水稻生殖器官特異表達啟動子sta2及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種水稻生殖器官特異表達啟動子STA2及其應用。本發明的水稻生殖器官特異表達啟動子STA2能夠調控基因在植株中的雄蕊部位集中表達，而在其他部位基本不表達，在實際應用中具有很強的應用價值。通過該啟動子對農作物品種進行基因改造，例如，用該啟動子與雄性不育基因相結合，構建在重組表達載體中，能夠培育出雄性不育的水稻品種，而這種水稻品種所引入的雄性不育基因僅在雄蕊中表達，而不會在其他部位有任何表達，針對性強，而且可以降低生物代謝成本，更容易保證轉基因品種的穩定。
【專利說明】水稻生殖器官特異表達啟動子STA2及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種從植物中分離的啟動子，尤其涉及植物組織或器官特異性表達啟 動子的分離及其應用領域。
【背景技術】
[0002] 高等植物的生長發育是不同基因在時間和空間上有序表達和協同作用的過程。啟 動子作為轉錄水平上一個重要的調控元件，通過和眾多轉錄因子的結合進而決定了基因的 表達模式和表達強度。用組織特異表達啟動子來驅動目的基因表達可有效地避免用組成型 啟動子所帶來的一些諸如代謝負擔之類的負面效應。因此，如何讓外源基因在植物體內定 向、高效、穩定的表達是植物基因工程研究的出發點和落腳點，深入研究啟動子的結構、功 能、作用模式等對于回答分子生物學中的一些基本理論問題具有重要意義。
[0003] 由于植物的果實和種子是人類食物的主要來源，它們都是植物生殖器官發育的產 物，而植物生殖發育的關鍵是花的形成，因此，對植物生殖器官尤其花的發育分子遺傳的研 究顯得尤為重要。高等植物發育形成花器官的過程需要許多基因的協同表達，同時還涉及 到一系列生化變化和組織器官的分化，在基因工程中有望可以利用生殖器官特異啟動子即 花器官特異啟動子創造雄性不育系。Gomez等從豌豆中分離得到一個花藥特異表達基因 ENDl的啟動子，將其融合GUS基因后轉化到番茄、煙草和擬南芥中，分別驗證轉基因材料， 發現ENDl啟動子可以在這幾種植物中維持花藥特異表達的模式（Gomez et al.，2004)。研 究人員對來源于百合的LGCl基因啟動子進行了克隆，經驗證發現該啟動子在雄配子細胞 中特異表達，在研究花藥發生和受精作用中將會是一個有用的工具（Singh et al.，2003)。 水稻是我國乃至世界的主要糧食作物。
[0004] 水稻是非常重要的糧食作物之一，亦是功能基因組學研究的模式植物。本研究的 目的就是從水稻中分離克隆生殖器官特異表達啟動子，為轉基因水稻育種服務，為長遠的 啟動子改造和設計儲備資源。水稻作為模式單子葉植物，是單子葉植物生殖器官發育研究 的主要對象。盡管目前水稻等單子葉植物中均已經分離了多個決定花器官分化與發育的 MADS-box基因和非MADS-box基因，但與雙子葉植物相比，目前水稻等單子葉植物生殖器官 即花發育分子遺傳基礎研究相對落后。因此，開展水稻等單子葉植物生殖器官特異表達啟 動子的遺傳研究十分必要。
[0005] 但是，目前人們對于生殖器官特異表達啟動子的研究還不夠深入，目前所開發出 的生殖器官特異表達啟動子種類非常有限，遠遠不能夠滿足科研人員在改良水稻品種過程 中對啟動子的需求。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種水稻生殖器官特異表達啟動子STA2,其特征在于，所述 水稻生殖器官特異表達啟動子STA2包含SEQ ID No: 1所示的DNA序列。
[0007] 優選地，所述水稻生殖器官特異表達啟動子STA2的DNA序列為SEQ ID No: 1所示 的序列。
[0008] 另一方面本發明提供一種水稻生殖器官特異表達啟動子STA2,其特征在于，所述 水稻生殖器官特異表達啟動子STA2的DNA序列與SEQ ID N〇:l所示的DNA序列有至少85% 同源性；
[0009] 或者，所述水稻生殖器官特異表達啟動子STA2為在SEQ ID No: 1所示的DNA序列 中添加、取代、插入或缺失一個或一個以上核苷酸生成的突變體或等位基因或衍生物；
[0010] 或者，所述水稻生殖器官特異表達啟動子STA2具有與SEQ ID No: 1所示的DNA序 列雜交的產物。
[0011] 另一方面本發明提供一種表達盒，其特征在于，所述表達盒包含權利要求1-3中 任意一項所述的水稻生殖器官特異表達啟動子STA2。
[0012] 另一方面本發明提供一種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包含權 利要求1-3中任意一項所述的水稻生殖器官特異表達啟動子STA2,在所述重組表達載體 中，所述水稻生殖器官特異表達啟動子STA2連接于載體中待表達的基因序列的上游.
[0013] 優選地，所述待表達的基因為Gus基因，所述重組表達載體為pCAMBIA1391-STA2， 其中PCAMBIA1391為植物雙元表達載體，或者，所述待表達基因是具有改變水稻生殖器官 的生長特性功能的基因。
[0014] 另一方面本發明提供一種宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含權利要求1-3中 任意一項所述的水稻生殖器官特異表達啟動子STA2、權利要求4所述的表達盒、或根據權 利要求5所述的重組表達載體，其中，所述宿主菌為根癌農桿菌。
[0015] 另一方面本發明提供一種轉化子，其特征在于，所述轉化子包含所述的水稻生殖 器官特異表達啟動子STA2、所述的表達盒、或所述的重組表達載體。
[0016] 另一方面本發明提供一種所述水稻生殖器官特異表達啟動子STA2在培育轉基因 植物中的應用，其特征在于，所述應用包括：將所述的水稻生殖器官特異表達啟動子STA2 連接于載體中待表達的基因序列上游，從而構建重組表達載體；將所述重組表達載體轉化 到植物細胞、組織或器官中進行培育。
[0017] 本文中所提到的術語"植物"是優選為單子葉植物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高 粱或燕麥，最優選為水稻。本發明利用所述啟動子來改良植物性狀、培育植物新品種。
[0018] 序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列為來源于日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)的水稻生殖器官特異表達啟動子，只是本文中定義為STA2或啟動子STA2。
[0019] 優選地，所述宿主菌為根癌農桿菌。
[0020] 優選地，所述轉化子優選為轉基因細胞系、愈傷組織或植株。
[0021] 本發明中所提供的啟動子的DNA序列為（與序列表中SEQ ID No :1中相同）：
[0022] πCTCCAccccrrGTia gtagc acttgtgctcggtcacaatgctaactttccaataatcat TCCATTTACCCTTATATGCATGGACACGCCACGGACAATCTTCCTTCATGCACCTCACTTCATACACATAATTTGTT GACTTGACCACCCTAAACTCTCTCTGCAATGAAACTGCCCAATGCTTCACCGCCTCCTTCATCTCATCCTTATGAGC ATACCTTGCACCCTCAATTACCTCGTTCTCCTTATACTCCCAGGGTACATGATCACCCTCTGATATAACAAGACCAG AGAAGTCCTCATTTGCCCAATCAGTGGCCATTACATCACCTTCCTCATCGGATGATGCGTCGTCCTCCGCTTGCTCA TTATCCGAATCTTCCCTCTCCATTTCATCAACAATTATACCGACTCTCTCCCCCTCATCCGCCATGCCCATGGCCTG CTCCTCCCTTGGTTGATTTTCCTCATTTTGCATCGATGGTCCAACAACATCCCCTGCATTGCTAGGACCCTCCACAT CTTCGGTTTGCATTGAAACATTTGTATCTTTCTCTTGTACCGACACAAATATAACGAGGGGCCATGACCGTTCAAAA GCCATTTCCACATACCGTCTCCAAGCAGCAGTGCTGTCCATCGGCATTAGTTCCCAAAAATAACCTTCTATTGCACG ACTCACTACAACAGATACTGACATTGTGTAGACTTCTTGGTCTATTCTAAATCCTCTCAACAACCAACTATAAATTG ACTGAAATGTTCTCTCCGCAGGCCTATCGATGCCCTTAGATGTCATTACAAAATCTGACAGATCAACACCATCTGGA CCAAATCTAATATTTCCTTCACCGTGAACTATCTGAAATGTGACCTTACTTGACATTGTGCCTGATGAAAACAATAA CTGCGTTAACCTCGCATTTCTGTACTACGCCCTAAGTTACATTCTCTACAATATTGTTCTCTAAATTTCTAAAAGTA GGTTACATTCTCCAGATCAAACTAAACTACATCTTACAATTAACACTACTGTCTATGTCTCAATTCATACTATTATA TTCTATGCTCTGGATCTACACATATGTGCTGTGTGCTACAGATCTGCTAAAATATATGGAACTAAAACTAAAACGCA ACATATGTACTCAAACGTAATATATTAGTACAAATGCAAAAGATGTATGGGAGCATACCTGTGATGAAGTGAGCGAA CCAGCAGGGCTTCGCCGCTCCCCTTCTGCTGCCCTCCCCTCTCTCTCTCTTTCGTTTTTTTGGATTTTTAGTGAATA TAATGAAATTTCACAGGGGAGGGGCTGGGCTTTATAGGGGGGAGGCAAAAATCGCCCTCCCCCAGGGCGGCAAGGGG GCCGCCTGCAAAATTCCATGCCCCCTCGCCGCCCATTTGCAGGCGGCCCCCCGCACAGTACAAAATCGCCCTCGCGG AGGGCGGCAAGGGGGCCGCCTGCAAAATTCCATGCCCCCCCTCGCCGCCCATTTGCAGGCGGCCCCCCGCACAGTAT AAAATCGCCCTCGCGGAGGGCGGCAAGGGGGCCGCCTGCAAATTTCGTTGACGGCCGTCCCCCGAGAGCGAACGGCC GTCTGCCACGTCATTTTCGCCGCCCTCTGGGAGGGCGATTTTTAAAAATCGCCCTCCCAGAGGGCGGTAGGCGACTA TTTCCGTCAATTTTCAAAATGGAAAATTATTTTTGTAAAACTTTTAATAAAAAAAATTATAAATAAAAAAAATTCCT CTCCTCTTCCCCTCCTCCTCCTTCCTTCCCCTTCGTCTCCGATTCGATTCGCATCCCGTCTACTGACCACACACGGC CGGACGGAAGACCCGAACCGTATCGCCTCCACAATCCATCCCCCAGAACCATACCACGCGTTCCCGTTCCCCTCCTA AATACTCGATCAATATCAATCAATCTCCGCCAACTCCCTCGAATCGCTCCTGAATAACTTAGTTTTCTCTTGTTAGA TTAGGGTTTCGAGTCTTTCGACGTCCT GCTTGCTTGCAGGGAGATTCTG
[0023] 需要說明的是：上述啟動子的DNA序列中，序列開頭以斜體并加粗表示的序列 "TTCTCCACCCCTTGTAAGTAGC"為獲得啟動子過程中使用的正向引物的留存序列，共計22bp ; 序列末尾以斜體并加粗表示的序列"GCTTGCTTGCAGGGAGATTCTG"為獲得啟動子過程中使用 的反向引物的留存序列（該留存序列與反向引物的相應序列互補），共計22bp ;該DNA序列 中剩余的部分則為獲自日本晴水稻中的DNA序列。需要強調的是，本文中所提到的啟動子 既可以指上述整個DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列，因為二者均可 以實現本發明的目的。
[0024] 綜上所述，本發明的發明人從日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)中分 離克隆STA2基因上游包括轉錄起始位點在內的2035bp的DNA序列，并將其命名為STA2 (序 列表中的SEQ ID No: 1)。
[0025] 為了利用本發明的啟動子并對啟動子的作用進行驗證，本發明將該序列經酶切后 連接到植物雙元表達載體PCAMBIA1391上，獲得相應的重組質粒（即重組表達載體），利用 該重組質粒轉化根癌農桿菌菌株EHA105,然后用農桿菌介導的方法進行水稻的轉化，得到 轉基因水稻植株。對獲得的轉基因水稻進行GUS表達定量檢測發現，轉基因植株在生殖器 官部位上的Gus基因表達水平提商，從而證明該2035bp的序列具有驅動基因表達的活性， 而且該啟動子驅動的Gus基因在水稻生殖器官部位特異表達。
[0026] 技術效果
[0027] 本發明所克隆的水稻啟動子STA2能夠調控基因在植株中的雄蕊部位集中表達， 而在其他部位基本不表達，在實際應用中具有很強的應用價值。通過該啟動子對農作物品 種進行基因改造，例如，用該啟動子與雄性不育基因相結合，構建在重組表達載體中，能夠 培育出雄性不育的水稻品種，而這種水稻品種所引入的雄性不育基因僅在雄蕊中表達，而 不會在其他部位有任何表達，針對性強，而且可以降低生物成本，更容易保證轉基因品種的 穩定。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028] 以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：
[0029] 圖1為將STA2啟動子構建于pCAMBIA1391載體質粒中的示意圖，其中A為 PCAMBIA1391示意圖，B為pCAMBIA1391-STA2示意圖，其中示出了利用STA2啟動子驅動位 于其下游的GUS基因表達；
[0030] 圖2為對本發明的啟動子進行酶切驗證的結果示意圖。
[0031] 圖3為利用STA2啟動子驅動Gus基因表達的結果示意圖。
[0032] 圖中所示即STA2 : :gUS轉基因水稻植株各部位Gus染色結果，其中a表示根，b 表示莖，c表示葉，d表示葉鞘，e表示花；⑶S染色在轉基因植株的生殖器官部位明顯表達。 (標尺=Icm)。
【具體實施方式】
[0033] 以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅 用于說明本發明，其不以任何方式限制本發明的范圍。
[0034] 在本實施例中，所采用的植物材料品種為日本晴，選取該品種水稻的成熟種子，該 種子在安徽省農科院水稻所生技室中保存。在本實施例中，發明人所選用的大腸桿菌菌株 為XLl-blue ;根瘤農桿菌為EHA105,安徽省農科院水稻所生物技術室保存；植物表達載體 PCAMBIA1391購自澳大利亞CAMBIA公司，這些均為現有材料。
[0035] 此外，所選用試劑包括：次氯酸鈉（NaCIO,有效氯濃度4% )，Tween20購自Sigma 公司。潮霉素 B 購自 Roche 公司；PEASY-Tsimple 和 DNAmarker_Trans2K 購自 Transgen 公 司；限制性內切酶購自NEB公司；KOD高保真聚合酶和定量PCR試劑盒購自大連TaKaRa寶 生物技術有限公司；T4DNA連接酶購自Promega公司；DNA片段回收試劑盒購自TIANGEN公 司；質粒DNA提取采用Axygen質粒小提試劑盒。引物合成和測序由北京六合華大基因科技 股份有限公司完成。
[0036] 下面對本實施例中啟動子的獲得以及使用過程進行詳細描述。實施例中的實驗方 法，如無特殊說明，均為常規方法。實施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明， 均為市售購買產品。
[0037] 1、引物的設計
[0038] 根據NCBI中提供的水稻品種日本晴（Oryza sativa L cv. Nipponbare)全基因組 序列，依據水稻STA2基因的序列設計擴增引物，并根據選用的載體及靶標基因的特點，設 計引物的酶切位點。具體設計的引物為：正向引物（SEQ ID N〇:2)5'端帶Sail，酶切位點 (GTCGAC)，反向引物（SEQ ID No: 3)5'端帶EcoRI，酶切位點（GAATTC)，引物序列如下：
[0039] FP ：GTCGACTTCTCCACCCCTTGTAAGTAGC Sail
[0040] RP ：GAATTCCAGAATCTCCCTGCAAGCAAGC EcoRI
[0041] 由深圳華大基因公司合成。
[0042] 2、啟動子STA2的獲得
[0043] 以水稻品種日本晴DNA為模板，利用正向引物、反向引物擴增啟動子STA2,按常規 PCR體系，采用如下擴增程序：
[0044] 95°C 預變性 5min ;95°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C 延伸 2min30s，35 個從 95°C 預 變性到72°C延伸的循環；最后72°C延伸lOmin。回收PCR擴增的目的片段，目的片段長度 2035bp，將其連接到PGEM-T-Easy載體（購自Promega公司，按載體說明書中的比例混合） 上，按照熱激法轉化大腸桿菌。經過菌落PCR篩選重組子和雙酶切驗證，測序正確的重組 子，提取其質粒用于轉化農桿菌。農桿菌感受態細胞的制備方法如下：
[0045] (1)從-80°C超低溫冰箱取出甘油凍存的農桿菌EHA105菌株，在含10 μ g/mL Rif 的YEP培養基劃線，28 °C培養2?3d至長出單菌落。
[0046] ⑵挑取單菌落接種于IOmL含10 μ g/mL Rif的YEP培養基，28°C，210r/min過夜 培養。
[0047] (3)將菌液全部轉移至250mL含10 μ g/mL Rif的YEP培養基（1L三角瓶）中 于28 °C、210r/min繼續培養4h左右，中間每隔一段時間測量一次OD值，培養0D600至 0· 5_0· 7〇
[0048] (4)將菌液均分于6支50mL (預冷的聚乙烯管）離心管，冰上靜置30min，然后于 4°C、4000r/min 離心 5min。
[0049] (5)棄上清，將離心管倒扣于無菌濾紙上，為除凈剩余菌液。
[0050] (6)加入3mL預冷的IOOmM CaC12重懸菌體（可用移液槍輕輕吹打重懸）。
[0051] (7)將重懸菌液集中于2支離心管，配平，4°C 4000r/min，離心5min。
[0052] (8)棄上清，將離心管倒扣于無菌濾紙上，以除凈剩余菌液；
[0053] (9)加入5mL預冷的IOOmM CaC12重懸菌體（可用移液槍輕輕吹打重懸）。
[0054] (10)加入5mL預冷的50 %甘油，混勻。
[0055] (11)冰浴IOmin,每管100 μ 1分裝于無菌Eppendorf管，液氮冷凍后，存于超低溫 冰箱，備用（槍頭和Eppendorf管需4°C預冷）。
[0056] 質粒提取方法如下：
[0057] 用AXYGEN質粒DNA小量試劑盒提取相應的質粒，具體操作方法如下：第一次使用 時，將試劑盒攜帶的RNaseA全部加入到Buffer Sl中，混勻，4°C|C存。
[0058] (1)取約4mL過夜培養的菌液（菌液過濃時體積應減半或更少），12, OOO X g離心 30s，棄盡上清。
[0059] (2)加250 μ I Buffer Sl懸浮細菌沉淀，懸浮需均勻，不應留有小菌塊。
[0060] (3)加250 μ I Buffer S2,緩慢地上下翻轉4-6次，混合均勻使菌體充分裂解，直 至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過5min。
[0061] (4)加350μ1 Buffer S3,溫和并充分地上下翻轉混合6-8次，12, OOOXg離心 IOmin0
[0062] (5)吸取步驟4中的上清并轉移到吸附柱（置于2mL離心管中），室溫靜止2min， 12, OOOXg離心lmin，棄濾液。
[0063] (6)將吸附柱放回離心管，加500 μ I Buffer Wl，12, OOOXg離心30s，棄濾液。
[0064] (7)將吸附柱放回離心管，加700 μ I Buffer W2,12, 000 Xg離心30s，棄濾液；以 同樣的方法再用500 μ I Buffer W2洗滌一次。棄濾液。
[0065] (8)將吸附柱置回2mL離心管中，12, 000 Xg離心2min。
[0066] (9)將吸附柱移入新的I. 5mL離心管（試劑盒內提供）中，在吸附柱膜中央加 6(^1去離子水（651：預熱），室溫靜置21^11。12,000\8離心11^11。將洗脫下來的溶液重 新加到吸附膜的中央，復洗一次。
[0067] 提取質粒后再用Sail和EcoRI進行雙酶切驗證，所得結果如圖2所示。將經過鑒 定的陽性克隆送交Invitrogen公司測序。驗證正確的克隆即為所要獲得的啟動子STA2,其 核酸序列如SEQ ID No: 1所示。
[0068] 3、植物表達載體的構建
[0069] 從上面"啟動子STA2的獲得"過程中獲得的陽性克隆中提取質粒，用Sail和EcoRI 雙酶切，回收啟動子STA2片段。同時利用Sail和EcoRI對pCAMBIA1391進行線性化處理、 回收PCAMBIA1391，將上述的STA2片段和pCAMBIA1391片段用T4連接酶（購于TaKaRa公 司）進行連接，得到啟動子STA2與Gus基因融合的植物表達載體pCAMBIA1391-STA2(圖 1B)，利用凍融法將植物表達載體轉入根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens)EHA105， 從凍融法所得產物中提取陽性質粒，用Sail和EcoRI進行酶切驗證，即質粒DNA用限制性 內切酶消化。電泳觀察酶切片段的位置和大小，以判斷所鑒定的質粒是否有外源片段插入 以及插入片段的大小。酶切反應體系為20 μ 1，組分如下：
[0070]
【權利要求】
1. 一種水稻生殖器官特異表達啟動子STA2,其特征在于，所述水稻生殖器官特異表達 啟動子STA2包含SEQ ID No: 1所示的DNA序列。
2. 根據權利要求1所述的水稻生殖器官特異表達啟動子STA2,其特征在于，所述水稻 生殖器官特異表達啟動子STA2的DNA序列為SEQ ID No: 1所示的序列。
3. 根據權利要求1所述的水稻生殖器官特異表達啟動子STA2,其特征在于，所述水稻 生殖器官特異表達啟動子STA2的DNA序列與SEQ ID No: 1所示的DNA序列有至少85%同 源性； 或者，所述水稻生殖器官特異表達啟動子STA2為在SEQ ID N〇:l所示DNA序列的突變 體或等位基因或衍生物； 或者，所述水稻生殖器官特異表達啟動子STA2具有與SEQ ID No: 1所示的DNA序列雜 交的產物。
4. 一種表達盒，其特征在于，所述表達盒包含權利要求1-3中任意一項所述的水稻生 殖器官特異表達啟動子STA2。
5. -種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包含權利要求1-3中任意一項 所述的水稻生殖器官特異表達啟動子STA2,在所述重組表達載體中，所述水稻生殖器官特 異表達啟動子STA2連接于載體中待表達的基因序列的上游.
6. 根據權利要求5所述的重組表達載體，其特征在于，所述待表達基因是具有改變水 稻生殖器官的生長特性功能的基因。
7. -種宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含權利要求1-3中任意一項所述的水稻生 殖器官特異表達啟動子STA2,其中，所述宿主菌為根癌農桿菌。
8. -種轉化子，其特征在于，所述轉化子包含權利要求1-3中任意一項所述的水稻生 殖器官特異表達啟動子STA2、權利要求4所述的表達盒、或根據權利要求5或6所述的重組 表達載體。
9. 一種根據權利要求1-3中任意一項所述的水稻生殖器官特異表達啟動子STA2在培 育轉基因植物中的應用，其特征在于，所述應用包括：將根據權利要求1-3中任意一項所述 的水稻生殖器官特異表達啟動子STA2連接于載體中待表達的基因序列上游，從而構建重 組表達載體；將所述重組表達載體轉化到植物細胞、組織或器官中進行培育。
【文檔編號】C12N1/21GK104404041SQ201410614144
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月4日 優先權日:2014年11月4日
【發明者】秦瑞英, 楊劍波, 李 浩, 馬卉, 李莉, 楊亞春, 魏鵬程, 許蓉芳 申請人:安徽省農業科學院水稻研究所