極化cd4+t細胞的方法
【專利摘要】本發明提供一種極化CD4+T細胞的方法，包括以下步驟：得到CD4+T細胞；進行培養時，加入SDF-1α和IL-2，刺激CD4+T細胞，培養1—8天，CD4+T細胞向Th1方向極化；或者進行培養時，加入SDF-1α和IL-4，刺激CD4+T細胞，培養1—8天，CD4+T細胞向Th2方向極化。本發明通過IL-2或IL-4聯合SDF-1α誘導Th細胞極化方向，使CD4+T細胞向Thl或Th2方向極化。其中CXCR4與SDF-1α信號轉導通路能増強TCR介導的Thl和Th2細胞活化，Th極化方向受IL-2或IL-4與SDF-1α協同信號轉導通路的影響。
【專利說明】極化CD4W細胞的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，特別是涉及一種極化CD4+T細胞的方法。
【背景技術】
[0002] 化細胞極化是一個多信號參與的復雜過程，如TCR活化信號、輔助受體W及細胞 因子、趨化因子等，對其相關研究已逐步深入到轉錄因子、信號轉導、基因調控水平。國內外 己有較多研究探討單一細胞因子或趨化因子對化細胞極化的調節機制。己有研究表明，外 源性IL-2或IL-4可使CD4+T前體細胞向Thl或化2細胞極化，其信號轉導通路的激發有賴 結合于受體胞內域的非受體型蛋白酪氨酸激酶（Syk、ZAP70等）。CXCR4是Thl細胞和化2 細胞均表達的趨化因子受體，其配體為SDF-I a (基質細胞源因子）（或CX化12)，二者結合 不僅可促T細胞遷移，還可提供T細胞共刺激和極化信號。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于提供一種新的極化CD4+T細胞的方法。
[0004] 實現上述目的的技術方案如下。
[0005] 一種極化CD4+T細胞的方法，包括W下步驟：
[000引 得到CD4+T細胞；
[0007] 進行培養時，加入SDF-I a和rhIL-2,刺激CD4+T細胞，培養1一8天，CD4+T細胞 向Thl方向極化。
[0008] 或者，包括W下步驟：
[000引 得到CD4+T細胞；
[0010] 進行培養時，加入SDF-I a和IL-4,刺激CD4+T細胞，培養1一8天，CD4+T細胞向 Th2方向極化。
[0011] 在其中一個實施例中，進行培養時CD4+T細胞細胞密度為2xlO^L，0. 5ml/孔，所 述SDF-I a的加入量為50-100ng，所述rhlk2的加入量為5-lOng。
[0012] 在其中一個實施例中，進行培養時CD4+T細胞細胞密度為2xl(yVL，0. 5ml/孔，所 述SDF-I a的加入量為50-100ng，所述rhlk4的加入量為5-lOng。
[0013] 本發明的發明人通過長期的實驗研究積累，發現通過聯合細胞因子和趨化因子協 同作用使化細胞進行極化。W往的研究表明，外源性IL-2可使CD4+T前體細胞向Thl細 胞極化；外源性IL-4可使CD4+T前體細胞向化2細胞極化。SDF-I a可提供T細胞共刺激 和極化信號。但單一細胞因子或趨化因子并不代表整個機體免疫網絡，僅能作為其中一部 分，細胞因子和趨化因子間也存在交互作用。而本發明人發現，單純使用IL-2或者IL-4極 化CD4+T前體細胞不能提供其所需的共刺激和極化信號，因此聯合細胞因子和趨化因子共 同調節化細胞極化具有重要意義，通過二者聯合使用，可W使CD4+T前體細胞表達趨化因 子受體，并與其配體SDF-I a結合，從而順利完成極化過程。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014] 圖1為實時定量RT-PCR檢測細胞IFN-YmRNA(A)和比-4mRNA做表達，其中圖 A.圓形；標準DNA模板
[0015] H角形；resting CB CD4+T 細胞
[001引菱形；經比-2 (lOug/L)和SDF-I a (lOOug/L)刺激的細胞 [0017]方形：經 IL-4(10ug/L)和 SDF-I a (lOOug/L)刺激的細胞 [001引圖B.圓形；標準DNA模板
[0019] 方形；resting CB CD4+T 細胞
[0020] 菱形；經比-2 (lOug/L)和 SDF-I a (lOOug/L)刺激的細胞
[0021] H角形：經比-4(10ug/L)和 SDF-I a (l〇〇ug/L)/CX化12 刺激的細胞；
[0022] 圖2為比-2/比-4和SDF-I a協同誘導CD4+T細胞Syk和ZAR70的磯酸化。
【具體實施方式】
[0023] 實施例1
[0024] 1. CD4+T細胞的獲得
[00巧]1. 1取新鮮廝帶血（肝素抗凝20u/ml)+生理鹽水照1 ;1稀釋；
[0026] 1. 2在50ml離也管中預先加入淋己細胞分離液15ml，再加入稀釋好的廝帶血 25ml ；
[0027] 1. 3小也的將稀釋后的血液加到分離液的上面；
[0028] 1.4 離也；轉速；1500r/min，溫度 20°C- 28°C，時間；20min ;
[0029] I. 5離也管內順次為血漿---單個核細胞層一一分離液一一紅細胞；
[0030] 1. 6用移液管吸出單個核細胞層，重息于2-5倍體積的生理鹽水中；
[00引]1. 7 離也：轉速：2000 - 2300r/min，時間；lOmin，溫度；4°C ;
[0032] 1.8離也后，棄上清液，細胞沉淀重息于Iml完全培養基中（含10% FCS的 RPM-1640 培養液）。
[0033] 2. (SD巧?1 a (基質細胞源因子）聯合IL-2^L-4極化CD4+T細胞
[0034] 2. 1調整細胞密度為2x1〇7L，放入48孔培養板，0. 5ml/孔；
[0035] 2. 2分8組給予刺激，分別為
[0036] rh比-2(5ng/孔）；
[0037] rh比-4 (5ng/孔）；
[0038] rh比-2 (5ng/ 孔）+SDF-I a 巧Ong/ 孔）；
[0039] rh比-4 (5ng/ 孔）+SDF-I a 巧Ong/ 孔）；
[0040] rh比-2 (5ng/ 孔）+SDF-I a 巧Ong/ 孔）+CXCR4mAb 化加g/ 孔）；
[0041] rh比-4 (5ng/ 孔）+SDF-I a 巧Ong/ 孔）+CXCR4mAb 化加g/ 孔）；
[0042] rh比-2 (5ng/ 孔）+SDF-I a 巧Ong/ 孔）+CXCR4mAb 的二抗化加g/ 孔）；
[0043] rh比-4 (5ng/ 孔）+SDF-I a 巧Ong/ 孔）+CXCR4mAb 的二抗化加g/ 孔）。
[0044] 2. 337°C，5% C〇2的飽和濕度培養箱中常規培養，于培養第1，2, 4, 8天收集細胞用 于檢測胞內細胞因子。
[0045] 3.檢測CD4+T細胞極化狀態
[0046] 3. I流式細胞儀檢測細胞內Thl和Th2型細胞因子表達
[0047] 將收集的細胞分為兩組，用IntraPrepTM(Coulte-ImmunoTech公司）試劑盒固定 細胞后，第1組加入鼠抗人IFN-Y抗體，室溫賠育15min，PBS洗涂2次后，加入FITC標記 的羊抗鼠二抗室溫賠育15min。第2組加入鼠抗人比-4抗體，室溫賠育15min，PBS洗涂2 次后，加入PE標記的羊抗鼠抗體室溫賠育15min。再次洗涂細胞，加入含0. 5%甲酵的PBS 制成細胞息液，通過流式細胞儀檢測胞內細胞因子表達。
[0048] 流式細胞結果表明，rhIL-2+SDF-l a刺激后，CD4+T細胞分泌IFN- Y逐漸増加， 呈時間依賴性，第8天最多，為胞內細胞因子的84. 0%;IL-4分泌逐漸減少，第8天最少，為 0. 2%。而在rhIL-2+SDF-la+Ab(CXCR4小鼠單抗）協同刺激情況下，IFN-Y分泌逐漸減 少，第8天最少，為0.4% ;IL-4分泌亦逐漸減少，第8天最少，為1.6%。rhIL-4+SDF-la 刺激后，CD4+T細胞分泌IL-4逐漸増加，第8天最多，為90. 3% ;IFN- Y分泌逐漸減少，第 8天最少，為0. 1 %。rhIL-4+SDFla+Ab (CXCR4小鼠單抗）協同刺激情況下，IL-4分泌逐漸 減少，第8天最少，為0.6% ;IFN-Y分泌百分比逐漸減少，第8天最少，為2. 8%。
[0049] 3. 2實時定量RT-PCR檢測胞內Thl和化2型細胞因子mRNA表達
[0050] 2xl06個新鮮分離CD4+T細胞提取總RNA，寡聚d (T) 12-18和SuperscriptII逆轉 錄酶反轉錄RNAW合成cDNA第一鏈，實時定量RT-PCR在ABIPRISM7700SequenceDetector Systems (Pekin Elmer Applied Bi-systems)中完成。
[0051] IFN- Y和比-4的特異性引物為：
[0052] IFN-Y sense:5-TGTAAGCCCCCA GAA-ACA-GAAAG-3,（沈Q ID NO. 1);
[0053] IFN-yantisense:5-TTGCCCATCA AGA AACAGCAG-3'（沈Q ID NO. 2);
[0054] n^-4sense:5-TCACTCTTCACTCTTTTCTTCCCC-3>GEQIDN0.3);
[00巧]IL-4antisense:5-TCTTCCCACTTTGCTGTTCCT-3'(沈Q ID NO. 4);
[0056] 目 actin sense:5-TCCTGTGGCATCCA CGAAACT-3'（沈Q ID NO. 5);
[0057] 目 antisense:5-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3,（沈Q ID NO. 6)。
[0058] 擴増條件：5(TC 2min，95°C 10min，93°C 20s，40 個循環。
[0059] 實時定量RT-PCR檢測新鮮分離的CD4+T細胞內IFN- Y和比-4mRNA表達分別為 7. 3X102 和 2. 1X103 拷貝；rhIL-2+SDF-l a 刺激后 8d 檢測細胞內 IFN-YmRNA 為 1. 0x104 拷貝，rh比-4mRNA為3. 6X102拷貝；rh比-4+SDF-1 a刺激后8d細胞內比-4mRNA約為 1. 3X104, IFN- Y mRNA 為 7.細101 拷貝（圖 1)。
[0060] 3. 3比-2/比-4單獨W及比-2/lk4聯合SDF-I a誘導Syk和ZAP-70磯酸化
[0061] ImlT肥緩沖液分別裂解步驟2中經過rh比-2/rh比-4 W及rh比-2/rh比-4聯合 SDF-Ia協同誘導的CD4+T細胞（細胞密度5x109/1)，離也（l〇〇〇〇r/min，5min)，取上清， 分別加入加g抗人Syk(e20)和ZAP-70(LR)抗體（Santa Cruz BioTech公司）4°C賠育比， 12%聚丙帰醜胺凝膠電泳。
[0062] 免疫復合物激酶分析；Syk, ZAP-70抗體免疫沉淀后，T肥緩沖液洗涂5遍，激酶緩 沖液洗涂4遍，然后重息到20ul (含IOul Y -32P) ATP激酶緩沖液中，室溫賠育30min后終 止反應。混合物煮沸5min，8% SDS-PAGE電泳，放射自顯影。
[0063] 免疫印跡：蛋白質進行12%聚丙帰醜胺凝膠電泳分離后轉移到硝酸纖維素膜上， 5% BSA-TBS中封閉過夜，棄封閉液，分別加入Syk、ZAF70抗體，37 C賠育比，IxTBS洗涂 10minx3 次，再加入[y-125I]p;rotein A(肥N Life Sciences 公司）37°C賠育 lh，lxTBS 洗 涂IOmin巧次，放射自顯影。
[0064] 免疫復合物激酶分析和免疫印跡顯示在IL-2和SDF-I a協同誘導30min后，Syk 即發生弱磯酸化，8d后Syk磯酸化明顯加強而穩定；而單一 IL-2或SDF-I a刺激不能誘導 Syk磯酸化（圖2A)。比-4和SDF-I a協同誘導ZAF70磯酸化的效應與比-2和SDF-I a 協同誘導Syk磯酸化的作用相似，單一 IL-4或SDF-I a刺激亦不能誘導ZAP70磯酸化（圖 沈)。
[0065] W上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員 來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可W做出若干變形和改進，該些都屬于本發明的保 護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應W所附權利要求為準。
【權利要求】
1. 一種極化⑶4+T細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟： 得到⑶4+T細胞； 進行培養時，加入SDF-1 a和rhIL-2,刺激⑶4+T細胞，培養1一8天，⑶4+T細胞向Thl 方向極化。
2. 根據權利要求1所述的極化CD4+T細胞的方法，其特征在于，進行培養時CD4+T細胞 細胞密度為2x109/L，0. 5ml/孔，所述SDF-1 a的加入量為50-100ng，所述rhIL-2的加入量 為 5-lOng。
3. -種極化⑶4+T細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟： 得到⑶4+T細胞； 進行培養時，加入SDF-1 a和IL-4,刺激⑶4+T細胞，培養1一8天，⑶4+T細胞向Th2 方向極化。
4. 根據權利要求3所述的極化CD4+T細胞的方法，其特征在于，進行培養時CD4+T細胞 細胞密度為2xl09/L，0. 5ml/孔，所述SDF-1 a的加入量為50-100ng，所述rhIL-4的加入量 為 5-lOng。
【文檔編號】C12N5/0783GK104357392SQ201410629285
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月7日 優先權日:2014年11月7日
【發明者】鄒漢東, 于兆學, 夏凡 申請人:廣州潔漢貿易有限公司