組RNA與R13完全相同。
[0132] 三、重組流感病毒EID5tlAiL及紅細胞凝集效價的測定
[0133] 1、重組流感病毒EID5tlAiL的測定
[0134] 1)雞胚的選擇與標記：將9-lld雞胚置于暗室，用照蛋器觀察，選擇可自由晃動， 血管清晰的健康雞胚，剔除血管細、不清晰的弱雞胚，標記出每個雞胚的氣室，避開大血管 記。
[0135] 2)重組流感病毒液倍比稀釋：試驗前30min從_80°C冰箱中將凍存的重組流感病 毒液取出，置于4°C冰箱中自然融化。準備10個1.5mL滅菌離心管，每管中加入900yL含 雙抗的PBS緩沖液。第一管中加入100 μ L重組流感病毒原液，充分混勻后吸出100 μ L至 第二管，依次進行10倍倍比稀釋至第十管，做好標記，倍比稀釋后的重組流感病毒液置于 冰上保存。
[0136] 3)接種重組流感病毒：將標記好的雞胚分別用碘酊和75%乙醇消毒，打孔器消毒 后在氣室上方和胚體標記處打孔。將ImL注射器沿胚體處小孔插入0. 5cm，注入0. ImL接種 物，每個稀釋度重組流感病毒液接種3個雞胚，做好標記。石蠟封口，置孵化箱中孵育，每天 檢查兩次，及時將死亡雞胚置于4°C冰箱中。
[0137] 4)檢測：接毒48_72h后將雞胚置于4°C冰箱中過夜，凍死雞胚，防止出血。將雞胚 表面用酒精消毒后，用鑷子將氣室打開，用移液槍吸取25 μ L重組流感病毒尿囊液至96孔 血凝板，進行血凝實驗。計算出36株重組流感病毒尿囊液的EID5Q/mL，挑選出重組流感病 毒尿囊液EID 5tlAiL較高的重組流感病毒作為疫苗候選株。重組病毒株尿囊液的EID5ciAiL值 見表1。結果表明，采用8+7模式得到的重組流感病毒毒株Rl-Rll尿囊液的EID 5ciAiL高于 采用6+2模式得到的重組流感病毒毒株R37尿囊液的EID5(l/mL。
[0138] 2、重組流感病毒紅細胞凝集效價的測定
[0139] 用微量移液器向反應板的每孔加生理鹽水25 μ L，用微量移液器吸取抗原（待測 重組流感病毒毒株的尿囊液）25 μ L于第1孔中并擠壓6次混勻，吸出25 μ L至第2孔，依次 進行2倍倍比稀釋到第11孔，棄去25 μ L。向每孔中依次加入25 μ L 1%紅細胞懸液置于 微量振蕩器上震蕩lmin，室溫靜置30min后觀察實驗結果。結果判定：將反應板傾斜45°， 沉于孔底的紅細胞沿著傾斜面向下呈線狀流動者為沉淀，表明紅細胞未被或者不完全被病 毒凝集；如果孔底的紅細胞鋪平孔底，凝集成均勻薄層，傾斜后紅細胞不流動，表明紅細胞 被病毒所凝集。能使雞紅細胞完全凝集的抗原的最高稀釋倍數，稱為該抗原紅細胞凝集效 價（Hemagglutinin test,簡稱HA)，即沉淀的前一孔的稀釋倍數為該抗原的效價。重組流 感病毒毒株的尿囊液HA滴度見表1。結果表明，采用8+7模式得到的重組流感病毒Rl-Rll 尿囊液的HA滴度高于采用6+2模式得到的重組流感病毒R37尿囊液。
[0140] 表1、重組流感病毒毒株及YT原毒尿囊液的EID5ciAiL及HA滴度
[0141]
【權利要求】
1.拯救流感病毒的方法，包括以下步驟： 1)將編碼流感病毒雞胚適應株中PB2的cDNA分子、編碼所述流感病毒雞胚適應株中 PB1的cDNA分子、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的cDNA分子、編碼所述流感病毒雞胚 適應株中NP的cDNA分子、編碼所述流感病毒雞胚適應株中NA的cDNA分子、編碼所述流感 病毒雞胚適應株中Ml和M2的cDNA分子和編碼所述流感病毒雞胚適應株中NS1和NS2的 cDNA分子，以及編碼待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子、編碼所述待拯救流感病毒毒 株中PB1的cDNA分子、編碼所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子、編碼所述待拯救流 感病毒毒株中HA的cDNA分子、編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子、編碼所述 待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子、編碼所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的cDNA 分子和編碼所述待搖救流感病毒毒株中NS1和NS2的cDNA分子這15個cDNA分子每個單 獨插入真核細胞表達載體，得到15個重組表達載體，所述15個重組表達載體為下述al_al5 中的重組表達載體： al、含有編碼所述流感病毒雞胚適應株中PB2的cDNA分子的重組表達載體，其名稱為 雞胚適應株PB2基因表達載體； a2、含有編碼所述流感病毒雞胚適應株中PB1的cDNA分子的重組表達載體，其名稱為 雞胚適應株PB1基因表達載體； a3、含有編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的cDNA分子的重組表達載體，其名稱為雞 胚適應株PA基因表達載體； a4、含有編碼所述流感病毒雞胚適應株中NP的cDNA分子的重組表達載體，其名稱為雞 胚適應株NP基因表達載體； a5、含有編碼所述流感病毒雞胚適應株中NA的cDNA分子的重組表達載體，其名稱為雞 胚適應株NA基因表達載體； a6、含有編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的cDNA分子的重組表達載體，其名 稱為雞胚適應株M基因表達載體； a7、含有編碼所述流感病毒雞胚適應株中NS1和NS2的cDNA分子的重組表達載體，其 名稱為雞胚適應株NS基因表達載體； a8、含有編碼所述待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子的重組表達載體，其名稱為 待拯救流感病毒毒株PB2基因表達載體； a9、含有編碼所述待拯救流感病毒毒株中PB1的cDNA分子的重組表達載體，其名稱為 待拯救流感病毒毒株PB1基因表達載體； al〇、含有編碼所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子的重組表達載體，其名稱為 待拯救流感病毒毒株PA基因表達載體； all、含有編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子的重組表達載體，其名稱為 待拯救流感病毒毒株HA基因表達載體； al2、含有編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子的重組表達載體，其名稱為 待拯救流感病毒毒株NP基因表達載體； al3、含有編碼所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子的重組表達載體，其名稱為 待拯救流感病毒毒株NA基因表達載體； al4、含有編碼所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的cDNA分子的重組表達載體，其名 稱為待拯救流感病毒毒株M基因表達載體； al5、含有編碼所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的cDNA分子的重組表達載體，其 名稱為待拯救流感病毒毒株NS基因表達載體； 2)將所述15個重組表達載體導入包裝細胞中，得到重組流感病毒。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述流感病毒為A型流感病毒。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述流感病毒雞胚適應株中PB2是 SEQ ID No. 9的第1-2280位核苷酸序列編碼的蛋白質；所述流感病毒雞胚適應株中PB1是 SEQ ID No. 15的第1-2274位核苷酸序列編碼的蛋白質；所述流感病毒雞胚適應株中PA是 SEQ ID No. 14的第1-2151位核苷酸序列編碼的蛋白質；所述流感病毒雞胚適應株中NP是 SEQ ID No. 12的第1-1497位核苷酸序列編碼的蛋白質；所述流感病毒雞胚適應株中NA是 SEQ ID No. 11的第1-1365位核苷酸序列編碼的蛋白質；所述流感病毒雞胚適應株中Ml是 SEQ ID No. 10的第1-759位核苷酸序列編碼的蛋白質，所述流感病毒雞胚適應株中M2的 氨基酸序列如SEQ ID No. 18所示；所述流感病毒雞胚適應株中NS1是SEQ ID No. 13的第 1-693位核苷酸序列編碼的蛋白質，所述流感病毒雞胚適應株中NS2的氨基酸序列如SEQ ID No. 19所示；所述待拯救流感病毒毒株中PB2是SEQ ID No. 3的第1-2280位核苷酸序 列編碼的蛋白質；所述待拯救流感病毒毒株中PB1是SEQ ID No. 4的第1-2274位核苷酸序 列編碼的蛋白質；所述待拯救流感病毒毒株中PA是SEQ ID No. 5的第1-2151位核苷酸序 列編碼的蛋白質；所述待拯救流感病毒毒株中HA是SEQ ID No. 1的第1-1683位核苷酸序 列編碼的蛋白質；所述待拯救流感病毒毒株中NP是SEQ ID No. 6的第1-1497位核苷酸序 列編碼的蛋白質；所述待拯救流感病毒毒株中NA是SEQ ID No. 2的第1-1401位核苷酸序 列編碼的蛋白質；所述待拯救流感病毒毒株中Ml是SEQ ID No. 7的第1-759位核苷酸序列 編碼的蛋白質，所述待拯救流感病毒毒株中M2的氨基酸序列如SEQ ID No. 16所示；所述待 拯救流感病毒毒株中NS1是SEQ ID No. 8的第1-654位核苷酸序列編碼的蛋白質，所述待 拯救流感病毒毒株中NS2的氨基酸序列如SEQ ID No. 17所示。
4. 根據權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于： 編碼所述流感病毒雞胚適應株中PB2的cDNA分子是CPB21、CPB22、CPB23或CPB24的 cDNA分子： CPB21、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 9的第1-2280位核苷酸的cDNA分子； CPB22、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 9的cDNA分子； CPB23、在嚴格條件下與所述CPB21或所述CPB22限定的cDNA分子雜交且編碼RNA聚 合酶PB2亞基的cDNA分子； CPB24、與所述CPB21或所述CPB22限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所 述RNA聚合酶PB2亞基的cDNA分子； 編碼所述流感病毒雞胚適應株中PB1的cDNA分子是CPB11、CPB12、CPB13或CPB14的 cDNA分子： CPB11、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 15的第1-2274位核苷酸的cDNA分子； CPB12、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 15的cDNA分子； CPB13、在嚴格條件下與所述CPB11或所述CPB12限定的cDNA分子雜交且編碼RNA聚 合酶PB1亞基的cDNA分子； CPB14、與所述CPB11或所述CPB12限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所 述RNA聚合酶PB1亞基的cDNA分子； 編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的cDNA分子是CPA1、CPA2、CPA3或CPA4的cDNA 分子： CPA1、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 14的第1-2151位核苷酸的cDNA分子； CPA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 14的cDNA分子； CPA3、在嚴格條件下與所述CPA1或所述CPA2限定的cDNA分子雜交且編碼RNA聚合酶 PA亞基的cDNA分子； CPA4、與所述CPA1或所述CPA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述 RNA聚合酶PA亞基的cDNA分子； 編碼所述流感病毒雞胚適應株中NP的cDNA分子是CNP1、CNP2、CNP3或CNP4的cDNA 分子： CNP1、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 12的第1-1497位核苷酸的cDNA分子； CNP2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 12的cDNA分子； CNP3、在嚴格條件下與所述CNP1或所述CNP2限定的cDNA分子雜交且編碼核蛋白NP 的cDNA分子； CNP4、與所述CNP1或所述CNP2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述核 蛋白NP的cDNA分子； 編碼所述流感病毒雞胚適應株中NA的cDNA分子是CNA1、CNA2、CNA3或CNA4的cDNA 分子： CNA1、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 11的第1-1365位核苷酸的cDNA分子； CNA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 11的cDNA分子； CM3、在嚴格條件下與所述CNA1或所述CNA2限定的cDNA分子雜交且編碼神經氨酸酶 NA的cDNA分子； CNA4、與所述CNA1或所述CNA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述神 經氨酸酶NA的cDNA分子； 編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的cDNA分子是CM1、CM2或CM3的cDNA分 子： CM1、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 10的cDNA分子； CM2、在嚴格條件下與所述CM1限定的cDNA分子雜交且編碼基質蛋白Ml和M2的cDNA 分子； CM3、與所述CM1限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述基質蛋白Ml和 M2的cDNA分子； 編碼所述流感病毒雞胚適應株中NS1和NS2的cDNA分子是CNSUCNS2或CNS3的cDNA 分子： CNS1、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 13的cDNA分子； CNS2、在嚴格條件下與所述CNS1限定的cDNA分子雜交且編碼非結構蛋白NS1和NS2 的cDNA分子； CNS3、與所述CNS1限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述非結構蛋白 NS1和NS2的cDNA分子； 編碼所述待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子是RPB21、RPB22、RPB23或RPB24的 cDNA分子： RPB21、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 3的第1-2280位核苷酸的cDNA分子； RPB22、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 3的cDNA分子； RPB23、在嚴格條件下與所述RPB21或所述RPB22限定的cDNA分子雜交且編碼RNA聚 合酶PB2亞基的cDNA分子； RPB24、與所述RPB21或所述RPB22限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所 述RNA聚合酶PB2亞基的cDNA分子； 編碼所述待拯救流感病毒毒株中PB1的cDNA分子是RPB11、RPB12、RPB13或RPB14的 cDNA分子： RPB11、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 4的第1-2274位核苷酸的cDNA分子； RPB12、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 4的cDNA分子； RPB13、在嚴格條件下與所述RPB11或所述RPB12限定的cDNA分子雜交且編碼RNA聚 合酶PB1亞基的cDNA分子； RPB14、與所述RPB11或所述RPB12限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所 述RNA聚合酶PB1亞基的cDNA分子； 編碼所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子是RPA1、RPA2、RPA3或RPA4的cDNA 分子： RPA1、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 5的第1-2151位核苷酸的cDNA分子； RPA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 5的cDNA分子； RPA3、在嚴格條件下與所述RPA1或所述RPA2限定的cDNA分子雜交且編碼RNA聚合酶 PA亞基的cDNA分子； RPA4、與所述RPA1或所述RPA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述 RNA聚合酶PA亞基的cDNA分子； 編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子是RHA1、RHA2、RHA3或RHA4的cDNA 分子： RHA1、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 1的第1-1683位核苷酸的cDNA分子； RHA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 1的cDNA分子； RHA3、在嚴格條件下與所述RHA1或所述RHA2限定的cDNA分子雜交且編碼血凝素HA 的cDNA分子； RHA4、與所述RHA1或所述RHA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述血 凝素HA的cDNA分子； 編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子是RNP1、RNP2、RNP3或RNP4的cDNA 分子： RNP1、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 6的第1-1497位核苷酸的cDNA分子； RNP2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 6的cDNA分子； RNP3、在嚴格條件下與所述RNP1或所述RNP2限定的cDNA分子雜交且編碼核蛋白NP 的cDNA分子； RNP4、與所述RNP1或所述RNP2限定的cDNA分子具有90 %以上的同一性且編碼所述核 蛋白NP的cDNA分子； 編碼所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子是RNA1、RNA2、RNA3或RNA4的cDNA 分子： RNA1、其編碼序列是序列表中SEQ ID No. 2的第1-1401位核苷酸的cDNA分子； RNA2、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 2的cDNA分子； RNA3、在嚴格條件下與所述RNA1或所述RNA2限定的cDNA分子雜交且編碼神經氨酸酶 NA的cDNA分子； RNA4、與所述RNA1或所述RNA2限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述神 經氨酸酶NA的cDNA分子； 編碼所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的cDNA分子是RM1、RM2或RM3的cDNA分 子： 冊1、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 7的cDNA分子； RM2、在嚴格條件下與所述RM1限定的cDNA分子雜交且編碼基質蛋白Ml和M2的cDNA 分子； 冊3、與所述RM1限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述基質蛋白Ml和 M2的cDNA分子； 編碼所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的cDNA分子是RNSURNS2或RNS3的cDNA 分子： RNS1、其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 8的cDNA分子； RNS2、在嚴格條件下與所述RNS1限定的cDNA分子雜交且編碼非結構蛋白NS1和NS2 的cDNA分子； RNS3、與所述RNS1限定的cDNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述非結構蛋白 NS1和NS2的cDNA分子。
5. 由權利要求1至4中任一所述的方法制備的重組流感病毒。
6. 根據權利要求5所述的重組流感病毒，其特征在于：所述重組流感病毒為R1-R11中 任一種重組流感病毒： 所述R1是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述待拯 救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PB1的RNA片段2、 編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、編碼所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述待 拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R2是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述流感 病毒雞胚適應株中PB2的RNA片段1、編碼所述待拯救流感病毒毒株中PB1的RNA片段2、 編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述流感病毒雞胚適應株中NP的RNA片段5、編碼所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述待 拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R3是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述待拯 救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、編碼所述待拯救流感病毒毒株中PB1的RNA片段2、 編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、編碼所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述待 拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R4是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述待拯 救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、編碼所述待拯救流感病毒毒株中PB1的RNA片段2、 編碼所述待拯救流感病毒毒株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、編碼所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述流 感病毒雞胚適應株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R5是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述流感 病毒雞胚適應株中PB2的RNA片段1、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PB1的RNA片段2、 編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述流感病毒雞胚適應株中NP的RNA片段5、編碼所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、編碼所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述待 拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R6是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述待拯 救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PB1的RNA片段2、 編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、編碼所述流感病毒雞胚適應 株中NA的RNA片段6、編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述待 拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R7是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述待拯 救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、編碼所述待拯救流感病毒毒株中PB1的RNA片段2、 編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、編碼所述流感病毒雞胚適應 株中NA的RNA片段6、編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述流 感病毒雞胚適應株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R8是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述待拯 救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PB1的RNA片段2、 編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、編碼所述流感病毒雞胚適應 株中NA的RNA片段6、編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述流 感病毒雞胚適應株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R9是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述流感 病毒雞胚適應株中PB2的RNA片段1、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PB1的RNA片段2、 編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、編碼所述流感病毒雞胚適應 株中NA的RNA片段6、編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述待 拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R10是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述流 感病毒雞胚適應株中PB2的RNA片段1、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PB1的RNA片段 2、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述流感病毒雞胚適應株中NP的RNA片段5、編碼所述流感病毒雞胚適應 株中NA的RNA片段6、編碼所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述待 拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R11是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述待 拯救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PB1的RNA片段 2、編碼所述待拯救流感病毒毒株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、編碼所述流感病毒雞胚適應 株中NA的RNA片段6、編碼所述待拯救流感病毒毒株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述流 感病毒雞胚適應株中NS1和NS2的RNA片段8。
7. 獲得流感病毒疫苗株的方法，包括從由權利要求1至5中任一所述的方法制備的所 述重組流感病毒中篩選得到流感病毒疫苗株的步驟。
8. 由權利要求7所述方法制備的流感病毒疫苗株。
9. 根據權利要求8所述的流感病毒疫苗株，其特征在于：所述流感病毒疫苗株為下述 R1或R2中任一種重組流感病毒： 所述R1是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述待拯 救流感病毒毒株中PB2的RNA片段1、編碼所述流感病毒雞胚適應株中PB1的RNA片段2、 編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述待拯救流感病毒毒株中NP的RNA片段5、編碼所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述待 拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8 ; 所述R2是基因組RNA由如下8個獨立的RNA片段組成的重組流感病毒：編碼所述流感 病毒雞胚適應株中PB2的RNA片段1、編碼所述待拯救流感病毒毒株中PB1的RNA片段2、 編碼所述流感病毒雞胚適應株中PA的RNA片段3、編碼所述待拯救流感病毒毒株中HA的 RNA片段4、編碼所述流感病毒雞胚適應株中NP的RNA片段5、編碼所述待拯救流感病毒毒 株中NA的RNA片段6、編碼所述流感病毒雞胚適應株中Ml和M2的RNA片段7、編碼所述待 拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA片段8。
10. 繁殖權利要求5或6所述重組流感病毒的方法，其特征在于：所述方法在雞胚中繁 殖權利要求5或6所述的重組流感病毒。
【文檔編號】C12N15/85GK104372023SQ201410643862
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月10日 優(yōu)先權日:2014年11月10日
【發(fā)明者】孫怡朋, 劉金華, 沈曄, 蒲娟 申請人:中國農業(yè)大學