一種用于轉基因馬鈴薯檢測的陽性標準質粒的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種可作為檢測轉基因馬鈴薯的陽性標準質粒，是含有SEQIDNO:1～SEQIDNO:3分別所示的核苷酸片段，以及SEQIDNO:4所示的核苷酸片段，由以下方式獲得：將SEQIDNo.1所示的抗馬鈴薯甲蟲 cry3A 基因、SEQIDNo.2所示的胭脂堿合成酶啟動子（ P-nos ）基因、SEQIDNo.3所示的抗馬鈴薯Y病毒 PVYCP 基因、SEQIDNo.4所示的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 UGPase 基因通過PCR技術疊加重組而成，命名為pBJGMM003。該陽性標準質粒用于轉基因馬鈴薯的鑒定、檢測與監管工作，解決了轉基因馬鈴薯的陽性標準品匱乏等問題，保障了我國轉基因馬鈴薯的相關工作的順利進行。檢測范圍涵蓋所有已批準轉化體及部分在研轉基因馬鈴薯。
【專利說明】-種用于轉基因馬鈴薯檢測的陽性標準質粒
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種轉基因馬鈴薯定性檢測用標準質粒，具體涉及一種可檢測轉基因 馬鈴薯的陽性標準質粒。
【背景技術】
[0002] 轉基因標準物質嚴重缺乏
[0003]隨著轉基因作物及相關產品在全世界范圍內的迅速發展，其環境安全和食用安全 問題一直受到各國政府和廣大消費者及相關檢測機構人員的重視。對轉基因作物核酸進行 監測、檢測，并保證結果的準確、可靠和有效性，需要陽性標準物質的支撐。在保證轉基因檢 測結果的可比性、溯源性，推進轉基因產品檢測方法標準化等方面，轉基因生物標準物質發 揮著十分重要的作用。
[0004] 目前國外研制的轉基因陽性標準物質的組織或企業主要是歐洲標準物質研究院 (IRMM)和美國的油料化學學會（A0CS)。研制的種類主要包括轉基因玉米、大豆、馬鈴薯、油 菜、棉花、甜菜等50余種。但這與190多種轉基因作物種類相比，還遠遠不夠。我國目前已 獲的計量認證的轉基因檢測用標準物質不到10種，質粒陽性標準區區2種。因此，轉基因 陽性標準物質的研制和應用成為國內外農業轉基因生物安全管理體系建設的當務之急，也 是轉基因檢測監測的重要技術支撐之一。轉基因標準物質的缺乏已成為制約轉基因植物檢 測技術發展和檢測機構建設的瓶頸問題之一。
[0005]轉基因馬鈴薯問題廣受關注
[0006]近幾年，部分媒體及網絡傳言，"美國的土豆削皮、切絲后變黑，可是中國已經沒有 這樣的土豆了。無論在云南還是北京買，土豆削皮切絲永遠不會變色。基本上可以肯定，全 中國城市出售的土豆都是轉基因。"雖然，長期研究馬鈴薯種植技術的專家明確表示，中國 沒有轉基因馬鈴薯，我國也從未批準進口轉基因馬鈴薯，但長期以來，國內民眾一直對轉基 因食品心存戒備，甚至到了〃談轉基因色變〃的地步。
[0007]目前，全球共批準商業化種植的轉基因馬鈴薯31種，即將獲批的轉基因馬鈴薯2 種，詳見表1。國際上對轉基因成分的檢測主要是采用以核酸為基礎的檢測方法。關于轉基 因馬鈴薯，我國目前尚無用于檢測的陽性標準物質，因而一定程度上阻礙了我國轉基因馬 鈴薯的檢測工作進行。
[0008]轉基因作物雖然多，但是絕大多數為跨國公司掌握的材料，國內檢測機構很難取 得，這就給檢測帶來了困難。陽性標準質粒的擇優采用檢測靶標基因片段，構建于質粒框 架，用于轉基因檢測，解決了材料缺乏的問題。陽性標準質粒近幾年已開始用于核酸檢測領 域，且具有易于富集，快捷高效等優點。如《耐除草劑轉基因大豆質粒標準分子》（中國農業 大學學報，2014)、《DAS-59122-7玉米的鑒定以及結合質粒標準品的品系特異性定量檢測》 (農業生物技術學報，2013)、《轉crylAb基因棉花質粒標準分子的構建與分析》（中國生物 防治學報，2013)、《轉基因大豆M0N89788質粒分子》（中國專利，專利號201010106138)等 等。
[0009] 本發明針對轉基因馬鈴薯檢測中因缺乏標準物質而產生的瓶頸問題，經過科學的 調研、選擇及克隆等步驟，發明了用于轉基因馬鈴薯檢測的陽性標準質粒，能篩選檢測現行 批準的所有轉基因馬鈴薯（31)種，和即將獲批的轉基因馬鈴薯2種。此陽性標準質粒檢測 范圍廣，兼備性能穩定、易于制備、成本低等優點。
[0010] 表1國際上轉基因馬鈴薯信息匯總表
[0011]
【權利要求】
1. 一種作為檢測轉基因馬鈴薯的陽性標準質粒，其特征是含有SEQ ID NO: 1?SEQ ID N0:4分別所示的核苷酸片段。
2. 權利要求1所述的陽性標準質粒，其特征是含有SEQ ID NO: 1?SEQ ID N0:4共4 個核苷酸片段按任意連接順序組成的核酸片段。
3. 權利要求2所述的陽性標準質粒，其特征是所組成的核酸片段如SEQ ID N0:5所示。
4. 權利要求1?3任一所述的陽性標準質粒的構建方法，其特征是由下列4個引物對 分別對抗馬鈴薯甲蟲基因、胭脂堿合成酶啟動子、抗馬鈴薯Y病毒、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷 酸化酶進行特異性擴增，并將擴增子進行融合得到陽性標準質粒： 引物對 1 :SEQ ID N0:6 和 SEQ ID N0:7 ; 引物對 2 :SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9 ; 引物對 3 :SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 11 ; 引物對 4 :SEQ ID NO: 12 和 SEQ ID NO: 13。
5. 權利要求1?3任一所述的陽性標準質粒在轉基因馬鈴薯定性篩選、監測中的應用。
6. 權利要求5所述的應用，所述應用是作為轉基因馬鈴薯檢測用的陽性參考品、標準 物質。
【文檔編號】C12N15/63GK104328188SQ201410616278
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月5日 優先權日:2014年11月5日
【發明者】金蕪軍, 李亮, 宛煜嵩, 董美, 柳方方 申請人:中國農業科學院生物技術研究所