四吡咯化合物的制備方法及四吡咯化合物的制作方法

四吡咯化合物的制備方法及四吡咯化合物的制作方法
【專利摘要】在培養基中培養大腸桿菌，所述大腸桿菌的基因ypjD(b2611)由于突變而無法表達，并從該培養基中得到具有卟啉環結構的四吡咯化合物。
【專利說明】四吡咯化合物的制備方法及四吡咯化合物
[0001] 本申請是申請號為200880118147. 3、申請日為2010年5月28日的同名申請的分 案申請。

【技術領域】
[0002] 本發明涉及四吡咯化合物的制備方法及四吡咯化合物。

【背景技術】
[0003] 卟啉或葉綠素等四吡咯化合物，作為抗癌劑等藥品是重要的化合物，另外作為食 品添加劑或電子學領域中的氧化還原催化劑等而被使用。這樣的四吡咯化合物，一般通過 化學合成法制備得到。但化學合成法有需要使用特定的制備裝置及催化劑等的問題，另外， 化學合成法中使用的溶劑也會對環境造成不良影響。
[0004] 基于上述原因，提出了使用微生物制備四吡咯化合物的方法。已知例如，培養作 為光合作用細菌的屬于織線藻屬的突變株微生物，并從培養物中提取原葉綠素酸酯的方法 (例如參考專利文獻1)。其次已知有通過培養光合作用細菌來回收四吡咯化合物的方法 (例如參考專利文獻2和3)。此外還知有通過在含特定化合物的培養基中培養節桿菌屬微 生物，并從培養物中提取尿卟啉的方法（例如參考專利文獻4)。
[0005] 專利文獻1 :特開平5-91866號公報
[0006] 專利文獻2 :特開平5-244937號公報
[0007] 專利文獻3 :特開2000-23691號公報
[0008] 專利文獻4 :特開平5-38295號公報


【發明內容】

[0009] 發明擬解決的技術課題
[0010] 但是專利文獻1的方法中，必須從菌體中提取原葉綠素酸酯，具體包括，破碎菌體 細胞后，通過萃取等方法進行分離、純化。此外在專利文獻2?4記載的方法中，培養基中 必須含有四吡咯化合物的前體（5-氨基酮戊酸）。
[0011] 本發明的課題，可解決上述現有技術中存在的問題，提供一種簡便制備方法，即利 用大腸桿菌，不使用四吡咯化合物的前體而制備四吡咯化合物。
[0012] 解決課題的技術方案
[0013] 本發明的四吡咯化合物的制備方法，其特征在于，
[0014] ?在培養基中培養大腸桿菌，所述大腸桿菌的基因 ypjD(b2611)由于突變而無法 表達；及
[0015] ?從所述培養基得到具有卟啉環結構的四吡咯化合物。
[0016] 本發明的制備方法，其特征在于，
[0017] 將化合物作為原料添加到培養基中，所述化合物含有在所述培養基中：
[0018] ?作為離子的金屬元素、或
[0019] ?作為離子而解離的金屬元素，
[0020] 由此得到含所述金屬的四吡咯化合物。
[0021] 上述四吡咯化合物，其特征在于，是卟啉環中含有4個甲基、4個乙酯或乙酸基（丙 酸基）的化合物。
[0022] 本發明的四吡咯化合物的制備方法，其特征還在于，
[0023] ?在培養基中培養大腸桿菌，所述大腸桿菌的基因 ypjD(b2611)由于突變而無法 表達，所述培養基中作為原料添加有化合物，所述化合物含有在培養基中：
[0024] 作為離子的Μη、或
[0025] 作為離子而解離的Mn ;及
[0026] ?從所述培養基得到具有以Mn為中心配位的卟啉環結構的四吡咯化合物。
[0027] 本發明的四吡咯化合物，其具有式：[C36H36O 8N4 · Mn (III)]+。
[0028] 發明效果
[0029] 通過本發明可達到以下效果：在培養基中培養大腸桿菌，尤其是基因 ypjD(b2611)由于突變而無法表達的大腸桿菌；由于能夠從所述培養基中回收具有卟啉環 結構的四吡咯化合物，所以即使不使用前體也能很簡便的提供四吡咯化合物。
[0030] 實施方式
[0031 ] 根據本發明涉及的四批咯化合物制備方法的實施方式，優選在貧營養培養基培養 大腸桿菌，再從所述貧營養培養基中分離、回收四吡咯化合物，從而制備得到具有卟啉環結 構的四吡咯化合物。即，本發明是在培養基中培養、增殖大腸桿菌的過程中，使大腸桿菌產 生四吡咯化合物，通過回收分泌到培養基中的四吡咯化合物來制備四吡咯化合物。為了防 止培養基中的某些天然物質等成分妨礙四吡咯化合物的分離，因此作為培養基優選使用貧 營養培養基。作為貧營養培養基，優選含有葡萄糖或乳糖的培養基，但并不限定于此。
[0032] 在本發明中使用的大腸桿菌優選基因 ypjD(b2611)由于突變而無法表達的大 腸桿菌。可舉例源于K12株及BL21株的大腸桿菌等。例如，優選源于K12株的基因 ypjD(b2611)由于突變而無法表達的大腸桿菌。作為基因 ypjD(b2611)由于突變而無法 表達的大腸桿菌，可舉例插入了基因 ypjD(b2611)的轉座子的突變株。在所述突變株中， 基因 ypjD(b2611)的表達處于部分或完全缺失的狀態。其次，K12株可以從國家生物資源 中心（National BioResource)得到，BL21株可以從例如Takara Bio得到。另外，作為插 入了基因 ypjD(b2611)的轉座子的突變株，可舉例為，能從國家生物資源中心（National BioResource)獲得的 JD23504 等。
[0033] 在本實施方式中，首先，將大腸桿菌在貧營養培養基中培養。此時優選將大腸桿菌 在貧營養培養基以外的適當培養基（例如LB培養基等）中進行預培養，再將得到的預培養 物接種到貧營養培養基中進行培養。
[0034] 大腸桿菌的培養條件，采用大腸桿菌常規培養條件即可。當將大腸桿菌進行預培 養后，變換培養基，而在貧營養培養基中進行培養時，這對無論何種培養條件都是相同的。 例如，使用LB培養基在15°C?40°C的溫度下預培養6小時?24小時后，將得到的細胞懸 池液再于貧營養培養基中在20°C?40°C的溫度下培養12小時?96小時。由此，培養基中 的細胞增殖，就可以得到目標四吡咯化合物帶有特有色調的培養物（產物）。
[0035] 其次，可如下從上述培養物中分離目標四吡咯化合物。
[0036] 具體而言，培養物通過離心分離得到上清液，將其過濾后采用例如離子交換樹脂 色譜柱或反相色譜柱從濾液中吸附、分離四吡咯化合物。例如，培養物用離心機使細胞沉 淀，得到含有培養物（產物）的上清液。接著，將上述上清液用一定孔徑（如〇. 22 μ m)的濾 膜過濾后，再利用上述色譜柱吸附于離子交換樹脂。隨后可用例如20%乙腈-0. 1%三氟醋 酸溶液等從離子交換樹脂洗脫出產物后，進行冷凍干燥。另外，此情況中的洗脫也可使用含 有酸或堿的溶液的有機溶劑。根據本實施方式可以得到1種或2種以上的四吡咯化合物， 例如，從500mL的細胞懸濁液中可得數?數十mg的四吡咯化合物。
[0037] 將由上述操作分離的產物經NMR(Nuclear Magnetic Resonance,核磁共振）等分 析，可以證實含有四吡咯化合物。此外，對該產物進行吸光度分析，可知是在染料的特定波 長范圍內有吸收的化合物。很多情況下是顯示出與葉綠素、血紅素或酞菁類似的雙吸收峰 的染料化合物。這類染料化合物可作為由光激發電子的光催化劑或電子傳遞物而使用。另 夕卜，由于其在水溶液中或經由細胞膜參與氧化還原反應，因此認為其在電池中也能發揮作 用。
[0038] 如上所述，根據本發明，使用大腸桿菌可以制備卟吩、嚇啉及卟啉絡合物等卟啉 類四吡咯化合物及含有金屬的四吡咯化合物或絡合物，不需要像化學合成法那樣，根據目 標化合物的種類選擇制備裝置、催化劑，且不需要使用溶劑，對環境產生不良影響的危險較 少。另外，在培養大腸桿菌時，也不需要向培養基中添加5-氨基酮戊酸等四吡咯化合物的 前體，并且只需回收分泌到培養基中的四吡咯化合物，不需要從菌體中提取。即，根據本發 明培養大腸桿菌或回收四吡咯化合物由于不需要特定的化合物或裝置，可以簡便地制備四 吡咯化合物。這樣獲得的四吡咯化合物可以在醫療、食品及電子學等各種產業領域使用。
[0039] 在本實施方式中，向貧營養培養基中添加含有在所述培養基中作為離子的金屬元 素或作為離子而解離的金屬元素的化合物，由此得到含該金屬的四吡咯化合物或絡合物。 作為金屬，只要在培養基中成為離子的金屬即可。而所述含金屬的化合物需可溶于酸性、堿 性或中性水溶液。作為上述金屬元素可舉例選自金（Au)、銅（Cu)、鉀（K)、錳（Μη)、鋅（Zn) 及釕（Ru)中的至少1種金屬。此外，金屬可以以無機金屬化合物或有機金屬化合物的狀態 添加。作為無機金屬化合物，可舉例上述金屬的硫酸鹽、碳酸鹽、硝酸鹽、硫代硫酸鹽、氧化 物、氮化物或鹵化物。而作為有機金屬化合物，可舉例金硫蘋果酸鈉及蘋果酸鋅等。
[0040] 由上所述，通過向貧營養培養基中添加含有在所述培養基中的作為離子的金屬元 素或作為離子而解離的金屬元素的化合物，可得到色調與金屬種類相對應的四吡咯化合物 或絡合物。即，在培養基中培養大腸桿菌，則被攝入大腸桿菌細胞內的金屬元素或金屬化合 物，通過大腸桿菌基因的作用，被轉化成帶有各種金屬所賦予的色調的化合物。之后，所述 化合物在細胞中作為產物被吐出，通過從培養基中回收就可得到作為染料有用的化合物。 為了得到所需色調的化合物，選擇與該色調對應的金屬即可，不必像化學合成法那樣，為每 種目標化合物開發新的方法。此外，得到的化合物除可在光催化劑、電池等領域以外，還可 在光記憶介質、信息記憶介質、電子傳遞介質、半導體元件及電極等領域適用。
[0041] 此外，本發明并不限于上述實施方式，可以在不脫離本發明宗旨的范圍內實施各 種變形。
[0042] 以下說明本發明的實施例。 實施例
[0043] 實施例I :
[0044] 將插入了基因 ypjD(b2611)的轉座子的突變株（National BioResource JD23504) 在2mL LB培養基（細菌用胰蛋白胨：1%、細菌用酵母提取物：0· 5%，NaCl :0.5%)中于 37°C的溫度預培養12小時。得到的細胞懸濁液取ImL接種到水溶液（9g KH2P04、21g Κ2ΗΡ04、 2g(NH4)2S0 4、Ig檸檬酸二水合物、3. 6g葡萄糖及IOOmg MgSO4溶解于IL去離子水中制得） 中，于37°C的溫度下培養24小時。
[0045] 經過24小時的培養，培養液的顏色由開始培養時的無色轉為粉紅色。該培養液離 心分離后使細胞沉淀，得到的上清液用孔徑〇. 22 μ m的濾膜過濾。接著使濾液通過填充陰 離子交換樹脂的柱后，將樹脂吸附的培養物用20%乙腈-0. 1%三氟醋酸溶液洗脫，對洗脫 物進行冷凍干燥。由此，就可得到帶有粉紅色的產物。
[0046] 對該產物進行下述各儀器分析，可以證實是具有圖1所示結構的四吡咯化合物。 圖1中的標記A?G與圖4所示 13C NMR譜的標記對應，其他圖中也一樣。接著，對產物進 行NMR分析，證實含有四吡咯化合物。之后，用ICP(電感耦合等離子體）質量分析檢測出 了鉀（K)，因此回收到鉀與離子結合或形成絡合物的化合物。接著進一步對其進行吸光度分 析，如圖2所示，可以證實是含索雷帶的卟啉所特有的雙吸收峰。圖2中在波長395nm及波 長549nm處分別有峰。由此證實，產物為游離電子可傳遞的有機染料。
[0047] 上述得到的四吡咯化合物溶于不同溶劑中（樣品1及2)、進行二維NMR測定 (COSY、NOESY、HSQC、HMBC)，解析譜，進行結構解吸。
[0048] 對于樣品1，將樣品用⑶30D溶解，按以下條件進行NMR測定。
[0049] ?裝置：IN0VA500 型（varian 公司制）
[0050] ?共振頻率：4". 8MHz (1H)
[0051] ?基準：3. Slppm(CD2HC)DjH NMR)
[0052] 49. 42 Ippm (CD3OD、13C NMR)
[0053] ?累計次數：? NMR(16 次）、13C 匪1?(53428)、〇)5￥(16次）4(^5￥(8次）、邯0(：(32 次）、HMBC(128 次）
[0054] ?其他：NOESY的混合時間設定為400毫秒。
[0055] 其次，對于樣品2,將樣品用溶劑CD3CN : D2O : CD3COOD = 90 : 10 : 0. 1溶解， 按以下條件進行NMR測定。
[0056] ?裝置：IN0VA600 型（varian 公司制）
[0057] ?共振頻率：599. 8MHz (1H)
[0058] ?基準：I. 92ppm(CD2HCNjH NMR)
[0059] I. 28ppm(CD3CN、13C NMR)
[0060] ?累計次數：? NMR(64次）、13C NMR(50000)、C0SY(16次）、N0ESY(16次）、HSQC(32 次）、HMBC(128 次）
[0061] ?其他：NOESY的混合時間設定為400毫秒。
[0062] 關于樣品1的結構解析：
[0063] 圖 3 示1H NMR 譜（溶劑：CD30D)。結果為，在 10. 0 ?10. 5ppm 附近（d)、4. 3ppm 附 近（f)、3. 6ppm附近（g)及3. 2ppm附近（e)觀測到推測為源于目的成分的信號。各信號強 度比約為I : 2 : 3 : 2。這里的d?g在其他圖中也是相同的。
[0064] 圖4示13C NMR譜。由B、C的信號推定為芳香族化合物。
[0065] 該圖中，從化學位移值來看，1H NMR的d信號為通常不可見的特征信號，且考慮到 是芳香族化合物，則嚇啉骨架作為候選被考慮到。如下所述，將二維NMR譜（圖5?9)解 析為卟啉并不矛盾。另外，在J.org. Chem. Vol. 164, No. 21，1999(7973-7982)中記載了與圖 1的推定結構類似的化合物，其1H NMR化學位移值顯示相當好的一致性，因此推斷為卟啉結 構是合理的。
[0066] 以下說明二維NMR解析。
[0067] 圖5示HSQC譜。HSQC譜是檢測J1ai的測定法。解析結果如圖所示。關于質子信 號，進行直接結合的碳的編號的大寫字母編號。
[0068] 圖6示COSY譜。COSY譜是檢測1H-1H間自旋結合的測定法。由解析結果可知f和 e自旋結合，從信號強度比及F與E的化學位移值來看，是-CH2-CH2-X的可能性極高。其中， X為結構不明的未確定成分。
[0069] 圖7示HMBC譜。HMBC譜是檢測JnaiOi=約2?4)的測定法，可以得到異核遠隔 結合相關譜。解析該譜的結果，得到（e，A)、（e，B)、（e，F)、（g，B)、（g，C)、（f，A)、（f，B)、 (f，C)、（f，E)等的相關。這些相關與圖I所示推定結構不矛盾。
[0070] 圖8及圖9示NOESY譜。NOESY譜是檢測磁化交換的測定法，從由交叉馳豫引起的 磁化傳遞可以得到有關核自旋間距離的信息。解析該譜得到的結果，在（g，e)、（f，g)、（f， e)、（d，f)、（d，e)、（d，g)觀測到NOE相關。這些NOE相關支持圖I所示的推定結構。
[0071] 關于樣品2的結構分析：
[0072] 圖 10 示1H NMR 譜，圖 11 示 13C NMR 譜（溶劑：CD3CN : D2O : CD3COOD = 90 : 10 : 0.1)。圖10中方框圍起來的信號為雜質。與上述樣品1的譜進行比較的結果， 推測主成分結構相同。這也可從COSY、NOESY、HSQC及HMBC各譜的分析結果得到支持。
[0073] 圖12為樣品2的NOESY譜的放大圖。觀測到d質子分離成4種，按磁場由小到大 的順序（從數字小的一方開始）進行編號：dl?d4。其NOE相關匯總如下。
[0074] · dl 及 d4 與甲基和-CH2-CH2-X 有 NOE 相關。
[0075] · d2 與僅-CH2-CH2-X 有 NOE 相關。
[0076] · d3與僅甲基有NOE相關
[0077] 這里沒有明確觀測到甲基間或-CH2-CH2-X間的NOE相關，由此得到了圖1側鏈的 配置。
[0078] 對于13C信號及1H信號的編號而言，將在幾乎相同的區域中觀測到的信號統一進 行編號。這是由于卟啉骨架是重復結構，從而詳細歸屬困難。至于重復的個數而言，由于觀 測到的甲基（g)有4個，因此推斷為4。
[0079] 綜上所述，由樣品1及2的分析結果能夠得到圖1的結構。只是作為側鏈的甲基 及-CH 2-CH2-X各共4個即可，附加位置只要是圖1所示8個位置中的任一個就不與數據矛 盾，因此不限于圖1所示的附加位置。
[0080] 以下，對于-CH2-CH2-X中相當于X的部分進行探討。
[0081] 對上述得到的產物進行以下分析。
[0082] (1)由熱分解GC/MS的定性分析
[0083] 為了去除TFA，將樣品于加熱爐內280°C加熱IOmin后在600°C進行熱分解，將分解 產物用下述氣相色譜/質量分析裝置（以下簡稱"GC/MS"）進行分離分析。
[0084]

【權利要求】
1. 四吡咯化合物的制備方法，其特征在于， ?在培養基中培養大腸桿菌，所述大腸桿菌的基因ypjD(b2611)由于突變而無法表 達；及 ?從所述培養基得到具有卟啉環結構的四吡咯化合物。
2. 權利要求1的四吡咯化合物的制備方法，其特征在于， 將化合物作為原料添加到培養基中，所述化合物含有在所述培養基中： 籲作為離子的金屬元素、或 ?作為離子而解離的金屬元素， 由此得到含所述金屬的四吡咯化合物。
3. 權利要求1或2的四吡咯化合物的制備方法，其特征在于，所述四吡咯化合物是卟啉 環中含有4個甲基、4個乙酯或乙酸基（丙酸基）的化合物。
4. 四吡咯化合物的制備方法，其特征在于， ?在培養基中培養大腸桿菌，所述大腸桿菌的基因ypjD(b2611)由于突變而無法表 達，所述培養基中作為原料添加有化合物，所述化合物含有在培養基中： 作為離子的Mn、或 作為離子而解離的Mn ;及 ?從所述培養基得到具有以Mn為中心配位的卟啉環結構的四吡咯化合物。
5. 權利要求3的四吡咯化合物，其具有式：[C36H3608N4 ? Mn(III)]+。
【文檔編號】C12P17/10GK104372047SQ201410616365
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2008年12月1日 優先權日:2007年11月30日
【發明者】石橋徹 申請人:福留裕文