基于磷酸甜菜堿濃度為控制參數的利福霉素sv的發酵生產方法
【專利摘要】一種基于磷酸甜菜堿濃度為控制參數的利福霉素SV的發酵生產方法，是由地中海擬無枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)作為出發菌株，經過純種培養、三級發酵生成利福霉素SV的，具體工藝步驟包括斜面的制備工序、母瓶種子制備工序、一級種子制備工序、二級種子制備工序、發酵制備工序，其特點是在母瓶種子制備工序，在母瓶培養基上添加1～2g/L的磷酸甜菜堿；在發酵制備工序，通過連續流加補料的方式即采用連續流加發酵控制磷酸甜菜堿濃度為0.4～0.5g/L，直到放罐終點。本發明的生產方法能夠大幅度提升利福霉素SV的合成速率，提高了生產水平，同時降低了底物葡萄糖的消耗。
【專利說明】基于磷酸甜菜堿濃度為控制參數的利福霉素SV的發酵生 產方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種利福霉素SV的發酵生產方法，具體是一種基于磷酸甜菜堿濃度 為控制參數的利福霉素SV的發酵生產方法。
【背景技術】
[0002] 利福霉素類抗生素是由地中海鏈絲菌產生的一類抗生素，它具有廣譜抗菌作用， 對結核桿菌、麻風桿菌、鏈球菌、肺炎球菌等革蘭氏陽性細菌，特別是耐藥性金黃色葡萄球 菌的作用都很強。對某些革蘭氏陰性菌也有效。利福霉素類藥物有：利福霉素B二乙酰胺、 利福平等。目前在臨床應用的有利福平、利福噴汀及利福布汀。利福霉素SV的生物合成是 從七碳氨單位開始的，由兩個乙酸單位和八個丙酸單位，利用I型聚酮酶（PKS)經過一系列 縮聚反應首先合成利福霉素SV的聚酮鏈骨架，在經過一些后修飾反應合成完整的利福霉 素SV。在聚酮鏈的修飾過程中，其中部分酶的編碼基因已經被推定，但部分相關的編碼基因 可能并不存在于合成基因簇中，暫時無法確定。如最終的鏈的釋放所需硫酯酶的編碼基因， 目前還無法確定。在該菌的基因工程研究中，相關資料已報道了利福霉素SV的部分合成基 因簇和調控基因。不過這些基因的具體作用及相互關系還需要進一步的研究。為了提高利 福霉素SV產量，強化參與生物合成途徑的基因表達，在重組菌中增加基因拷貝數，是常用 的一種手段。但利福霉素SV產量并沒有得到明顯增加。雖然在多個方面都進行了有益的 嘗試，但目前的研究并沒有獲得可用于實際生產的高產重組菌。在利福霉素SV次級代謝合 成的眾多步驟中都是通過轉甲基作用進行的，轉甲基作用的重要前體是S腺苷甲硫氨酸， 因此S腺苷甲硫氨酸的快速合成在促進利福霉素SV合成的過程中起著非常重要的作用。
[0003] 在現行的利福霉素SV批培養發酵工藝中，大多采pH、D0、溫度等作為控制策略的 依據和手段，也有很多研究從福霉素發酵過程的溶氧控制來進行發酵過程優化，并將活細 胞傳感儀用于發酵過程活菌體濃度的檢測與控制，并通過控制攪拌轉速和空氣流量可以有 效的控制供氧水平。
[0004] 甜菜堿又名N，N，N-三甲基甘氨酸（分子式為C5H12NO2)，廣泛存在于動植物中，在 微生物培養過程中，甜菜堿作為一種良好的滲透壓調節劑被廣泛使用，同時，甜菜堿在甲基 化反應中具有重要的作用，它為甲硫氨酸的形成提供甲基。作為甲基供體，甜菜堿的分解情 況見圖1。
[0005] 在甲基化反應中，甜菜堿高半胱氨酸甲基轉移酶（BHMT)催化甜菜堿向高半胱氨 酸轉移一個甲基，分別形成二甲基甘氨酸（Ν,Ν-dimethylglycine)和甲硫氨酸。甲硫氨酸 進一步形成胞內甲基化底物S腺苷甲硫氨酸。之前已報到的研究工作很少有關注甲基化前 體供應情況對利福霉素SV合成的影響，也缺乏甜菜堿對菌體的動態生理代謝的影響，根本 沒有相關的最優化控制工藝的提出。
[0006] 通過檢索，發明人查到了以下相關專利文獻：CN102197827A公開了一種甜菜堿 復合制劑及用于提高作物抗逆性及產量中的應用，采用甜菜堿濃度為8-20g/L，以配制 IOOOml溶液為計量單位，依次稱取七水合硫酸鋅0. 1-lg/L，氯化膽堿2-10g/L，L-萘乙酸 0. 05-0. 5g/L，硼酸0. 05-0. 2g/L溶于水中，攪拌溶解后加入5-10ml吐溫80,攪拌混勻制備 獲得甜菜堿復合制劑成品。CN102176892A公開了一種甜菜堿的應用，涉及甜菜堿保護皮膚 使其免受生物刺激的應用，還涉及甜菜堿作為化妝和/或盥洗制劑中的保護劑的應用。
[0007] 以上這些專利文獻對于本發明如何能夠大幅度提升利福霉素SV的合成速率，提 高生產水平，并未給出具體的技術指導方案。
【發明內容】
[0008] 本發明所要解決的技術問題在于，提供一種基于磷酸甜菜堿濃度為控制參數的利 福霉素SV的發酵生產方法，該生產方法能夠大幅度提升利福霉素SV的合成速率，提高生產 水平，同時降低底物葡萄糖的消耗。
[0009] 為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：
[0010] 一種基于磷酸甜菜堿濃度為控制參數的利福霉素SV的發酵生產方法，是由地中 海擬無枝酸菌（Amycolatopsismediterranei)作為出發菌株，經過純種培養、三級發酵生 成利福霉素SV的，具體工藝步驟包括斜面的制備工序、母瓶種子制備工序、一級種子制備 工序、二級種子制備工序、發酵制備工序，其技術方案在于：在母瓶種子制備工序，在母瓶培 養基上添加1?2g/L的磷酸甜菜堿（即每升母瓶培養基上添加1?2克的磷酸甜菜堿）； 在發酵制備工序，通過連續流加補料的方式即采用連續流加發酵控制磷酸甜菜堿濃度為 0. 4?0. 5g/L(即發酵罐中每升培養基水溶液中含有磷酸甜菜堿0. 4?0. 5克），直到放罐 終點。
[0011] 上述技術方案中，在母瓶種子制備工序，母瓶培養基上可以添加lg/L的磷酸甜菜 堿。在發酵制備工序，通過連續流加補料的方式控制磷酸甜菜堿濃度可以為0. 5g/L，直到放 罐終點。上述利福霉素SV的產物合成量彡7700U/mL-7900U/mL。
[0012] 本發明從利福霉素次級代謝合成途徑前體物質需求的角度研究了甲基化供體物 質甜菜堿對發酵過程的影響，結果表明合適的磷酸甜菜堿的添加能提升利福霉素SV的發 酵合成速率。
[0013] 本發明從甲基化前體供應的角度研究了甜菜堿對利福霉素SV合成的影響，并提 出了最優化控制工藝，彌補了以往研究的不足，進一步提升了利福霉素發酵水平，進一步促 進了生產的穩定性以及產率的提升和純度的增加，同時降低了生產成本。
[0014] 以下為本發明的生產過程：
[0015] 1、材料和方法
[0016] 1. 1、菌種和培養基
[0017] 菌種：地中海擬無枝酸菌（Amycolatopsismediterranei)由河北欣港藥業有限 公司提供。
[0018] 種子培養基（g/L):葡萄糖40g，蛋白胨20g，魚粉4. 6g，硝酸鉀5. 8g，碳酸I丐2. 6g， 泡敵lmL，其中葡萄糖單獨滅菌后加入培養基中。
[0019] 原發酵培養基（g/L):葡萄糖55g，蛋白胨IOg,豆餅粉34g，魚粉6. 6g，硝酸鉀 10. 6g，碳酸I丐5. 3g，泡敵ImL,其中葡萄糖單獨滅菌后加入培養基中。
[0020] 1. 2儀器和試劑
[0021] 儀器：發酵罐：上海國強生化裝備有限責任公司15L和50L自動發酵罐； ExtralMAX30 -LG過程質譜儀；國家生化工程中心Biostar軟件包；722型紫外一可見分光 光度計；旋轉式搖床。
[0022] 磷酸甜菜堿、鹽酸甜菜堿、一水甜菜堿：山東祥維斯化學品有限公司生產。
[0023] 1. 3培養方法
[0024] 利福霉素發酵采用三級發酵，其中包括二級種子發酵。
[0025] 母瓶種子培養：在IL三角瓶中裝種子培養基IOOmL,斜面接種后搖床培養，培養溫 度28°C，轉速180-220rpm培養約30小時。
[0026] 種子罐：15L種子罐中裝量8L，將母瓶種子按10% -15%接種量接種，培養溫度 29°C，用轉速和空氣控制溶氧水平不低于35%，自然pH控制，培養周期約50小時。
[0027] 發酵罐：50L發酵罐裝量30L，用經過蒸汽滅菌的一種管道從15L種子罐中移種 5L，溫度控制在29°C，用轉速和空氣控制溶氧水平不低于35%，自然pH控制，過程中補加葡 萄糖和水，培養周期約130-140小時。
[0028] 1.4測定方法：
[0029] 還原糖測定：DNS方法。
[0030] 生物量測定：離線測定采用濕體積法，將IOmL發酵液置于離心管，3000rpm離心 15min，將離心上清倒入量筒，根據上清的體積計算出發酵液的體積。在線采用美國Aber公 司的活細胞傳感器，其原理是根據細胞在電場下被極化，形成多個電容，電容值的大小與活 菌量成正比。所以，可以采用電容值大小來估計活菌的量。
[0031] 效價測定：采用國家藥典方法。
[0032]pH、DO在線測定：采用MettlerToledo耐高溫電極進行在線測定。
[0033] 溫度：鉬溫度電極在線測定。
[0034] 進氣和尾氣中氧和二氧化碳的測定：采用美國Extrel過程質譜MAX300-LG對發 酵過程中的進氣和尾氣進行實時在線采集分析。
[0035] 氧消耗速率OUR和二氧化碳生成速率CER測定：0UR和CER的計算通過對發酵尾 氣的分析數據計算得到。以進氣和尾氣中惰性氣體N2維持恒定建立平衡方程，求得OUR和 CER。
[0036] 甜菜堿的測定方法：高壓液相色譜條件：色譜柱：菲羅門（lima SCX, 250mmX4. 6mmX5um)，流動相：甲醇：乙酸銨水溶液（0· 01mol/L) = 100 :900,流速： 1.0ml/min，檢測波長：220nm，柱溫：45°C，進樣量：20μ1。
[0037] 2、結果與討論
[0038] 2. 1不同類型的甜菜堿對利福霉素SV發酵的影響
[0039] 在搖瓶發酵初始培養基中添加不同類型的甜菜堿，添加濃度為2g/L，并同時考察 了膽堿對發酵的影響。將生長好的搖瓶種子按5%的接種量接種后進行發酵培養，130小時 后放瓶進行發酵單位的測定，不添加甜菜堿的原始配方作為對照，每組5個平行進行發酵 結果統計。實驗結果見表1。
[0040] 實驗結果表明甜菜堿對利福霉素的合成有較好的促進作用，磷酸甜菜堿的添加效 果好于一水甜菜堿和鹽酸甜菜堿，遠高于對照組，分別比對照組提升了 12. 8%、8. 98%和 7. 51%。而且添加磷酸甜菜堿的情況下殘糖的殘余量較高，說明底物葡萄糖的消耗量減少， 產物對底物的的得率系數高于對照組及其它兩種甜菜堿類型。而膽堿對利福霉素SV的合 成和轉化率并沒有明顯的效果。
[0041]表 1
[0042]
【權利要求】
1. 一種基于磷酸甜菜堿濃度為控制參數的利福霉素SV的發酵生產方法，是由地中海 擬無枝酸菌（Amycolatopsis mediterranei)作為出發菌株，經過純種培養、三級發酵生成 利福霉素SV的，具體工藝步驟包括斜面的制備工序、母瓶種子制備工序、一級種子制備工 序、二級種子制備工序、發酵制備工序，其特征在于： 在母瓶種子制備工序，在母瓶培養基上添加1?2g/L的磷酸甜菜堿；在發酵制備工序， 通過連續流加補料的方式即采用連續流加發酵控制磷酸甜菜堿濃度為0. 4?0. 5g/L，直到 放罐終點。
2. 根據權利要求1所述的利福霉素SV的發酵生產方法，其特征在于，在母瓶種子制備 工序，母瓶培養基上添加lg/L的磷酸甜菜堿。
3. 根據權利要求1所述的利福霉素SV的發酵生產方法，其特征在于，在發酵制備工序， 通過連續流加補料的方式控制磷酸甜菜堿濃度為0. 5g/L，直到放罐終點。
4. 根據權利要求1所述的利福霉素SV的發酵生產方法，其特征在于，上述利福霉素SV 的產物合成量彡7700U/mL-7900U/mL。
【文檔編號】C12R1/01GK104357586SQ201410632469
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月11日 優先權日:2014年11月11日
【發明者】史守坤, 劉愛軍, 岳曉明, 賈軍巧, 張鑫, 莊英萍, 張嗣良, 張婭 申請人:河北欣港藥業有限公司