與薺菜抗藥性相關的分子標記及其檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供了與薺菜抗藥性相關的分子標記和用于檢測抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑薺菜的特異性PCR引物對，包括用于特異性擴增薺菜JC-ALS基因的引物對。采用該引物的PCR檢測方法具有極好的特異性和靈敏性，能夠實現對田間疑似抗ALS抑制劑薺菜的快速鑒定和突變位點的確認，從而指導生產實踐中抗性雜草的科學治理。
【專利說明】與薺菜抗藥性相關的分子標記及其檢測試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明涉及抗除草劑雜草檢測技術，具體地說，涉及與薺菜抗藥性相關的分子標 記及其檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase,簡稱ALS)，也稱乙酰輕酸合酶 (acetohydroxyacid synthase,簡稱AHAS)，是誘導植物和微生物體內繳氨酸、亮氨酸、異亮 氨酸的生物合成過程中關鍵性酶，也是一種重要的除草劑靶標。ALS抑制劑類除草劑的開發 及使用始于上世紀80年代初，由于此類除草劑有超高活性、對人及動物低毒、環境友好等 明顯的優勢，受到廣泛關注，目前已有50多個品種被開發和使用。上世紀80年代開始，我 國陸續在冬小麥田推廣使用苯磺隆、甲磺隆、氯磺隆、雙氟磺草胺、啶磺草胺等，2009年僅苯 磺隆在我國的產量就達230多噸（有效成分），相當于麥田化除面積2億多畝。苯磺隆作為 小麥田最經濟、有效的優秀除草劑，對控制薺菜等闊葉雜草起到了非常重要的作用。但由于 該類除草劑分子靶標單一，長期使用易引起雜草抗藥性，近些年來，以常規劑量噴施苯磺隆 無法有效防除薺菜的問題在我國河北、陜西、山東、河南、山西、江蘇等地的一些麥田非常突 出，并且發現，有些麥田抗苯磺隆的薺菜對雙氟磺草胺等ALS抑制劑也產生了交互抗性。麥 田雜草對上述幾種ALS抑制劑產生交互抗性，使這些農田不能繼續使用該類除草劑，而在 生產中由于農民對雜草抗藥性的認識上的不足，盲目增大用藥劑量，不僅增加了成本，使藥 害風險加大，嚴重影響農民收入和國家糧食安全。因此，目前迫切需要一個簡便，快速的抗 藥性雜草檢測鑒定方法。
[0003] 我國抗藥性雜草的研究起步較晚，傳統的抗藥性雜草檢測通常采用室內生物測定 法，既對田間采集的疑似抗性的雜草的種子在室內進行培養，在一定葉齡噴施除草劑后，調 查株防效和地上部分生物量來計算抗性指數。這種方法能夠客觀地評價某種雜草對相應除 草劑的抗性情況，但也有其局限性，主要表現在以下兩方面：一是不能當季、當時進行檢測， 二是占地多、時間長、工作量大。
[0004] 隨著分子生物學技術在雜草抗藥性機理研究方面的應用，越來越多的雜草的 抗藥性機理得到明確。目前已有的研究報道顯示，對ALS抑制劑產生抗性的植物在其 革巴標酶 ALS 保守區共發現了 8 個 SNP 位點（http: //www. weedscience. org/Mutations/ MutationDisplayAll. aspx)，這些位點的任意一個位點氨基酸突變為其他氨基酸都使植物 對相應除草劑產生抗性。這8個氨基酸位點目前公認以擬南芥ALS為標準標注位點，包括 122、197、205、376、377、574、653、654位氨基酸（圖3)。其中，薺菜對苯磺隆等ALS抑制劑 類除草劑產生抗性的原因也已證實與編碼ALS保守區某一位點發生點突變相關。研究報道 中只克隆了薺菜的一個ALS基因，但我們在研究中發現，薺菜具有兩個ALS基因，分別命名 為JC-ALS-I和JC-ALS-2,這兩個基因都具有功能，任意一個基因在保守區發生突變，都能 夠引起抗藥性產生。因此，可以通過分子生物學手段檢測其靶標酶ALS的保守區突變位點 來檢測薺菜是否發生抗藥性。
【發明內容】
[0005] 為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種抗乙酰乳酸合酶抑制 劑類除草劑薺菜的檢測方法。
[0006] 為了實現本發明的目的，本發明首先提供與薺菜抗藥性相關的分子標記，所述分 子標記為：
[0007] (1)核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的JC-ALS-I基因；所編碼的蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID No. 3所示；其中，編碼第373位氨基酸的密碼子發生GAT-GAA堿基突變，或編 碼第571位氨基酸的密碼子發生TGG-TTG堿基突變，導致薺菜抗藥性出現多態性；
[0008] 或（2)核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的JC-ALS-2基因；所編碼的蛋白的氨基酸 序列如SEQ ID No. 4所示；其中，編碼第372位氨基酸的密碼子發生GAT-GAA堿基突變，或 編碼第570位氨基酸的密碼子發生TGG-TTG堿基突變，導致薺菜抗藥性出現多態性；
[0009] 所述抗藥性具體表現為抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑。
[0010] 需要指出的是，JC-ALS-I基因發生堿基突變，導致翻譯的氨基酸發生變化的第 373位和第571位氨基酸位點，若以擬南芥ALS氨基酸順序，則分別為376位和574位。同 樣，JC-ALS-2基因發生堿基突變，導致翻譯的氨基酸發生變化的第372位和第570位氨基 酸位點，若以擬南芥ALS氨基酸順序，則分別為376位和574位。
[0011] 因此，本發明所述分子標記翻譯的氨基酸序列，相對于擬南芥ALS氨基酸順序來 說，由于在編碼第376位氨基酸的密碼子發生GAT-GAA堿基突變，使得該位置氨基酸由Asp 變為Glu ;或由于在編碼第574位氨基酸的密碼子發生TGG-TTG堿基突變，使得該位置氨基 酸由Trp變為Leu。
[0012] 為了敘述簡潔，本發明在后文中將利用擬南芥ALS氨基酸順序，對所述分子標記 導致的氨基酸突變位點進行描述。
[0013] 本發明還提供了用于檢測抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑薺菜的特異性PCR引 物對，包括用于特異性擴增薺菜JC-ALS-I基因和JC-ALS-2基因的引物對，引物對的核苷酸 序列如下：
[0014] 正向引物 JC-ALS-F : 5' -TATTCGCTTACCCAGGTG-3，；
[0015] 反向引物 JC-ALS-R : 5' -GGTTCTGAGTTTCATCTCTCA-3'。
[0016] 本發明還進一步提供了用于檢測抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑薺菜的試劑盒， 所述試劑盒含有前述引物對。
[0017] 作為優選，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的 至少一種。
[0018] 更為優選，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
[0019] 本發明還提供一種抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑薺菜的PCR檢測方法，利用前 述引物對或試劑盒檢測抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑的薺菜。
[0020] 進一步地，所述PCR檢測方法具體包括以下步驟：
[0021] 1)提取樣品中的DNA ;
[0022] 2)以步驟1)中提取的DNA為模板，利用前述引物對或試劑盒進行PCR擴增反應；
[0023] 3)分析PCR產物。
[0024] PCR反應體系以20 μ 1計為：
[0025]
【權利要求】
1. 與莽菜抗藥性相關的分子標記，其特征在于，所述分子標記為： (1)核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的JC-ALS-I基因；所編碼的蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No. 3所示；其中，編碼第373位氨基酸的密碼子發生GAT-GAA堿基突變，或編碼第 571位氨基酸的密碼子發生TGG-TTG堿基突變； 或（2)核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的JC-ALS-2基因；所編碼的蛋白的氨基酸序列 如SEQ ID No. 4所示；其中，編碼第372位氨基酸的密碼子發生GAT-GAA堿基突變，或編碼 第570位氨基酸的密碼子發生TGG-TTG堿基突變； 所述抗藥性具體表現為抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑。
2. 用于檢測抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑薺菜的特異性PCR引物對，其特征在于， 包括用于特異性擴增權利要求1所述分子標記的引物對，引物對的核苷酸序列如下： 正向引物 JC-ALS-F :5' -TATTCGCTTACCCAGGTG-3，； 反向引物 JC-ALS-R :5' -GGTTCTGAGTTTCATCTCTCA-3'。
3. 用于檢測抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑薺菜的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒 含有權利要求2所述引物對。
4. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚 合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的至少一種。
5. 根據權利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
6. 抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑薺菜的PCR檢測方法，其特征在于，利用權利要求 2所述引物對或權利要求3-5任一項所述試劑盒檢測抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑的薺 菜。
7. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提取樣品中的DNA ; 2) 以步驟1)中提取的DNA為模板，利用權利要求2所述引物對或權利要求3-5任一項 所述試劑盒進行PCR擴增反應； 3) 分析PCR產物。
8. 根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反應體系以20 μ 1計為：
9. 根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反應條件為：94°C預變性3分鐘； 94°C變性1分鐘，55. 3°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，共30個循環；72°C延伸10分鐘。
【文檔編號】C12N15/11GK104388559SQ201410643602
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月10日 優先權日:2014年11月10日
【發明者】崔海蘭, 李香菊, 張宏軍 申請人:中國農業科學院植物保護研究所