促進水牛卵母細胞體外成熟的方法
【專利摘要】本發明公開了一種促進水牛卵母細胞體外成熟的方法，在水牛卵母細胞體外成熟培養液中添加一定濃度的EGCG進行成熟培養。研究表明，成熟22～24h后，卵母細胞第一極體排出率為59.31％；成熟卵母細胞經體外受精處理后，囊胚發育率高達24.68％；成熟卵母細胞經孤雌激活處理后，囊胚發育率高達31.69％。可見，水牛體外成熟培養液中添加EGCG有利于卵母細胞體外成熟和成熟后早期胚胎發育，本發明可以顯著提高卵母細胞的體外成熟率和囊胚發育率。因此，應用本發明能顯著促進卵母細胞的成熟，提高卵母細胞成熟率和成熟質量，從而能提高水牛體外胚胎生產效率。
【專利說明】促進水牛卵母細胞體外成熟的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于水牛繁殖【技術領域】，尤其涉及一種促進水牛卵母細胞體外成熟的方法。
【背景技術】
[0002]EGCG(表沒食子兒茶素沒食子酸酯)是綠茶主要的活性和水溶性成分，是茶多酚的主要功能物質，因為具有特殊的立體化學結構，具有非常強的抗氧化性和清除自由基的功能。目前，EGCG在醫學上的應用主要是抗癌防癌。有學者研究證明，EGCG能抑制癌細胞生存需要的信號傳遞，與其他抗氧化劑相互作用降低某些致癌物質的活性，清除有害自由基；有利于維持線粒體膜電位的穩定、保護線粒體基因和功能的完整性，還能夠發揮抗腫瘤、降血脂、抗炎、抗衰老、防輻射等一系列生物活性。細胞的新陳代謝和培養環境中產生一系列活性氧基團(reactive oxygen species, ROS),如 02_、H202 及 Η02_、_0Η 等，它們會造成 DNA和細胞膜損傷，誘導細胞凋亡，使早期胚胎發育停滯。在細胞培養中，EGCG能增強谷胱甘肽、過氧化物酶、過氧化氫酶、酯還原酶、谷胱甘肽-S-轉移酶的活性。在卵母細胞中，谷胱甘肽(GSH)的功能主要是參與抗氧化作用并保護細胞免受活性氧(ROS)的毒性。細胞中GSH的含量通常作為評估卵母細胞成熟質量的重要指標之一。GSH在細胞發育中的主要功能是參與抗活性氧族毒害作用保護卵母細胞。它能促進卵母細胞成熟、受精過程雄原核的產生和早期胚胎發育。現有的研究表明，EGCG促進卵母細胞成熟，以及對早期胚胎發育所起的促進作用，可能與提高卵母細胞內GSH的濃度有關。
[0003]近年來，哺乳動物卵母細胞體外成熟技術取得了巨大進展，形成了一套較成熟的卵母細胞體外成熟技術體系，但與體內成熟相比，仍有許多差距，特別是囊胚率和囊胚質量較低。其可能原因之一就是卵母細胞在體外成熟過程中較體內成熟產生更多的R0S，并且細胞或胚胎離開供體后得不到母體抗氧化劑的保護，過高的ROS破壞細胞培養環境的平衡。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題是提供一種促進水牛卵母細胞體外成熟的方法，以提高卵母細胞的體外成熟率和囊胚發育率。
[0005]為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案:促進水牛卵母細胞體外成熟的方法，在水牛卵母細胞體外成熟培養液中添加EGCG。
[0006]EGCG在成熟培養液中的濃度為10 μ mol/L。
[0007]成熟培養液的組成為TCM199+26.2mmol/L NaHC03+5mmol/L H印es+10%發情牛血清 +3%黃牛卵泡液 +0.5 μ g/mL FSH+5 μ g/mL LH+10 μ mol/L EGCG, pH 為 7.2 ?7.4。
[0008]上述促進水牛卵母細胞體外成熟的方法，包括以下步驟:
[0009](I)卵母細胞的收集
[0010]采集屠宰水牛后的廢棄卵巢,置于含0.024g/L青霉素和0.02g/L鏈霉素的生理鹽水的保溫瓶中，溫度保持在35°C，并于6h內送回實驗室；用手術剪將卵巢周圍的其它組織剪去，生理鹽水洗滌2?3遍，用18號針頭注射器抽取2?8_卵泡的卵母細胞卵泡液復合物，洗卵液中挑選胞質均勻、周圍有3層以上顆粒細胞完全包裹的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)；
[0011]洗卵液的組成為TCM199+5mmol/L NaHC03+20mmol/L !fepes+600mg/L 青霉素和100mg/L鏈霉素；
[0012](2)卵母細胞的成熟
[0013]用預先平衡好的含lOymol/L EGCG的成熟培養液做若干個培養滴，每個滴55 μ L，將收集到的卵母細胞用含10 μ mol/L EGCG的成熟培養液中清洗2?3遍，后置于成熟培養液微滴中，每個滴放20個的卵母細胞,覆蓋礦物油置于培養箱中培養，培養條件為39°C,5% CO2和100%濕度；成熟培養后檢查第一極體排出情況，統計成熟率；
[0014]成熟培養液的組成為TCM199+26.2mmol/L NaHC03+5mmol/L H印es+10%發情牛血清 +3%黃牛卵泡液 +0.5 μ g/mL FSH+5 μ g/mL LH+10 μ mol/L EGCG, pH 為 7.2 ?7.4。
[0015]上述促進水牛卵母細胞體外成熟的方法，還包括以下步驟:
[0016](3)成熟卵母細胞的體外受精
[0017]體外受精所用精液為冷凍精液，38.5°C水浴解凍，上游法收集活力高的精子；卵母細胞成熟22?24h(MII期)后，吹打去除COCs周圍的顆粒細胞，卵母細胞用體外受精液洗滌兩次后置于約40 μ L的受精滴中，每滴約15?20個，每個受精滴注入12 μ L離心處理好的精液，使其濃度達到I?2 X 16個/mL，置于培養箱中進行受精培養；受精后第二天將假定受精卵移入單層顆粒細胞中共培養，隔天更換一半胚胎培養液，受精后48h統計卵裂率，第6?9天統計囊胚率；
[0018]體外受精液的組成為Tyrode’ s 液 +20 μ g/mL Heparin Sodium+2.0mmol/LCaffeine+6.0mg/mL BSA,pH7.5 ?7.8。
[0019]上述促進水牛卵母細胞體外成熟的方法，還包括以下步驟:
[0020](4)成熟卵母細胞的孤雌激活
[0021]采用化學激活法，卵母細胞成熟22?24h (MII期)后，吹打去除COCs周圍的顆粒細胞，卵母細胞用添加了 5 μ mol/L離子酶素的洗卵液中激活5min，后置于6-DMAP培養液中培養6h，6-DMAP培養液為胚胎培養液中添加2mmol/L的6-DMAP ;用胚胎培養液洗滌2?3次，置于單層顆粒微滴中共培養，隔天更換一半胚胎培養液，激活48h后統計卵裂率，第6?9天統計囊胚率。
[0022]上述促進水牛卵母細胞體外成熟的方法，還包括以下步驟:
[0023](5)胚胎培養
[0024]體外受精或孤雌激活后的卵母細胞用胚胎培養液洗滌2?3次后，移入顆粒細胞單層培養液微滴中培養，體外培養時間為8天，共培養24h統計卵裂率，第8d統計囊胚率；
[0025]胚胎培養液的組成為54%體外受精液+36%成熟培養液+10%胎牛血清。
[0026]卵母細胞體外成熟技術是胚胎體外生產技術的關鍵，針對目前水牛卵母細胞體外成熟培養囊胚率和囊胚質量較低的問題，發明人建立了一種促進水牛卵母細胞體外成熟的方法，在水牛卵母細胞體外成熟培養液中添加一定濃度的EGCG(表沒食子兒茶素沒食子酸酯)進行成熟培養。研究表明，成熟22?24h后，卵母細胞第一極體排出率為59.31 %;成熟卵母細胞經體外受精處理后，囊胚發育率高達24.68% ;成熟卵母細胞經孤雌激活處理后，囊胚發育率高達31.69%。可見，水牛體外成熟培養液中添加EGCG有利于卵母細胞體外成熟和成熟后早期胚胎發育，本發明可以顯著提高卵母細胞的體外成熟率和囊胚發育率。因此，應用本發明能顯著促進卵母細胞的成熟，提高卵母細胞成熟率和成熟質量，從而能提高水牛體外胚胎生產效率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1是應用本發明水牛卵母細胞成熟22h后卵丘擴展樣圖。
[0028]圖2是應用本發明水牛卵母細胞成熟22h后排出第一極體樣圖。
[0029]圖3是應用本發明水牛孤雌激活48h后卵裂樣圖。
[0030]圖4是應用本發明水牛體外受精后胚胎發育樣圖。
【具體實施方式】
[0031]實施例促進水牛卵母細胞體外成熟的方法
[0032](I)卵母細胞的收集
[0033]采集當地屠宰場屠宰水牛后的廢棄卵巢，置于含有雙抗(0.024g/L青霉素和
0.02g/L鏈霉素)的生理鹽水的保溫瓶中，溫度保持在35°C左右，并于6h內送回實驗室；用手術剪將卵巢周圍的其它組織剪去，然后用35°C左右含有雙抗的生理鹽水洗滌2?3遍，備用；用18號針頭注射器抽取2?8mm卵泡的卵母細胞卵泡液復合物，洗卵液中挑選胞質均勻、周圍有3層以上顆粒細胞完全包裹的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)；
[0034]其中，洗卵液的組成為TCM199+5mmol/L NaHC03+20mmol/L !fepes+600mg/L 青霉素和100mg/L鏈霉素，pH為7.2?7.4。
[0035](2)卵母細胞的成熟
[0036]用預先平衡好的含lOymol/L EGCG的成熟培養液做若干個培養滴，每個滴55 μ L，將收集到的卵母細胞用含10 μ mol/L EGCG的成熟培養液中清洗2?3遍，后置于成熟培養液微滴中，每個滴放20個左右的卵母細胞，覆蓋礦物油置于培養箱中培養，培養條件為39°C，5% CO2和100%濕度；成熟培養后檢查第一極體排出情況，統計成熟率。
[0037]其中，成熟培養液的組成為TCM199+26.2mmol/L NaHC03+5mmol/L H印es+10%發情牛血清 +3%黃牛卵泡液 +0.5 μ g/mL FSH+5 μ g/mL LH+10 μ mol/L EGCG, pH 為 7.2 ?7.4。
[0038](3)成熟卵母細胞的體外受精
[0039]體外受精所用精液為冷凍精液，38.5°C水浴解凍，上游法收集活力高的精子，用一支15mL的離心管預先平衡2mL受精液，將解凍好的精液注入離心管的底部，于培養箱中45°傾斜放置30min，收集上層lmL，1200 X g離心5min，棄掉上清液；卵母細胞成熟22?24h (Mil期)后，用移液器在成熟滴中輕輕吹打去除COCs周圍的顆粒細胞，將處理好的MII期卵母細胞用體外受精液洗漆兩次后置于約40 μ L的受精滴中，每滴約15?20個,每個受精滴注入12 μ L離心處理好的精液，使其濃度達到I?2 X 16個/mL，置于培養箱中進行受精培養；受精后第二天將假定受精卵移入單層顆粒細胞中共培養，隔天更換一半胚胎培養液，受精后48h統計卵裂率，第6?9天統計囊胚率。
[0040]其中，體外受精液的組成為Tyrode’ s 液+20 μ g/mL Heparin Sodium+2.0mmol/LCaffeine+6.0mg/mL BSA,pH7.5 ?7.8。
[0041]體外受精22?24h后，在受精滴中輕輕吹打假定受精卵，以去除附著的精子。
[0042](4)成熟卵母細胞的孤雌激活
[0043]采用化學激活法，預先平衡好含5 μ mol/L離子酶素的洗卵液、含2mmol/L 6-DMAP的胚胎培養液以及胚胎培養液；用含5 μ mol/L離子酶素的洗卵液在一個培養皿中做若干個100 μ L工作滴，卵母細胞成熟22?24h(MII期)后，用移液器在成熟滴中輕輕吹打去除COCs周圍的顆粒細胞，卵母細胞用添加了 5 μ mol/L離子酶素的洗卵液中激活5min ;再來一個培養皿做若干個2mmol/L的6-DMAP培養滴，每個滴30 μ L，覆蓋礦物油，激活后的卵母細胞用6-DMAP培養液洗滌兩次后移入6-DMAP培養滴中，放入培養箱中培養6h激活培養6h，培養條件為39°C ,5% CO2和100%濕度；用胚胎培養液洗滌2?3次，置于單層顆粒微滴中共培養，隔天更換一半胚胎培養液，激活48h后統計卵裂率，第6?9天統計囊胚率。
[0044](5)胚胎培養
[0045]假定受精卵和激活培養后的卵母細胞均用平衡好的胚胎培養液洗滌2?3次后，移入20 μ L體系的顆粒細胞單層培養液微滴中培養，每滴15?20枚，體外培養時間為8天，培養條件為39°C，5% CO2和100%濕度，隔天更換半量胚胎培養液，共培養24h統計卵裂率，第6?9d統計囊胚率。
[0046]其中，胚胎培養液成分:54%體外受精液+36%成熟培養液+10%胎牛血清。
[0047]上述各步驟中，成熟培養液、體外受精液、胚胎培養液均添加60mg/L青霉素和100mg/L鏈霉素，所有試劑均用孔徑0.22 μ m的微孔濾器過濾，所用器皿均無菌處理。
[0048]結果:如圖1至4，在水牛卵母細胞體外培養體系中，成熟率為59.31%，體外受精后，囊胚率為24.68%，孤雌激活后，囊胚率為31.69%。
[0049]應用例
[0050]2014年6月19日，從當地屠宰場收集卵巢后，于盛裝有生理鹽水的保溫瓶中4h后運到實驗室，到達實驗室時溫度為30°C。按上述實施例的方法收集到200個卵母細胞，于含10 μ mol/L EGCG的成熟培養液中進行培養，6月20日，卵母細胞成熟22h后，用移液器輕輕吹打去除大部分卵丘細胞。排出第一極體的卵母細胞有123個，成熟率為61.50%，對123個排出第一極體的MII期卵母細胞全部進行體外受精。6月21日，將受精22h的假定受精卵經胚胎培養液洗滌兩次后，移入移入20 μ L體系的顆粒細胞單層培養液微滴中培養，隔天更換半量培養液，48h后檢查卵裂情況，共卵裂了 75個，卵裂率為60.98%。6月29日統計囊胚率，囊胚數為30個，囊胚率為24.39%。按此方法重復5次，最后成熟率、成熟卵母細胞經體外受精處理后的囊胚發育率為這5次的平均數。
[0051]2014年7月15日，按實施例的方法收集了 168個卵母細胞置于含10 μ mol/L EGCG的成熟培養液中進行成熟培養，7月16日，體外成熟了 22h后,挑選排出第一極體的101卵母細胞進行孤雌激活，當天下午將激活培養好的卵母細胞移入顆粒細胞單層培養液微滴中培養，隔天更換半量培養液。7月18日統計卵裂率，卵裂細胞數為75個，卵裂率為74.26%。7月25日檢查囊胚發育情況，囊胚數為32個，囊胚率為31.68%。按此方法重復5次，成熟卵母細胞經孤雌激活處理后囊胚發育率為這5次的平均數。
[0052]上述試驗證明，水牛卵母細胞體外成熟培養液中添加lOymol/LEGCG，成熟率約60%，體外受精后，囊胚率約25% ;孤雌激活后，囊胚率約32%。
【權利要求】
1.一種促進水牛卵母細胞體外成熟的方法，其特征在于在水牛卵母細胞體外成熟培養液中添加EGCG。
2.根據權利要求1所述的促進水牛卵母細胞體外成熟的方法，其特征在于:所述EGCG在成熟培養液中的濃度為lOymol/L。
3.根據權利要求2所述的促進水牛卵母細胞體外成熟的方法，其特征在于:所述成熟培養液的組成為TCM199+26.2mmol/L NaHC03+5mmol/L H印es+10%發情牛血清+3%黃牛卵泡液 +0.5 μ g/mL FSH+5 μ g/mL LH+10 μ mol/L EGCG, pH 為 7.2 ?7.4。
4.根據權利要求3所述的促進水牛卵母細胞體外成熟的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)卵母細胞的收集 采集屠宰水牛后的廢棄卵巢，置于含0.024g/L青霉素和0.02g/L鏈霉素的生理鹽水的保溫瓶中，溫度保持在35°C，并于6h內送回實驗室；用手術剪將卵巢周圍的其它組織剪去，生理鹽水洗滌2?3遍，用18號針頭注射器抽取2?8_卵泡的卵母細胞卵泡液復合物，洗卵液中挑選胞質均勻、周圍有3層以上顆粒細胞完全包裹的卵丘-卵母細胞復合體； 所述洗卵液的組成為 TCM199+5mmol/L NaHC03+20mmol/L Hepes+600mg/L 青霉素和100mg/L 鏈霉素，pH 為 7.2 ?7.4 ; (2)卵母細胞的成熟 用預先平衡好的含10 μ mol/L EGCG的成熟培養液做若干個培養滴，每個滴55 μ L，將收集到的卵母細胞用含10 μ mol/L EGCG的成熟培養液中清洗2?3遍，后置于成熟培養液微滴中，每個滴放20個的卵母細胞，覆蓋礦物油置于培養箱中培養，培養條件為39°C，5%CO2和100%濕度；成熟培養后檢查第一極體排出情況，統計成熟率； 所述成熟培養液的組成為TCM199+26.2mmol/L NaHC03+5mmol/L H印es+10%發情牛血清 +3%黃牛卵泡液 +0.5 μ g/mL FSH+5 μ g/mL LH+10 μ mol/L EGCG, pH 為 7.2 ?7.4。
5.根據權利要求4所述的促進水牛卵母細胞體外成熟的方法，其特征在于還包括以下步驟: (3)成熟卵母細胞的體外受精 體外受精所用精液為冷凍精液，38.5°C水浴解凍，上游法收集活力高的精子；卵母細胞成熟22?24h后，吹打去除COCs周圍的顆粒細胞，卵母細胞用體外受精液洗滌兩次后置于約40 μ L的受精滴中，每滴約15?20個，每個受精滴注入12 μ L離心處理好的精液，使其濃度達到I?2 X 16個/mL，置于培養箱中進行受精培養；受精后第二天將假定受精卵移入單層顆粒細胞中共培養，隔天更換一半胚胎培養液，受精后48h統計卵裂率，第6?9天統計囊胚率； 所述體外受精液的組成為 Tyrode’ s 液 +20 μ g/mL Heparin Sodium+2.0mmol/LCaffeine+6.0mg/mL BSA,pH7.5 ?7.8。
6.根據權利要求4所述的促進水牛卵母細胞體外成熟的方法，其特征在于還包括以下步驟: (4)成熟卵母細胞的孤雌激活 采用化學激活法，卵母細胞成熟22?24h后，吹打去除COCs周圍的顆粒細胞，卵母細胞用添加了 5 μ mol/L離子酶素的洗卵液中激活5min，后置于6-DMAP培養液中培養6h，6-DMAP培養液為胚胎培養液中添加2mmol/L的6-DMAP ;用胚胎培養液洗滌2?3次，置于單層顆粒微滴中共培養，隔天更換一半胚胎培養液，激活48h后統計卵裂率，第6?9天統計囊胚率。
7.根據權利要求5或6所述的促進水牛卵母細胞體外成熟的方法，其特征在于還包括以下步驟: (5)胚胎培養 體外受精或孤雌激活后的卵母細胞用胚胎培養液洗滌2?3次后，移入顆粒細胞單層培養液微滴中培養，體外培養時間為8天，共培養24h統計卵裂率，第8d統計囊胚率； 所述胚胎培養液的組成為54%體外受精液+36%成熟培養液+10%胎牛血清。
【文檔編號】C12N5/075GK104312971SQ201410614012
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月4日 優先權日:2014年11月4日
【發明者】張明, 李敏玲, 陳富美 申請人:廣西大學