一種提高細胞間苯三酚合成產量的方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種提高細胞間苯三酚合成產量的方法及應用，屬于基因工程【技術領域】。本發明提供的方法是在重組細胞共表達磷酸轉酮酶fxpk基因、果糖1,6-二磷酸酶fbp基因和聚烯酮酐合成酶phlD基因，同時表達多重抗性因子MarA基因和乙酰輔酶A羧化酶ACCase基因中的任意一個或兩個。本發明所提供的方法在重組細胞內構建了一種新的合成間苯三酚的途徑，大大提高了間苯三酚的產量，相對于對照組，間苯三酚產量提高幅度達到68.9％。同時本發明所提供的方法還降低了間苯三酚合成過程中二氧化碳的排放，具有良好的環境效益。
【專利說明】一種提高細胞間苯三酚合成產量的方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種提高細胞間苯三酚合成產量的方法及應用，屬于基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]間苯三酚又名1，3，5-三羥基苯、均苯三酚，是重要的精細化工產品，可以用作藥物合成的中間體、燃料耦合劑、輪胎增粘劑以及偶氮復合油墨等原料，在紡織品及皮革染色工藝、生產塑料膠囊、替代碘化銀用于人工降雨等方面有廣泛應用。除此之外，間苯三酚本身還是一種優良的醫藥產品，性能優越的抗養護劑，早已廣泛用于抗菌、防腐等。
[0003]早在20世紀50年代，間苯三酚的化學合成工藝就已經建立起來并應用到工業生產中，包括2，4，6-三硝基甲苯(TNT)途徑、1，3，5-三異丙基苯途徑等。但傳統的化學合成工藝后處理較難、污染環境且原料存在安全隱患，同時副產物的存在使得間苯三酚的分離精制比較困難。
[0004]近年來，生物法合成間苯三酚已成為國內外的研究熱點。目前，咸漠等已利用葡萄糖為原料，生物合成出間苯三酚，并通過基因工程改造提高了間苯三酚的產量。間苯三酚的生物合成途徑可劃分為兩個階段，第一階段1分子葡萄糖經過糖酵解過程，形成2分子乙酰輔酶A和2分子二氧化碳；第二階段3分子的乙酰輔酶A合成1分子的間苯三酚。所以，總體而言，該合成途徑存在碳損失，造成間苯三酚產量偏低。
[0005]如果能避免糖酵解過程中碳的損失，將有效提高生物法合成間苯三酚的產率，使該過程更加具有經濟性。1.W.，Bogorad等人(2013)提出細胞除了在有氧的條件存在糖酵解途徑(MEP途徑)以外，在厭氧條件下還存在一條非氧化的糖酵解途徑(N0G途徑)，該途徑可將1分子葡萄糖轉化為3分子乙酰磷酸，進而合成3分子乙酰輔酶A。該研究在體外構建了 N0G途徑，并證明以葡萄糖6磷酸為底物，利用N0G途徑可提高乙酸(乙酰磷酸的下游產物)的產量，同時，在細胞體內，以木糖為原料，通過過表達磷酸轉酮酶基因(fxpk)和果糖1，6 二磷酸酶基因(fbp)并敲除乳酸脫氫酶(ldhA)、frdBC、adhE、pflB和frdBC后，可以使乙酸的摩爾產率達到2.2接近利用N0G途徑的乙酸理論摩爾產率2.5。雖然該研究證明了 N0G途徑的可行性，然而，該研究并沒有以葡萄糖為底物，在體內利用N0G途徑合成乙酸的研究。葡萄糖降解所需的磷酸葡萄糖轉移酶系統(PTS)涉及到復雜的調控機制，N0G途徑是否適合以葡萄糖為原料的體內代謝無法得知。此外，該研究僅報道了乙酸的變化，乙酰磷酸合成乙酸僅為一步反應，而從乙酰磷酸合成乙酰輔酶A，再由乙酰輔酶A為底物合成間苯三酚卻需要經過7步的酶反應，過表達磷酸轉酮酶基因(fxpk)和果糖1，6 二磷酸酶基因(fbp)是否適用于如此復雜的代謝途徑，是否能提高這種間苯三酚的產量和產率均無法獲知。
【發明內容】
[0006]為解決現有技術通過糖酵解途徑合成間苯三酚產量偏低的問題，本發明提供了一種提高細胞間苯三酚合成產量的方法，所采取的技術方案如下:
[0007]本發明的一個目的在于提供一種提高細胞間苯三酚合成產量的方法，該方法是使重組細胞共表達磷酸轉酮酶fxpk基因、果糖1，6- 二磷酸酶fbp基因和聚烯酮酐合成酶phlD基因，同時表達多重抗性因子MarA基因和乙酰輔酶A羧化酶ACCase基因中的任意一個或兩個。
[0008]優選地，所述方法中重組細胞同時共表達磷酸轉酮酶fxpk基因、果糖1，6_ 二磷酸酶fbp基因和聚烯酮酐合成酶phlD基因，多重抗性因子MarA基因和乙酰輔酶A羧化酶ACCase 基因。
[0009]所述重組細胞為大腸桿菌。
[0010]所述磷酸轉酮酶fxpk基因的GeneBank的登錄號為AY518212.1或Gene ID:11174923或17696722 ;所述果糖1，6- 二磷酸酶fbp基因的GeneBank登錄號為:ACT45889.UAAA34603.UAEE79180.1 或NCBI 參考序列編號:WP_003243329.1 ;所述聚烯酮酐合成酶PhlD基因的GeneBank登錄號為EU554263 ;所述乙酰輔酶A羧化酶ACCase基因的 GeneBank 登錄號為:6062185、6058890、6058863 或 6059083。
[0011 ] 所述共表達，是通過一個、兩個或更多個用于共表達所述基因的表達質粒來實現的。
[0012]所述磷酸轉酮酶fxpk基因，來源于青春雙歧桿菌；所述果糖1，6- 二磷酸酶fbp基因，來源于大腸桿菌；所述聚烯酮酐合成酶phlD基因，來源于熒光假單胞菌；所述多重抗性因子MarA基因，來源于大腸桿菌；所述乙酰輔酶A羧化酶ACCase基因，來源于大腸桿菌。
[0013]所述方法用于生產間苯三酚。
[0014]本發明的另一目的是提供一種利用所述方法生產間苯三酚的方法，該方法的步驟如下:
[0015]1)將乙酰輔酶A羧化酶ACCase基因克隆到質粒pACY⑶uet-Ι，構建重組質粒pA-accADBC ；
[0016]2)將聚烯酮酐合成酶phlD基因、多重抗性因子MarA基因、磷酸轉酮酶fxpk基因和果糖1，6- 二磷酸酶fbp基因克隆到質粒pET中，得到重組質粒pET-ph1D-MarA-fxpk-fbp ；
[0017]3)將步驟1)和步驟2)所得的兩個質粒導入到大腸桿菌中，獲得重組大腸桿菌；
[0018]4)發酵步驟3)所得重組大腸桿菌，再分離提取發酵產物中的間苯三酚。
[0019]上述方法步驟3)所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0020]上述方法步驟4)所述發酵，是按體積比1%的接種量將重組大腸桿菌接種到含有卡那霉素和氯霉素的M9發酵培養基中，在30°C，攪拌速度400rpm，pH6.0的條件下培養至0D6QQ為8-15，加入誘導劑IPTG至終濃度0.lmmol/L，關閉通氣，補加質量濃度為40% -50%重量的葡萄糖，繼續發酵12h。
[0021]本發明獲得的有益效果如下:
[0022]1.本發明通過在重組細胞中共表達磷酸轉酮酶fxpk基因、果糖1，6_ 二磷酸酶fbp基因和聚烯酮酐合成酶phlD基因，以及多重抗性因子MarA基因和乙酰輔酶A羧化酶ACCase基因，在重組菌中建立了一種新的合成間苯三酚的途徑；
[0023]2.本發明所提供的方法，極大的提高了重組細胞合成間苯三酚的能力。同時，降低了細胞合成間苯三酚過程中二氧化碳的生成和排放。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為間苯三酚的核磁共振碳譜。
[0025]圖2為間苯三酚的核磁共振氫譜。
【具體實施方式】
[0026]下面結合具體實施例對本發明做進一步說明，但本發明不受實施例的限制。
[0027]以下實施例中材料、試劑和儀器，未經特殊說明，均為本領域中的常規材料、試劑和儀器，均可通過商業渠道獲取。
[0028]以下實施例中所用的方法，未經特殊說明，均為本領域常規方法。
[0029]實施例1
[0030]將基因多重抗性因子基因MarA(GenBank登錄號:6060688)、聚烯酮酐合成酶基因 PhlD (GenBank 登錄號:EU554263)，果糖 1，6- 二磷酸酶基因 fbp (GenBank: ACT45889.1)，以及憐酸轉酮酶基因 fxpk(GenBank:AY518212.1)用 overlap extens1n PCR 的方法連接在一起，然后以同源重組的方法被克隆在pET30a上，構建重組質粒pET-phlD-marA-fxpk-fbp ? 同時，構建質粒 pA-accADBC，具體方法同專利 CN 102787135B。
[0031]實施例2
[0032]將實施例1中構建得到的重組質粒pET-phlD-marA-fxpk-fbp和pA-accADBC采用熱擊轉化法共轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，然后涂布于帶有卡那霉素和氯霉素兩種抗性的LB固體培養基平板上篩選陽性克隆，得到重組大腸桿菌LWN0GPG1。對照菌的構建為將重組質粒pET-phlD-marA和pA-accADBC采用熱擊轉化法共轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組大腸桿菌LWN0GPG0 (所有實施例均以此為對照菌)。
[0033]實施例3
[0034]采用實施例2中構建得到的重組大腸桿菌發酵生產間苯三酚，其步驟如下:
[0035]將重組細胞按體積比1 %的接種量接種到添加50 μ g ?ι?Γ1卡那霉素和30 μ g ?πιΓ1氯霉素的Μ9發酵培養基中進行發酵，在培養溫度30°C、攪拌速度400rpm、pH 6.0的條件下培養至0D6(i(i為8，加入誘導劑IPTG至終濃度0.lmmol.L—1，關閉通氣，繼續補料40重量％的葡萄糖發酵12小時；
[0036]將培養液進行離心，分離細胞和上清，上清采用等體積的乙酸乙酯萃取1次；合并萃取產物，減壓蒸餾濃縮，所得固體粉末，溶于去離子水后經氫譜碳譜(圖1和圖2)鑒定為間苯三酚，每升培養基的產量達到6.5克，產率達15%，對照菌產量達3.5g/L，產率為4%。
[0037]實施例4
[0038]采用實施例2中構建得到的重組大腸桿菌發酵生產間苯三酚，其步驟如下:
[0039]將重組細胞按體積比3%的接種量接種到添加50 μ g ?ι?Γ1卡那霉素和30 μ g ?πιΓ1氯霉素的Μ9發酵培養基中進行發酵，在培養溫度33°C、攪拌速度600rpm、pH 7.0和溶氧18%以上的條件下培養至006(|(|為10，加入誘導劑IPTG至終濃度0.5mmol.L_\關閉通氣，繼續補料60重量％的葡萄糖發酵18小時；
[0040]將培養液進行離心，分離細胞和上清，上清采用等體積的乙酸乙酯萃取2次；合并萃取產物，減壓蒸餾濃縮，所得固體粉末即為間苯三酚，每升培養基的產量達到7.6，產率達16 %，對照菌產量達4.5g/L，產率為6 %。
[0041]實施例5
[0042]將基因MarA (GenBank登錄號:6060688)聚烯酮酐合成酶(PhlD) (GenBank登錄號:EU554263)，擬南芥的果糖1，6- 二磷酸酶(GenBank:AEE79180.1)，以及凝結芽孢桿菌(Gene ID: 11174923)的磷酸轉酮酶用overlap extens1n PCR的方法連接在一起,然后以同源重組的方法被克隆在pET30a上,將質粒pET-phlD-marA-fxpk-fbp和質粒pA-accADBC共轉入BL21 (DE3)。將重組細胞按體積比1 %的接種量接種到添加50 μ g.mL—1卡那霉素和30 μ g -πιΓ1氯霉素的Μ9發酵培養基中進行發酵，在培養溫度30°C、攪拌速度400rpm、pH6.0的條件下培養至0D_為15，加入誘導劑IPTG至終濃度0.lmmol噸―1，關閉通氣，繼續補料40重量％的葡萄糖發酵12小時；
[0043]將培養液進行離心，分離細胞和上清，上清采用等體積的乙酸乙酯萃取1次；間苯三酚產量達到5.4克，產率達11%，對照菌產量達3.2g/L，產率為3.8%。
[0044]實施例6
[0045]將基因MarA (GenBank登錄號:6060688)聚烯酮酐合成酶(PhlD) (GenBank登錄號:EU554263)，釀酒酵母的果糖1，6-二磷酸酶(GenBank: AAA34603.1)，以及蒙氏腸球菌的磷酸轉酮酶(Gene ID: 17696722)用overlap extens1n PCR的方法連接在一起，然后以同源重組的方法被克隆在pET30a上,將質粒pET-phlD-marA-fxpk-fbp和質粒pA-accADBC共轉入BL21 (DE3)。將重組細胞按體積比1 %的接種量接種到添加50 μ g.mL—1卡那霉素和30 μ g -πιΓ1氯霉素的Μ9發酵培養基中進行發酵，在培養溫度30°C、攪拌速度400rpm、pH6.0的條件下培養至0D_為12，加入誘導劑IPTG至終濃度0.lmmol噸―1，關閉通氣，繼續補料40重量％的葡萄糖發酵12小時；
[0046]將培養液進行離心，分離細胞和上清，上清采用等體積的乙酸乙酯萃取1次；間苯三酚產量達到6.1克，產率達14%，對照菌產量達3.4g/L，產率為3.8%。
[0047]雖然本發明已以較佳的實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可以做各種改動和修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
【權利要求】
1.一種提高細胞間苯三酚合成產量的方法，其特征在于，重組細胞共表達磷酸轉酮酶fxpk基因、果糖1，6- 二磷酸酶fbp基因和聚烯酮酐合成酶phlD基因，同時表達多重抗性因子MarA基因和乙酰輔酶A羧化酶ACCase基因中的任意一個或兩個。
2.權利要求1所述方法，其特征在于，重組細胞同時共表達磷酸轉酮酶fxpk基因、果糖I,6- 二磷酸酶fbp基因和聚烯酮酐合成酶phlD基因，多重抗性因子MarA基因和乙酰輔酶A羧化酶ACCase基因。
3.權利要求1和2所述方法，其特征在于，所述重組細胞為大腸桿菌。
4.權利要求1和2所述方法,其特征在于,所述磷酸轉酮酶fxpk基因的GeneBank的登錄號為AY518212.1或者Gene ID =11174923或17696722 ;所述果糖I, 6- 二磷酸酶fbp基因的 GeneBank 登錄號為:ACT45889.1、AAA34603.1、AEE79180.1 或 NCBI 參考序列編號:WP_003243329.1 ;所述聚烯酮酐合成酶phlD基因的GeneBank登錄號為EU554263 ;所述乙酰輔酶A羧化酶ACCase基因的GeneBank登錄號為:6062185、6058890、6058863 或6059083。
5.權利要求1和2所述方法，其特征在于，所述共表達，是通過一個、兩個或更多個用于共表達基因的表達質粒來實現。
6.權利要求1和2所述方法，其特征在于，所述磷酸轉酮酶fxpk基因，來源于青春雙歧桿菌；所述果糖1，6- 二磷酸酶fbp基因，來源于大腸桿菌；所述聚烯酮酐合成酶phlD基因，來源于熒光假單胞菌；所述多重抗性因子MarA基因，來源于大腸桿菌；所述乙酰輔酶A羧化酶ACCase基因,來源于大腸桿菌。
7.權利要求1-6所述方法，其特征在于，用于生產間苯三酚。
8.一種利用權利要求1所述方法生產間苯三酚的方法，其特征在于，步驟如下: 1)將乙酰輔酶A羧化酶ACCase基因克隆到質粒pACY⑶uet_l，構建重組質粒pA-accADBC ； 2)將聚烯酮酐合成酶phlD基因、多重抗性因子MarA基因、磷酸轉酮酶fxpk基因和果糖1，6- 二磷酸酶fbp基因克隆到質粒pET中，得到重組質粒pET-phlD-MarA-fxpk-fbp ； 3)將步驟I)和步驟2)所得的兩個質粒導入到大腸桿菌中，獲得重組大腸桿菌； 4)發酵步驟3)所得重組大腸桿菌，再分離提取發酵產物中的間苯三酚。
9.權利要求8所述方法，其特征在于，步驟3)所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。
10.權利要求8所述方法，其特征在于，步驟4)所述發酵，是按體積比I%的接種量將重組大腸桿菌接種到含有卡那霉素和氯霉素的M9發酵培養基中，在30°C，攪拌速度400rpm，pH6.0的條件下培養至OD_為8_15，加入誘導劑IPTG至終濃度0.lmmol/L，關閉通氣，補加質量濃度為40%的葡萄糖，繼續發酵12-48h。
【文檔編號】C12N15/70GK104357495SQ201410617248
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月5日 優先權日:2014年11月5日
【發明者】咸漠, 劉煒, 曹玉錦, 孫超 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所