一株多粘類芽孢桿菌菌株的制作方法

一株多粘類芽孢桿菌菌株的制作方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，公開了一株多粘類芽孢桿菌（ Paenibacillus polymyxa ）菌株dgnkzx004。所述菌株已于2014年10月21日保藏于中國典型培養物保藏中心（CCTCC），保藏號是CCTCC M 2014504。所述菌株不僅對荔枝霜疫霉菌和/或炭疽病菌均具有非常好的抑制作用，還能夠抑制荔枝或者龍眼的多酚氧化酶（PPO）和/或過氧化物酶（POD）的活性。因此，該菌株在荔枝或龍眼等果蔬的保鮮方面具有非常重要的應用價值。CCTCC NO: M 201450420141021
【專利說明】一株多粘類芽孢桿菌菌株

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】。更具體地，涉及一株多粘類芽孢桿菌菌株。

【背景技術】
[0002] 新鮮果蔬從采收到被消費者食用前，由于自身呼吸作用及病原生物侵染，每年都 有大量果蔬從采收后在運輸、貯藏過程中腐爛損失。國家農產品保鮮工程技術研究中心調 查研究發現，目前我國每年年產的果蔬從田間到餐桌損失率高達25?30%，年損失近800億 人民幣。與此同時，隨著生活水平的提高，人們對水果等食品的要求越來越高，在對于水果 的色、香、味要求基礎上，人們越來越多地開始關注的是食品的安全與環保。因此進一步開 展果蔬保鮮技術開發研究，以保證果蔬產品附加值的實現和資源的充分利用刻不容緩。
[0003] 目前國際通用的水果保鮮方法大致有兩種：一種是乙烯吸收劑，通常是用透氣袋 來吸收乙烯，使水果不會進一步成熟，無藥無害，但是保鮮時間和效果不穩定；另一種是打 蠟，很多水果自身會產生果蠟，可防病蟲、微生物侵害，但儲存、運輸時果蠟容易被蹭掉部 分，效果不能保證，而且不可避免地導致消費者食用到果蠟，危害健康。另外，適量的二氧 化硫對荔枝、龍眼等水果有很好的保鮮效果，但過量使用導致殘留超標，不但果品品質受影 響，食用者也會出現頭暈、惡心、嘔吐和腹瀉等癥狀，甚至會損傷肝腎功能。有報道稱控制果 蔬采后病害的最有效手段是冷藏結合化學殺菌劑處理。但由于化學殺菌劑殘留危害人類健 康，而且植物病原菌對化學殺菌劑容易產生抗藥性，應用越來越受到限制。
[0004] 以人們喜愛的嶺南佳果荔枝為例，荔枝果實營養豐富，其色、香、味具佳，具有"果 王"的美稱，極具開發價值，具有很好的經濟效益，是我國在國際市場上最具競爭力的水果 之一，我國是目前世界上栽培荔枝最多的國家。但荔枝很難保存，針對荔枝的保鮮，素有"一 日色變，二日香變，三日味變，四日色香味盡去"的總結。荔枝的果實采摘季節處于短暫且炎 熱的夏季，采后自身呼吸作用旺盛，水分蒸發率高，在自身酶及外界病原菌侵襲的雙重作用 下極易褐變腐爛，不易貯藏，不耐貯運，嚴重限制了荔枝的遠銷與出口，制約了地域市場的 開拓。據統計，荔枝每年因腐爛變質而造成的損失約占總產量的20%以上。
[0005] 目前，國內外荔枝果實的貯藏保鮮技術主要有物理貯藏和化學保鮮兩種。荔枝 果實的化學保鮮過程中常用防腐藥物主要是苯來特、特克多、施保克、滅菌威、多菌靈等， 如申請號為 CN200610123793. 1、CN03140439. 1、CN 201010127794. X 等專利；此外還包括 熏硫或亞硫酸鹽處理等化學處理方式，例如申請號為CN96122329. 4、CN97105377. 4以及 CN00130815. 7等專利。雖然化學藥劑能比較有效的起到防腐、保鮮的作用，但其所產生的殘 留污染不僅影響風味，而且最重要的是藥劑殘留對人體健康有潛在威脅。化學保鮮劑屢屢 觸動備受食品安全問題煎熬的消費者神經。加之噴酸荔枝、石灰芒果等報道見諸報端和網 絡，不斷地引發消費者的不安。尋找安全無毒的生物保鮮技術，用于取代化學保鮮法，已經 成為關注的熱點。
[0006] 微生物種類豐富、代謝途徑多樣，并能產生對自然界病害菌有拮抗作用的活性 物質。因此，利用微生物及其制劑來進行水果保鮮，能達到無毒、無害、無殘留、無污染 的要求，安全有效地消除化學藥劑的殘留，符合食品安全的發展趨勢。多粘類芽孢桿菌 是土壤中常見的細菌，也是一類重要的病害生物防治微生物， 有不少還具有刺激植物生長的特點。大量研究表明，多粘類芽孢桿菌除了可以直接抑制植 物病原菌，還能通過產生抗菌物質如抗菌蛋白質或酶、誘導寄主的抗病能力等。對于多粘類 芽孢桿菌誘導寄主的抗病能力機制的研究越來越受到重視，2004年童蘊慧等公開了利用多 粘類芽孢桿菌（菌株處理番爺葉片，能夠明顯增強植株葉內苯 丙氨酸解氨酶（PAL)、過氧化物酶（POD)、多酚氧化酶（PPO)和超氧化物歧化酶（SOD)活性， 對灰霉病有明顯的誘導抗病作用。也就是說現有的多粘類芽孢桿菌可以直接抑制植物病原 菌，同時增強寄主的過氧化物酶（P0D)、多酚氧化酶（PPO)活性。而本領域公知常識，抑制相 關病菌對果蔬的保鮮具有正向作用，而促進POD、PPO酶類的活性對果蔬的保鮮具有反向作 用，因此目前尚未見有多粘類芽孢桿菌應用于果蔬保鮮的研究和報道。


【發明內容】

[0007] 本發明要解決的技術問題是克服現有荔枝或龍眼等果蔬采后生物保鮮技術的缺 陷和不足，提供了一株新的多粘類芽孢桿菌菌株，該菌株不僅 對炭疽病和荔枝霜疫霉病具有顯著的抑制作用，而且能夠抑制荔枝或龍眼的多酚氧化酶和 /或過氧化物酶的活性，為果蔬的生物保鮮【技術領域】提供了一個有效的新菌株。
[0008] 本發明另一目的是提供一種上述新菌株的制備方法，以及用于培養上述新菌株的 改良LB液體培養基。
[0009] 本發明上述目的通過以下技術方案實現： 本發明提供了一株多粘類芽孢桿菌菌株dgnkzx004,所 述菌株于2014年10月21日保藏于中國典型培養物保藏中心（CCTCC)，保藏號是CCTCC M 2014504。所述中國典型培養物保藏中心的地址為湖北省武漢市武漢大學。
[0010] 本發明人從東莞農業科學研究中心果園土壤中采集到所述菌株。
[0011] 具體地，在荔枝果園，選用對角線法和棋盤法采樣。確定取土地點后，除去上面的 枯枝落葉層以及地表5cm左右的浮土；之后用伊斜向下(離地表5?15cm深度的土壤）切 取一片片的土壤樣品。每個取樣點取5?15個樣，將取好的土樣在滅菌牛皮紙上混合，四 分法獲取所需土壤的量。編號，記錄采集信息：每一采樣地的采集地點、采集日期、采集深度 等。
[0012] 將各采樣點混合土樣各稱取10g，放入盛有IOOmL無菌水(制備I : 10 土壤懸液)并 帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20min，使土樣與水充分混合并分散，此為原稀釋液；再 用ImL無菌吸管吸取ImL稀釋后的土壤溶液注入盛有9mL無菌水的試管中，用吸耳球多次 吹吸充分混勻，此為KT 1稀釋懸液；依次類推將土樣梯度稀釋成10 _2,1〇_3,1〇_4,1〇_5,1〇_ 6的 土壤稀釋懸液，重復3次。多次吹吸混勻所制備好的稀釋液，取10'10'KT6三個梯度的稀 釋液，用無菌移液管吸取（吸取前再次吹吸，確保稀釋液均勻）〇. 2mL加到已凝固的LB平板 上，然后用涂布棒迅速將菌液均勻涂開。待菌落長出，挑取菌落形態差異明顯的單菌落進入 平板劃線分離，劃線分離3次進行純化并進行革蘭氏染色鏡檢。
[0013] 本發明還提供了所述菌株的最適改良LB液體培養基，上述LB平板就是由改良LB 液體培養基加入瓊脂制備而成；所述改良LB液體培養基的成分：蛋白胨15g，葡萄糖20g， 酵母提取物 5g，NaCl 10g，水 lOOOmL，ρΗ6· 8,121°C滅菌 20min。
[0014] 本發明還提供了一種所述菌株dgnkzx004的培養方法，使用上述改良LB液體培養 基作為培養基，具體步驟如下： 51. 菌株的活化：將多粘類芽孢桿菌dgnkzX〇04的甘油菌種按體積比2%的接種量接種 到改良LB液體培養基中，32°C靜置活化培養20小時，得種子液； 52. 擴大培養：將種子液按體積比5%的接種量接種到改良LB液體培養基中，并于32°C 靜置培養20小時，得發酵液； 53. 菌體懸液制備：發酵液經離心收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌2次，離心獲得所需 的活菌體，最后用生理鹽水將菌體懸起制成細胞懸浮液。
[0015] 其中，S3 所述離心是 9500r/min、4°C離心 15min。
[0016] 本發明所述多粘類芽孢桿菌株dgnkzx004的菌落形態為圓形，奶油白色，表面干 燥不透明，凸起生長，濕潤，邊緣整齊，直徑1. 3?I. 7_ ;顯微鏡觀察菌體形態為革蘭式陽 性菌，桿狀。
[0017] 本發明通過長期大量的實驗研究，獲得的該菌株不僅對常見的炭疽病和荔枝霜疫 霉病等水果采后病害具有顯著、穩定的抑菌效果，還能夠抑制荔枝或者龍眼的多酚氧化酶 (PPO)和/或過氧化物酶（POD)的活性。因此，該菌株在荔枝或龍眼的保鮮方面具有非常重 要的應用價值，能獲得很好地保鮮效果，尤其是應用于嶺南佳果荔枝或龍眼，能獲得最好的 保鮮效果。其中對桂味荔枝、糯米糍荔枝、井崗紅糯荔枝品種的保鮮效果最為突出。
[0018] 本發明提供一種優選地應用技術方案，將多粘類芽孢桿菌株制備成一種保鮮菌 齊U，以多粘類芽孢桿菌菌株dgnk ZX〇04的菌體懸液為有效的活性成分。
[0019] 所述保鮮菌劑包括以下重量百分含量的各組分：納他霉素0. 2?0. 6g/L，乳酸鈉 1%?5%，氯化鈉0. 85%?0. 9%，水余量；在上述各組分組成的100%體系中加入所述多粘類 芽孢桿菌的菌體沉淀，使其在體系中的最終濃度為IO8?10 9CFU/mL。
[0020] 優選地，所述保鮮菌劑包括以下重量百分含量的各組分：納他霉素 0. 3g/L，乳酸 鈉1%，氯化鈉0. 85%，水余量；在上述各組分組成的100%體系中加入所述多粘類芽孢桿菌的 菌體沉淀，使其在體系中的最終濃度為7. 4?8. 2X 108CFU/mL。
[0021] 本發明所述的多粘類芽孢桿菌菌株dgnkzx004和上述保鮮菌劑可以很好的應用 于荔枝或龍眼的保鮮方面的應用。尤其是對桂味荔枝、糯米糍荔枝、井崗紅糯荔枝品種，具 有非常顯著的保鮮效果。
[0022] 優選地，所述的多粘類芽孢桿菌菌株dgnkzx004應用于抑制蒸枝霜疫霉菌和/或 炭疽病菌方面。對常見的炭疽病和荔枝霜疫霉病等水果采后病害具有顯著、穩定的抑菌效 果。
[0023] 優選地，所述的多粘類芽孢桿菌菌株dgnkzX〇04應用于抑制荔枝或龍眼的多酚氧 化酶和/或過氧化物酶活性方面。
[0024] 本發明具有以下有益效果： 本發明提供了一株新的多粘類芽孢桿菌dgnkzx004菌株， 經試驗證明，該菌株不僅對荔枝霜疫霉菌、荔枝炭疽病菌具有良好的抑制作用，而且能夠抑 制荔枝或者龍眼的多酚氧化酶（PPO)和/或過氧化物酶（POD)的活性，對果蔬的保鮮具有顯 著的應用效果，尤其是對荔枝的保鮮效果最為突出，為果蔬的生物保鮮【技術領域】提供了一 個新的微生物成員。
[0025] 本發明基于新的多粘類芽孢桿菌dgnkzx004菌株，為 果蔬的生物保鮮【技術領域】提供一種新的保鮮菌劑。所述保鮮菌劑尤其是對荔枝霜疫霉菌、 炭疽病菌具有良好的抑制作用，還能抑制荔枝或者龍眼的多酚氧化酶（PPO)和/或過氧化 物酶（POD)的活性，對荔枝或龍眼等果蔬具有顯著的保鮮作用。
[0026] 上述保鮮菌劑是本發明人在獲得的多粘類芽孢桿菌（/^?/?從<3<^777/>5/7〇/7--_7^3) dgnkzX〇04菌株的基礎上，將納他霉素、乳酸鈉、氯化鈉與所述菌株的菌體懸液相配伍，獲 得了優良的果蔬保鮮效果。在選擇菌劑輔料時，本發明人經過大量實驗結合對各種輔料的 性質研究，總結得到本發明技術方案：納他霉素依靠其內酯環結構與真菌細胞膜上的甾醇 化合物作用，形成抗生素一留醇化合物，從而破壞真菌的細胞質膜的結構。大環內脂的親水 部分(多醇部分）在膜上形成水孔，損傷細胞膜通透性，進而引起菌內氨基酸，電解質等物質 滲出，菌體死亡，而且很難被人體消化道吸收，對人體無害，同時微生物很難對其產生抗性， 是一種無臭、無味，低劑量且安全性高的食品防腐劑；本發明提供的菌劑體系中，能夠發揮 乳酸鈉的保鮮和保水性能，經過不斷分析研究和大量實驗總結，在本發明提供的合適的配 伍構成的體系下，菌株可以很好地成活并發揮活性作用，重要的是本發明菌體懸液體系共 同產生了顯著的應用技術效果。
[0027] 本發明在獲得的多粘類芽孢桿菌/7〇/j?j^ra)dgnkzx004菌株的基 礎上，進一步總結得到各組分的合理配伍比例，在適宜的用量范圍內，本發明的保鮮菌劑具 有很好的保鮮效果，應用于荔枝，尤其是桂味荔枝，常溫貯藏4天后仍能保持鮮亮的外觀和 良好的風味，好果率可達80%左右，5天后好果率為40%，6天后仍然有20%左右的好果率； 除此之外，本發明保鮮菌劑安全無毒、易溶于水便于食用前清洗等優點。
[0028] 本發明應用所述菌株制備菌劑并成功實現應用，克服了通常微生物菌的活性應用 局限于實驗室的缺陷，具有很好的實際應用前景。所述菌劑制備方法簡單，應用方便，為微 生物菌在果蔬保鮮方面的應用提供有力的技術啟示和指導，具有重要的應用價值和實際推 廣應用可行性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1為多粘類芽孢桿菌dgnkzx004菌株菌落形態（LB培養基，32°C，2天)。
[0030] 圖2為多粘類芽孢桿菌dgnkzx004革蘭氏染色鏡檢結果。
[0031] 圖3為多粘類芽孢桿菌dgnkzx004對炭疽菌抑制實驗結果。
[0032] 圖4為多粘類芽孢桿菌dgnkzX〇04對霜疫霉菌抑制實驗結果。
[0033] 圖5多粘類芽孢桿菌dgnkzx004對過氧化物酶（POD)活性影響效果圖。
[0034] 圖6為多粘類芽孢桿菌dgnkzx004對多酚氧化酶（PPO)活性影響效果圖。
[0035] 圖7為對照例和實施例4的桂味荔枝好果率隨貯藏時間變化的對比曲線。
[0036] 圖8為對照例和實施例4的桂味荔枝褐變指數隨貯藏時間變化的對比曲線。
[0037] 圖9為對照例和實施例4的糯米糍荔枝好果率隨貯藏時間變化的對比曲線。
[0038] 圖10為對照例和實施例4的糯米糍荔枝褐變指數隨貯藏時間變化的對比曲線。

【具體實施方式】
[0039] 下面結合說明書附圖和具體實施例來進一步詳細闡述本發明。本發明以下實施例 為本發明較佳的實施方式，但并不對本發明做任何形式的限定。本發明主要闡述所述菌株 以及基于所述菌株的應用思想，實施方式中簡單參數的替換不能一一在實施例中贅述，但 并不因此限制本發明，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替 代、組合、簡化，應被視為等效的置換方式，都應包含在本發明范圍內。
[0040] 除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本【技術領域】常規試劑、方法和設 備。除非特別說明，本發明所用試劑和材料均為市購。
[0041] 實施例1菌株分離及鑒定 1、本發明人于2011年8月2日采集東莞農業科學研究中心果園土壤，將各采樣點混 合土樣各稱取l〇g，放入盛有IOOmL無菌水(制備I : 10 土壤懸液)并帶有玻璃珠的三角燒瓶 中，振搖約20min，使土樣與水充分混合并分散，此為原稀釋液；再用ImL無菌吸管吸取ImL 稀釋后的土壤溶液注入盛有9mL無菌水的試管中，用吸耳球多次吹吸充分混勻，此為KT1稀 釋懸液；依次類推將土樣梯度稀釋成1〇_ 2,1〇_3,1〇_4,1〇_5,1〇_6的土壤稀釋懸液，重復3次。多 次吹吸混勻所制備好的稀釋液，取1〇_ 2、1〇_4、1〇_6三個梯度的稀釋液，用無菌移液管吸取(吸 取前再次吹吸，確保稀釋液均勻)〇. 2mL加到已凝固的LB平板上，然后用涂布棒迅速將菌液 均勻涂開。待菌落長出，挑取菌落形態差異明顯的單菌落進入平板劃線分離，劃線分離3次 進行純化并進行革蘭氏染色鏡檢。
[0042] 上述LB平板是由改良LB液體培養基加入瓊脂制備而成；所述改良LB液體培養 基的成分：蛋白胨15g，葡萄糖20g，酵母提取物5g，NaCl 10g，水1000mL，pH6.8，121°C滅菌 20min〇
[0043] 2、在LB培養基純化平板上菌落形態為：圓形，奶油白色，表面干燥不透明，凸起生 長，濕潤，邊緣整齊，直徑1. 3?I. 7mm。見附圖1所示。
[0044] 將所述菌株保藏于中國典型培養物保藏中心（CCTCC)，保藏日期是2014年10月 21日，保藏號是CCTCC M 2014504,所述菌株命名為dgnkzx004。
[0045] 所述中國典型培養物保藏中心的地址為湖北省武漢市武漢大學。
[0046] 3、革蘭氏染色實驗 Si.涂片：取一片干凈無油載玻片，在中央滴一滴無菌水，然后用接種環以無菌操作方 法取少許培養好的菌株，放在載玻片的水滴中涂勻，注意菌量不宜過多，否則，不易看清單 個菌體。
[0047] S2.固定：將涂好的玻片在酒精燈火焰上快速通過3?4次，使水份蒸發，此時細 菌菌體緊貼在玻片上。
[0048] S3.初染：加草酸銨結晶紫染色劑1滴，染色1分鐘。
[0049] S4.媒染：傾去染液并用洗瓶裝水輕輕沖洗，加碘液染色1分鐘，水洗，然后用吸水 紙吸干。
[0050] S5.脫色：將載玻片略傾斜，滴加95%酒精脫色20?30秒(洗至流下的酒精中無 紫色時為止)，然后水洗。
[0051] S6.復染：在玻片上滴加番紅染液約2分鐘，水洗，然后用吸水紙吸干。染色中應 防止染液干涸。
[0052] S7.鏡檢：干燥后用油鏡進行鏡檢，鏡檢顯示為一株革蘭氏陽性桿菌，桿狀。菌體 形態結果見附圖2。
[0053] 實施例2抑菌試驗 由于炭疽病和荔枝霜疫霉病是采后荔枝最常見的病害，因此本實施例選用炭疽病菌、 荔枝霜疫霉菌作為病原指示菌，來研究多粘類芽孢桿菌菌株dgnkzX〇04的抑菌活性。
[0054] 1、制備懸浮液 將50%甘油管冷凍保藏的多粘類芽孢桿菌dgnkzx004的 甘油管冷凍保藏的菌種按2%(v/v)接種量到20mL改良LB液體培養基中，并于32°C培養箱 中靜置活化培養20小時；將活化好的種子液按5%(v/v)接種量接到IOOOmL改良LB液體培 養基中，并于32°C培養箱中震蕩培養20小時；發酵完成后，發酵液經8000r/min、4°C離心 15min收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌2次，離心獲得所需的活菌體。最后用適量生理鹽水 將菌體懸起制成細胞懸浮液。
[0055] 所述改良LB液體培養基的成分：蛋白胨15g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取物5g， NaCl 10g，水 lOOOmL，ρΗ6· 8,121°C滅菌 20min。菌株培養溫度 32°C。
[0056] 2、抑制效果檢測 設置對照組和實驗組： (1)對照：用一毫升槍頭的大口端打取真菌(霜疫霉菌，炭疽病菌)培養基塊置于PDA平 板中央生長。
[0057] (2)發酵液組：取2毫升發酵液(完全發酵液，包括菌體)和18毫升帶有瓊脂的PDA 培養基混勻，倒于平板上，冷卻，用一毫升槍頭的大口端打取真菌培養基塊置于平板中央生 長。
[0058] (3)發酵液上清組：取2毫升發酵液上清(完全發酵液經過離心后的上清，不包括 菌體）和18毫升帶有瓊脂的PDA培養基混勻，倒于平板上，冷卻，用一毫升槍頭的大口端打 取真菌(霜疫霉菌，炭疽病菌）培養基塊置于平板中央生長。
[0059] (4)菌體懸浮液組：取2毫升菌體懸浮液(完全發酵液經過離心后的菌體)和18毫 升帶有瓊脂的PDA培養基混勻，倒于平板上，冷卻，用一毫升槍頭的大口端打取真菌(霜疫 霉菌，炭疽病菌）培養基塊置于平板中央生長。
[0060] 結果如附圖3和附圖4所示，附圖3為多粘類芽孢桿菌dgnkzx004菌株對炭疽菌 的抑制結果，附圖4為對霜疫霉菌的抑制結果。
[0061] 與對照組相比，多粘類芽孢桿菌dgnkzx004菌株，以及其發酵液和發酵液上清，均 對霜疫霉菌和炭疽病菌都有很好的抑制作用。
[0062] 3、抑菌率計算 抑菌率（％)=(對照菌落平均直徑-處理菌落平均直徑）/對照菌落平均直 徑 X 100。
[0063] 結果如表1所示，結果顯示，本發明的多粘類芽孢桿菌dgnkzx004菌株、以及其發 酵液和發酵液上清，均對炭疽病菌和荔枝霜疫霉菌都有很好的抑制作用。
[0064] 表1多粘類芽孢桿菌dgnkzX〇04對炭疽菌及霜疫霉菌的抑制率

【權利要求】
1. 一株多粘類芽孢桿菌（菌株dgnkzx004,其特征在于，所 述菌株于2014年10月21日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號是CCTCC M 2014504， 保藏地址為湖北省武漢市武漢大學。
2. 根據權利要求1所述菌株，其特征在于，所述菌株的菌落形態為圓形，奶油白色，表 面干燥不透明，凸起生長，濕潤，邊緣整齊，直徑1. 3?1. 7_ ;顯微鏡觀察菌體形態為革蘭 式陽性菌，桿狀。
3. -種權利要求1或2所述菌株dgnkzx004的培養方法，其特征在于，步驟如下：
51. 菌株活化：將多粘類芽孢桿菌dgnkzX〇04的甘油菌種按體積比2%的接種量接種到 LB液體培養基中，32°C靜置活化培養20小時，得種子液；
52. 擴大培養：將種子液按體積比5%的接種量接種到LB液體培養基中，并于32°C靜置 培養20小時，得發酵液；
53. 菌體懸液制備：發酵液經離心收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌，離心獲得所需的活 菌體，最后用生理鹽水將菌體懸起制成細胞懸浮液。
4. 根據權利要求3所述培養方法，其特征在于，S1或S2所述LB液體培養基為改良LB 液體培養基，成分為：蛋白胨15g，葡萄糖20g，酵母提取物5g，NaCl 10g，水1000mL，pH6. 8， 121°C 滅菌 20min。
5. 根據權利要求3所述培養方法，其特征在于，S3所述離心是9500r/min、4°C離心 15min〇
【文檔編號】C12N1/20GK104480034SQ201410630169
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月11日 優先權日:2014年11月11日
【發明者】馬錁, 徐匆, 范妍, 胡珊, 李艷芳, 胡文鋒, 羅華建, 羅詩 申請人:東莞市農業科學研究中心, 胡文鋒