轉(zhuǎn)基因苜蓿草j101品系特異性定性pcr檢測用引物及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了轉(zhuǎn)基因苜蓿草J101品系特異性定性PCR檢測用引物及檢測方法。本發(fā)明針對針對我國農(nóng)業(yè)部未頒發(fā)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書的轉(zhuǎn)基因苜蓿草品系J101，根據(jù)其基因組DNA序列5’端外源插入片段P-eFMV與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區(qū)，首次設(shè)計和提供一對特異性引物，并成功建立定性PCR檢測體系。結(jié)果表明，本發(fā)明定性PCR檢測方法特異性良好，檢測的最低DNA濃度為80pg，相當(dāng)于50拷貝的基因組DNA；適合于J101品系快速、穩(wěn)定的定性檢測。
【專利說明】轉(zhuǎn)基因苜蓿草J101品系特異性定性PCR檢測用引物及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，涉及一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性的定性PCR檢測用引物及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前我國存欄數(shù)為1500萬頭奶牛，對優(yōu)質(zhì)飼草需求最非常大。轉(zhuǎn)基因苜蓿通過飼料進入動物養(yǎng)殖的食物鏈，致使牛奶、肉等制品成為轉(zhuǎn)基因食品，可能對于人的健康產(chǎn)生影響。根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》，凡是在中國境內(nèi)銷售的轉(zhuǎn)基因生物，必須進行標(biāo)識。為保障消費者的知情權(quán)，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度在30多個國家和地區(qū)應(yīng)用。中國目前實施無閥值的強制性標(biāo)識制度。
[0003]對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識需要檢測方法的支撐。目前對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測主要包括對蛋白質(zhì)和核酸檢測兩大類，后者均以PCR為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)，PCR技術(shù)具高的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性，檢測周期短，成本較低。能過普通凝膠電泳觀察條帶的有無判定擴增產(chǎn)物的有無，通過電泳條帶的濃度可以分析檢測方法的靈敏度。一方面中國目前實施無閥值的強制性標(biāo)識制度，可采用普通定性PCR滿足對轉(zhuǎn)基因檢測的需求，另一方對普通定性PCR對操作者技術(shù)水平要求較低，僅需價格低廉的簡單PCR儀即可進行，適用于基層實驗推廣應(yīng)用。
[0004]根據(jù)擴增目標(biāo)片段位置的不同，基于核酸基礎(chǔ)上的PCR檢測又可以分為4種檢測策略:1)篩查法:對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的啟動子、終止子等通用基因進行篩查；2)基因特異性檢測:對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的外源目的基因進行檢測；3)構(gòu)建特異性檢測:對外源目的基因與啟動子或終止子的特異連接序列進行檢測；4)品系特異性/轉(zhuǎn)化事件特異性檢測:對外源片段與宿主基因組DNA特異連接序列進行檢測。
[0005]品系特異性檢測方法是基于外源插入片段和宿主基因接合區(qū)的邊界序列建立特異性的檢測方法。品系性特異性PCR檢測方法可以對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品品系進行判定，被認為是最適合轉(zhuǎn)基因標(biāo)識的檢測判定方法。zimmmermanm等首次使用inverse PCR策略獲得Btll的接合區(qū)序列并建立品系特異性檢測方法。
[0006]轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系由孟山都公司開發(fā)的耐除草劑的轉(zhuǎn)基因品系，2005年美國和加拿大批準(zhǔn)環(huán)境釋放和作為飼料應(yīng)用，目前我國尚批準(zhǔn)其進口。還未獲得我國轉(zhuǎn)基因生物安全證書，目前未見到有該作物品系特異性定性PCR檢測方法相關(guān)文獻。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因苜蓿草尚無品系特異性檢測方法、不能準(zhǔn)確的對轉(zhuǎn)基因苜蓿草的品系進行識別，無法對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行標(biāo)識的技術(shù)不足，提供一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測用引物，其具有較高特異性和靈敏度及良好的穩(wěn)定性，基于所述引物，可成功建立轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測方法，實現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系進行定性檢測。
[0008]本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是提供轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系進行定性檢測的方法。
[0009]本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn):
本發(fā)明通過創(chuàng)造性地分析和大量實驗研究總結(jié)，在轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系的5’端外源插入片段P-eFMV與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區(qū)序列，結(jié)合序列生物學(xué)信息的分析，設(shè)計得到一對特異性的引物，以及探針。并確定了精確地檢測條件，建立特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性良好的轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系定性PCR檢測方法。
[0010]具體地，提供一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測用引物J101-1和J101-2，其序列如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示:
SEQ ID N0.1 J101-1:5’ - CGTATTCATGTCATGTGTTTTGTACTG-3’，
SEQ ID N0.2 J101-2: 5’ - GACTCTGTACCCTGACCTTGTTGA-3’。
[0011]同時提供一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測方法，包括以步驟:
51.提取DNA作為反應(yīng)的模板；
52.采用引物J101-1和JlO1-2進行定性PCR檢測；
其中，S2所述定性PCR檢測的反應(yīng)體系為25yL:Takara Ex Taql2.5 μ L，引物J101-1和 J101-2 各為 0.5 μ L，DNA 模板 I μ L, ddH20 10.5 μ L。
[0012]S2所述定性PCR檢測的反應(yīng)程序為:98°C 10s，60°C 30s，72°C 30s，30個循環(huán)；擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
[0013]本發(fā)明采用以下方法驗證本發(fā)明方法的特異性、靈敏度等:
采用引物J101-1和J101-2對7種常見作物進行定性PCR檢測，測試檢測體系特異性。
[0014]采用引物J101-1和J101-2對不同濃度的JlOl基因組DNA進行定性PCR檢測，測試檢測體系靈敏度。
[0015]上述定性PCR檢測的反應(yīng)體系為25yL:Takara Ex Taql2.5 μ L，引物J101-1和J101-2 引物分別為 0.5 μ L，DNA 模板 I μ L, ddH20 10.5 μ L。
[0016]上述定性PCR檢測的反應(yīng)程序為:98°C 10s, 60°C 30s，72°C 30s, 30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
[0017]本發(fā)明可以很好地應(yīng)用于鑒別轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系與其他作物，尤其優(yōu)選應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因苜蓿草J1i品系與轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162、轉(zhuǎn)基因玉米品系89034、轉(zhuǎn)基因玉米品系NK63、轉(zhuǎn)基因玉米品系BT11、轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、非轉(zhuǎn)基因大葉苜蓿等作物的鑒別檢測。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
目前對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測主要包括對蛋白質(zhì)和核酸檢測兩大類，而后者主要采用PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測體系，因為操作簡便、穩(wěn)定性好以及易于推廣等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用。根據(jù)擴增目標(biāo)片段位置的不同，基于核酸基礎(chǔ)上的PCR檢測又可以分為4種檢測策略，即篩選檢測、基因特異性檢測、構(gòu)建特異性檢測和品系(轉(zhuǎn)化事件)特異性檢測(徐茂軍，2001)，其中品系特異性檢測由于可以鑒定出具體的轉(zhuǎn)基因作物品系，因此是特異性最高的檢測方法。但由于進境農(nóng)作物特別是含多種品系的作用，有的只有一部分品系允許進口，另一些可能尚未曾頒發(fā)證書，采用篩選檢測、基因特異檢測、構(gòu)建特異性檢測均無法區(qū)分具體的品系，無法對進境產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成份進行標(biāo)識。因此目前是采用啟動子、終止子或EPSPS結(jié)構(gòu)特異性基因或其組合的篩查檢測策略，這只能鑒定苜蓿草是否為轉(zhuǎn)基因，但是不能準(zhǔn)確的檢測其具體的轉(zhuǎn)基因苜蓿草品系，出入境檢驗監(jiān)管部門無法對同一作物具多個轉(zhuǎn)基因品系的轉(zhuǎn)基因作物進行標(biāo)識管理。公眾也無法具體知道其轉(zhuǎn)基因的具體情況。此外，采用多個基因聯(lián)合篩查的方式會使人力物力大量增加。
[0019]本發(fā)明首次設(shè)計和提供了一對特異性引物，基于所述引物，本發(fā)明成功建立了JlOl品系特異性定性PCR檢測方法。本發(fā)明基于外源插入片段FMV35S啟動子和轉(zhuǎn)基因苜蓿JlOl基因組DNA的5’端旁鄰序列建立了轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性(event-specific)定性PCR方法，可以通過成功地擴增可特異性的鑒別區(qū)分目前尚未批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系，滿足對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的閥值標(biāo)識需求，對我國進境轉(zhuǎn)基因苜蓿JlOl的監(jiān)管和標(biāo)識提供有力的技術(shù)支撐。
[0020]本發(fā)明檢測方法操作簡單、檢測結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好。通過對苜蓿草JlOl等農(nóng)作物進行的特異性試驗表明，本發(fā)明建立的定性PCR檢測方法僅對苜蓿草JlOl品系的檢測結(jié)果為陽性；大量實驗結(jié)果表明，定性PCR方法特異性良好，檢測的最低DNA濃度為80pg，相當(dāng)于50拷貝的基因組DNA，能夠快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的用于JlOl品系定性和定量檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1是轉(zhuǎn)基因苜蓿JlOl品系外源插入片段示意圖。A為擴增區(qū)域。
[0022]圖2是JlOl品系特異性定性PCR特異性試驗結(jié)果，其中7為J101，1-6為6種非JlOl作物。
[0023]圖3是JlOl品系特異性定性PCR靈敏度試驗結(jié)果，其中，1-6分別為100ng、16ng、1.6ng、0.16ng、0.08ng 和 0.016ng 的 JlOl 基因組 DNA 模板。
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖和具體實施例進一步說明本發(fā)明方法。下述實施例和附圖僅用于示例性說明，不能理解為對本發(fā)明的限制。除非特別說明，下述實施例中使用的生物材料、試劑原料為常規(guī)市購或商業(yè)途徑獲得的生物材料和試劑原料，除非特別說明，下述實施例中使用的方法和設(shè)備為本領(lǐng)域常規(guī)使用的方法和設(shè)備。
[0025]實施例1:建立JlOl品系特異性定性PCR檢測體系設(shè)計引物:
本發(fā)明通過創(chuàng)造性地分析和大量實驗研究總結(jié)，在轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系的5’端外源插入片段P-eFMV與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區(qū)序列，結(jié)合序列生物學(xué)信息的分析，設(shè)計得到一對特異性的引物，以及探針。并確定了精確地檢測條件，建立特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性良好的轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系定性PCR檢測方法。
[0026]具體地，提供一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測用引物J101-1和J101-2，其序列分別如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示:
SEQ ID N0.1 J101-1:5’ - CGTATTCATGTCATGTGTTTTGTACTG-3’。
[0027]SEQ ID N0.2 J101-2: 5’ - GACTCTGTACCCTGACCTTGTTGA-3’
所述弓I物可采用本領(lǐng)域常規(guī)方法合成。本實施例應(yīng)用的弓I物委托寶生物合成。
[0028]本發(fā)明實施例所述實時熒光PCR檢測使用的儀器為B1RAD S1000。
[0029]本實施例基于上述引物，提供一種JlOl品系特異性定性PCRR檢測方法，包括以下步驟:
51.提取DNA作為反應(yīng)的模板；
52.采用引物J101-1和JlO1-2進行定性PCR檢測；
其中，S2所述定性PCR檢測的反應(yīng)體系為25yL:Takara Ex Taql2.5 μ L，引物J101-1和 J101-2 各為 0.5 μ L，DNA 模板 I μ L, ddH20 10.5 μ L。
[0030]S2所述定性PCR檢測的反應(yīng)程序為:98°C 10s，60°C 30s，72°C 30s，30個循環(huán)；擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
[0031]其中，SI提取DNA具體方法為:稱取100 mg左右研磨成干粉的樣品，使用天根植物基因組DNA提取試劑盒并按照其操作說明書提取基因組DNA。提取的基因組DNA用微量分光光度計nanOdrOp2000c測定濃度。提取的DNA溶液在_20°C保存?zhèn)溆谩?br>
[0032]S2 所述定性 PCR 反應(yīng)體系為 25 μ L =Takara Ex Taql2.5 μ L，J101-1/2 分別0.5 μ L，DNA 模板 I μ L, ddH20 10.5 μ L ；
S2所述定性PCR反應(yīng)程序為:98°C 10s, 60°C 30s, 72°C 30s，30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)
1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
[0033]實施例2 JlOl定性PCR的特異性試驗
本發(fā)明采用多種農(nóng)作物進行特異性實驗，以下以7種農(nóng)作物作為舉例進行說明。以轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162、轉(zhuǎn)基因玉米品系89034、轉(zhuǎn)基因玉米品系NK63、轉(zhuǎn)基因玉米品系BT11、轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、非轉(zhuǎn)基因大葉苜蓿、(均來自常規(guī)隨機取樣后儲存，并不因此限定本發(fā)明范圍)和苜蓿草JlOI基因組DNA為模板，采用本發(fā)明建立的轉(zhuǎn)基因苜蓿JlOl品系特異性定性PCR方法進行擴增，檢測本發(fā)明建立的定性PCR方法的特異性。實驗結(jié)果見附圖2所示，經(jīng)PCR擴增后電泳分析觀察有無170bp條帶。實驗結(jié)果表明，只有JlOl有特征性擴增170bp長度的片段，其他作物均無條帶出現(xiàn)。表明本發(fā)明建立的JlOl品系特異性的定性PCR方法特異性良好。
[0034]定性PCR 反應(yīng)體系為 25 μ L:Takara Ex Taql2.5 μ L, J101-1/2 分別 0.5 μ L, DNA模板 I μ L, ddH20 10.5μ L ；
定性PCR反應(yīng)程序為:98°C 10s, 60°C 30s, 72°C 30s, 30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
[0035]實施例3 JlOl定性PCR的靈敏度試驗
采用本發(fā)明建立的轉(zhuǎn)基因苜蓿JlOl品系特異性定性PCR方法進行擴增，采用10ng/μ L、16ng/ μ L、0.16ng/ μ L、0.08ng/ μ L、0.016ng/ μ L 及 0.008ng/ μ L 的 JlOl 品系的基因組DNA為模板進行檢測，實驗結(jié)果如圖3所示。在模板量不少于0.08ng時，特異性201bp的片段能擴增出來。表明其靈敏度為0.08ng基因組DNA，相當(dāng)于50拷貝的基因組DNA。
[0036]定性PCR 反應(yīng)體系為 25 μ L:Takara Ex Taql2.5 μ L, J101-1/2 分別 0.5 μ L, DNA模板 I μ L, ddH20 10.5μ L ；
定性PCR反應(yīng)程序為:98°C 10s, 60°C 30s, 72°C 30s, 30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
【權(quán)利要求】
1.一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測用引物，其特征在于，其DNA序列分別如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示。
2.權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測用引物在轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測方面的應(yīng)用。
3.—種轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 51.提取DNA作為反應(yīng)的模板； 52.采用權(quán)利要求1所述的引物進行定性PCR檢測； 其中，S2所述定性PCR檢測的反應(yīng)體系為25 μ L =Takara Ex Taql2.5 μ L，權(quán)利要求1所述的引物各為0.5 μ L，DNA模板I μ L，ddH20 10.5 μ L ； S2所述定性PCR檢測的反應(yīng)程序為:98°C 10s，60°C 30s, 72°C 30s, 30個循環(huán)；擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
4.權(quán)利要求3所述轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測方法在轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系與其他作物的檢測鑒別方面。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性定性PCR檢測方法的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系與轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162、轉(zhuǎn)基因玉米品系89034、轉(zhuǎn)基因玉米品系NK63、轉(zhuǎn)基因玉米品系BT11、轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、非轉(zhuǎn)基因大葉苜蓿的檢測鑒別方面。
【文檔編號】C12N15/11GK104372088SQ201410631655
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月11日
【發(fā)明者】盧麗, 劉二龍, 呂英姿, 蔣湘, 唐婕, 樊武疆, 姚柏輝, 王定國, 林惠嬌, 鄭高彬, 林學(xué)勤, 秦焯敏 申請人:中華人民共和國黃埔出入境檢驗檢疫局