一株新型黑曲霉和其生產糖化酶的方法【專利摘要】本發明屬于食品領域，公開了一種以黑曲霉(Aspergillusniger)為原始菌株，通過誘變與篩選獲得的產耐熱糖化酶的生產菌株的其制備方法與其產糖化酶方面的應用，并按此方法成功得到產耐熱糖化酶生產菌株黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCCNo.8641，該菌株經發酵產得的糖化酶與原始菌株產得的糖化酶相比，催化底物的最適溫度可提高至少10℃，即可達71℃，同時比酶活最高可達4219U/mL，高于黑曲霉(Aspergillusniger)原始菌種，在很大程度上降低了生產成本，具有一定的創新性，有較強的應用前景與開發意義。CGMCCNo.86412013.12.27【專利說明】一株新型黑曲霉和其生產糖化酶的方法【
技術領域：
】[0001]本發明屬于食品領域,具體涉及一種以黑曲霉(Aspergillusniger)為原始菌株，通過紫外線(UV)和硫酸二乙酯(DES)單獨或協同誘變并經過篩選獲得的產耐高溫糖化酶的生產菌株-黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641,同時還涉及該菌株的制備方法以及利用該菌株生產耐高溫糖化酶方面的應用。該菌株產得的糖化酶與原始菌株產得的糖化酶相比，在比酶活基本不變的情況下，催化底物淀粉的最適溫度可提高至71°C，在很大程度上降低了生產成本，有較強的應用前景。【
背景技術：
】[0002]糖化酶，又稱葡萄糖淀粉酶[Glucoamylase，系統命名為淀粉α-1.4_葡聚糖葡萄糖水解酶，ct-1.4-Glucanglucohydrolase(EC.3.2.1.3)],是一種具有外切活性的酶,它能把淀粉、糊精、糖原等從非還原性末端水解α-1.4-葡萄糖苷鍵，而得到終產物β-D-葡萄糖，也能緩慢水解α-1.6-葡萄糖苷鍵，轉化為葡萄糖，是淀粉轉化為葡萄糖過程中的關鍵酶之一[1_2]。糖化酶具有重要商業價值，凡對淀粉、糊精、低聚糖進行酶水解的工業上，都可適用。糖化酶分布很廣，植物、動物、微生物中都存在，在工業中應用的糖化酶主要從曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)等絲狀真菌和酵母屬(Saccharmyces)中獲得，已報道的產糖化酶真菌微生物有23個屬35個種。但目前工業化生產的酶制劑多來自于曲霉和根霉，這些酶被食品和藥物管理中心(FDA)認定為是安全的[3]。[0003]我國的這種酶制劑市場主要被國外著名酶制劑公司丹麥諾維信和美國杰能科公司的產品占領，導致使用該酶制劑的企業主要依賴進口，不但形成了國外公司技術壟斷的局面，而且由于進口酶制劑價格高導致生產成本大幅度上升。因此，開發具有自主知識產權的、低成本高效能的糖化酶已成為我國玉米深加工產業的當務之急。現階段國內外使用的糖化酶不僅被國際大公司壟斷，從技術角度來講還都存在一定不足，即其耐熱溫度不高，致使其生產過程造成能源巨大浪費。在所有的玉米深加工過程中，其液化工藝中使用的第一步催化溫度為90°C_95°C，進一步糖化過程將利用上步所得淀粉與糖化酶催化反應，得到還原性糖等產物，然而目前糖化酶的催化溫度均在58-60°C，因而需要將第一步進行降溫調節，這種反復的升溫降溫不僅浪費能源、損害設備，而且給生產帶來了諸多難題。生產中糖化一般溫度超過60°C，國產糖化酶活力會急劇下降，造成生產成本的顯著升高，[4_5]。當前在實驗室條件中，黑曲霉產糖化酶的催化活力一般為1000-2500U/mL，產糖化酶最適催化溫度為58-60°C，本專利涉及誘變菌株黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641催化活力最高可達4219U/mL，產糖化酶最適催化溫度為71°C，即在糖化酶催化比活力增高的情況下，使催化最適溫度提高了至少10°C，一旦應用于實際生產，可在很大程度上節約了能源，降低了成本，提聞了生廣效率。[0004]因此，為了盡快開發我國具有自用知識產權的專用酶制劑，推動我國玉米深加工產業的快速發展，擬進行耐高溫糖化酶酶制劑的生產關鍵技術改造及產業化示范具有重大意義。又因為我國北方玉米種植廣泛，因而采用現代高新技術開發化工等系列產品產業化高效生產技術是發展北方地區經濟的可行之路。[0005]本項目采用紫外(UV)誘變和硫酸二乙酯(DES)協同或單獨進行多輪誘變并篩選獲得產耐高溫糖化酶的黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641;采用生物統計優化技術建立以玉米淀粉為主要原料的黑曲霉發酵生產耐高溫糖化酶的生產工藝。降低糖化酶的生產成本，降低玉米精深加工過程中對設備的損害，減少能源浪費，節約成本。本專利成果可以充分利用豐富的玉米資源，促進可再生資源產業的高效、優質、快速發展，能夠滿足玉米深加工生產企業需求，創造良好的經濟效益和社會效益，具有較強的產業化優勢和廣闊的市場發展前景。【
發明內容】[0006]本發明的目的之一是以黑曲霉(Aspergillusniger)為原始菌株,通過紫外線(UV)和硫酸二乙酯(DES)協同或單獨誘變和篩選，獲得產耐高溫糖化酶的生產菌株，獲得的菌株其分類命名為:黑曲霉(Aspergillusniger)UD9，已于2013年12月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏編號為:CGMCC8641,故以下簡稱黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641。[0007]黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641,屬于子囊菌亞門，絲孢目，叢梗孢科，黑曲霉種。黑曲霉壁厚而光滑，頂部形成球形頂囊，其上全面覆蓋一層梗基和一層小梗，小梗上長有成串褐黑色的球狀，直徑2.5?4.0μm。分生孢子頭球狀，直徑700?800μm,褐黑色。蔓延迅速，初為白色，后變成鮮黃色直至黑色厚絨狀，背面無色或中央略帶黃褐色。分生孢子頭褐黑色放射狀，分生孢子梗長短不一。頂囊球形，雙層小梗。是重要的發酵工業菌種。黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641在含淀粉培養基中生長良好，培養基pH4.0?6.5之間，培養溫度28-35°C，最低相對濕度為88%，能引致水分較高的糧食霉變和其他工業器材霉變。其發酵產物之一糖化酶廣泛用于食品化工等行業。[0008]本發明的目的之二是提供一種上述產耐高溫糖化酶的生產菌株CGMCC8641的制備方法；該制備方法通過紫外線(UV)和硫酸二乙酯(DES)協同或單獨誘變和篩選，易于實施、簡潔、高效。又通過黑曲霉液體培養基與黑曲霉種子培養基逐級培養，黑曲霉長勢良好，易于發酵。[0009]本發明的目的之三是提供一種利用本發明獲得的菌株一黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641，以玉米淀粉為碳源發酵生產耐高溫糖化酶的方法。[0010]為了說明上述三項發明方法，本發明采取以下技術方案:[0011]I)原始菌株的培養與孢子懸浮液的制備；[0012]2)菌種誘變與篩選；[0013]3)黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641的培養；[0014]4)菌株發酵；[0015]5)產物純化與濃縮；[0016]6)糖化酶理化性質分析。[0017]對于以上技術方案，具體步驟如下:[0018]步驟I)原始菌株的培養與孢子懸浮液的制備具體步驟為:從原始黑曲霉(Aspergillusniger)斜面培養基上挑取一接種環原始菌株,接種于黑曲霉液體培養基,在28-35°C條件下搖床培養35-60h，反復活化兩次然后向三角瓶中加入玻璃珠，充分振蕩，使孢子脫落并過濾，再將所得全部孢子轉移到黑曲霉液體培養基，使孢子活化萌發，得到孢子濃度為107CFU/mL的孢子懸浮液。將所得孢子轉移到相同液體培養基，在28_35°C條件下搖床培養20-35h。黑曲霉液體培養基的質量配比為:蔗糖3%、硝酸鈉0.2%等，培養基的pH為4.0-6.5,高壓滅菌。[0019]步驟2)菌種誘變與篩選的具體步驟為:原始菌株經上一步處理后，分別采用紫外線(UV)和硫酸二乙酯(DES)單獨誘變或協同誘變方法對原始菌種進行誘變，其中硫酸二乙酯(DES)誘變方法為取孢子懸浮2%的硫代硫酸鈉溶液10-20ul終止反應。用無菌水做梯度稀釋，按不同梯度稀釋菌液，然后涂布培養皿平板，每個梯度各涂布至少10個培養皿平板，然后預熱紫外燈和磁力攪拌器30min，取5-10mL孢子懸浮液放置于直徑9cm的培養皿中，放入滅菌的磁力攪拌珠，打開磁力攪拌器，菌液均勻接受紫外線照射，誘變組分別梯度照射5-60min，之后在紅光下做梯度稀釋，每組分別取不同梯度的菌液涂布培養皿平板，每組每個梯度各涂布至少10個培養皿平板，另外，取原始菌株的菌液做空白對照組，稀釋濃度，涂布方法同誘變組，所有培養皿平板28-35°C避光培養2-4天。每次用DNS法篩選得到發酵產糖化酶催化最適溫度與最適溫度下酶活力同時最高的菌株最為下一輪誘變的出發菌株，再次誘變篩選，反復多輪，直至誘變篩選出酶活力與最適溫度同時最高的-黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641。[0020]步驟3)黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641的培養的具體步驟為:選擇菌落出現較早、菌落直徑較大的誘變菌落挑取于黑曲霉液體培養基中，28-35°C條件下搖床培養35-60h，反復兩次，轉移至黑曲霉種子培養基28-35°C條件下搖床培養35-60h，其中黑曲霉種子培養基質量比:葡萄糖2%，淀粉4%，酵母提取物2%等，調節PH值至4.0-6.5，高壓滅菌。[0021]步驟4)菌株發酵的具體步驟為:取上述種子培養基接種于黑曲霉發酵培養基，28-35°C條件下搖床培養3-7晝夜，過濾、離心取上清，即得粗酶液，其中發酵培養基質量比:玉米淀粉6%，豆柏粉1.8%，玉米糖漿1.8%，硫酸鋅0.18%等，調節PH值至4.0-6.5，聞壓滅菌。[0022]步驟5)產物純化與濃縮的具體步驟為:50%-80%飽和度的硫酸銨對粗酶液進行沉淀，再用PH為4.0-6.5的檸檬酸緩沖液重懸，于截留量為10KD-40KD的透析袋內透析，4°C過夜，次日取出。此鹽析-透析過程反復兩次，用反透析法進行純化后酶液的濃縮。[0023]步驟6)糖化酶理化性質分析的具體步驟為:取粗酶液與純化后酶液分別進行了蛋白含量、酶催化最適溫度及酶活力的測定。其中糖化酶最適溫度的測定:取待測酶液，稀釋合適的倍數。設定50°C-80°C，間隔1°C為溫度梯度。在每一溫度梯度下采用DNS法測定糖化酶的酶活力，選擇酶活力最高的溫度作為最適催化溫度。每個樣做3個平行；蛋白含量的測定:取待測液，稀釋合適的倍數。采用Bradford法測定蛋白含量，用酶標儀在595nm下，測得A595nm,并計算蛋白質含量，每個樣做3個平行；粗酶液酶活力的測定:取5mL2%可溶性淀粉溶液和5mL稀釋酶液，在最適溫度條件下保溫1min后，用一次性滴管吸取I?2滴反應液于比色板上，用0.lmol/L碘液檢測，保證有淀粉殘余，沸水浴中5min終止酶促反應。取冷卻后的反應液ImL于刻度試管(20mL)中，加入ImLDNS顯色劑，沸水浴充分反應8min，取出迅速冷卻后，用蒸餾水定容至1mL刻度線處，搖勻，酶標儀測定540nm處吸光度值。用加熱滅活的酶液做空白，且每個樣做3個平行。[0024]本發明的有益效果描述有以下三點:[0025]一、由于原始菌株一黑曲霉(Aspergillusniger)發酵生產糖化酶過程中會分泌出糖化酶，這種糖化酶的最適催化溫度一般為58-60°C，比酶活一般為1000-4000U/mL在玉米精深加工中會造成巨大的能源浪費和設備損傷。所以，選育產耐高溫糖化酶的菌株是從根本上解決以上問題的方法以黑曲霉(Aspergillusniger)為原始菌株,通過誘變和篩選，獲得產耐高溫糖化酶的生產菌株-黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641:該菌株最適酶活可達71°C，同時比酶活最高可達4219U/mL，極大程度地節約了發酵成本，可廣泛用于食品化工等行業，前景廣闊，市場潛力巨大。[0026]二、提供一種產耐高溫糖化酶的生產菌株CGMCC8641的制備方法；該制備方法通過紫外線(UV)和硫酸二乙酯(DES)協同或單獨誘變和篩選，遺傳穩定性好，易于實施、簡潔、高效。又通過兩輪黑曲霉液體培養基與黑曲霉擴大培養基逐級培養，黑曲霉長勢良好，易于發酵。[0027]三、利用本發明獲得的菌株一黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641,以玉米淀粉為碳源發酵生產耐高溫糖化酶，確定該菌株發酵產糖化酶最適條件，產生穩定的糖化酶，在玉米精深加工方面取得突破性進展。[0028]應用實例1:一級擴大發酵[0029](I)菌種:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641[0030](2)培養基的配制:[0031]液體培養基質量比:[0032]蔗糖3%，硝酸鈉0.2%，磷酸氫二鉀0.1%等，pH=4.7-5.0。[0033]擴大培養基質量比:[0034]葡萄糖2%，淀粉4%，酵母提取物2%等，調節PH值至4.7-5.0。[0035]發酵培養基質量比:[0036]玉米淀粉6%，豆柏粉1.8%，玉米糖漿1.8%，硫酸鋅0.18%等，調節PH值至4.7-5.0。[0037](3)活化培養:挑取誘變菌株-黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641接種于20mL黑曲霉液體培養基，在28°C條件下搖床培養24h，使孢子活化萌發。[0038](4)種子培養:取上述液體培養液按10%接種于200mL種子培養基，28°C條件下搖床培養48h。[0039](5)發酵產糖化酶:取上述種子培養液20mL接種于200mL發酵培養基，28°C條件下搖床培養120h，取發酵液無菌紗布過濾并離心30min，得上清液即為糖化酶粗酶液。[0040](6)發酵后處理:取粗酶液經過80%硫酸銨鹽析沉淀，以PH4.6檸檬酸緩沖液重懸并透析、濃縮得純化后糖化酶液，經DNS法測定糖化酶最適催化溫度為71°C，該溫度下的比酶活為4219U/mL。[0041]應用實例2:二級擴大發酵[0042](I)發酵產糖化酶:取一級發酵液50mL接種于500mL發酵培養基，作為二級發酵液，28°C條件下搖床培養120h，取發酵液無菌紗布過濾并離心30min，得上清液即為糖化酶粗酶液。[0043](2)發酵后處理:取粗酶液經過80%硫酸銨鹽析沉淀，以PH4.6檸檬酸緩沖液重懸并透析、濃縮得純化后糖化酶液，經DNS法測定糖化酶最適催化溫度為71°C，該溫度下的比酶活為3974U/mL。[0044]應用實例3:三級擴大發酵[0045](I)發酵產糖化酶:取二級酵液150mL接種于1500mL發酵培養基，作為三級發酵液，28°C條件下搖床培養120h，取發酵液無菌紗布過濾并離心30min，得上清液即為糖化酶粗酶液。[0046](2)發酵后處理:取粗酶液經過80%硫酸銨鹽析沉淀，以PH4.6檸檬酸緩沖液重懸并透析、濃縮得純化后糖化酶液，經DNS法測定糖化酶最適催化溫度為71°C，該溫度下的比酶活為3277U/mL。[0047]參考文獻[0048][l]NorouzianD,AkbarzadehA,ScharerJM,etal.Fungalglucoamylases[J].B1technolAdv.,2006,24:80-85.[0049][2]CardonaF,GotiA,BrandiA,etal.Moleculardynamicssimulat1nofthecomplexesofglucoamylaseIIfromAspergillusawamorivar.XlOOwithdeoxynojiromycinandlentiginosine[J].JMolModel,1997,3(1):249.[0050][3]PavezziFC,CarneiroAAJ,MartinsDA,etal.1nfluenceofdifferentsubstatesontheproduct1nofamutantthermostableglucoamylaseinsubmergedfermentat1n[J].ApplBicohemB1technol,2011,163:14-24.[0051][4]G1RDANORL,TROVATIJ,SCHMIDELLff.Continuousproduct1nofethanolfromstarchusingglucoamylaseandyeastco-1mmobiIizedinpectingel[J].ApplB1chemB1technol,2008,147(1-3):47-61.[0052][5]李旺軍，方華，謝廣發，等.RSM法優化AspergillusoryzaeA0-01產糖化酶條件的研究[J].食品科學，2007,28(11):322-327.【權利要求】1.一株新型黑曲霉和其生產糖化酶的方法:一種黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641，于2013年12月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641的誘變篩選、制備過程與耐高溫糖化酶的生產這一過程的特征如下:步驟:1)原始菌株的培養與孢子懸浮液的制備；2)菌種誘變與篩選；3)黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641的培養；4)菌株發酵；5)產物純化與濃縮；6)糖化酶理化性質分析。2.根據權利要求所述:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641誘變篩選、制備過程與耐高溫糖化酶的生產過程，其特征在于，步驟I)原始菌株的培養與孢子懸浮液的制備的具體步驟為:挑取原始菌株-黑曲霉(Aspergillusniger)接種于黑曲霉液體培養基，在28-35°C條件下搖床培養35-60h，反復活化兩次，將所得孢子轉移到相同液體培養基，在28-35°C條件下搖床培養20-35h，使孢子活化萌發，其中液體培養基的質量配比為:蔗糖3%、硝酸鈉0.2%等；培養基的pH為4.0-6.5，高壓滅菌。3.根據權利要求所述:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641誘變篩選、制備過程與耐高溫糖化酶的生產過程，其特征在于，步驟2)菌種誘變與篩選的具體步驟為:原始菌株經上一步處理后，分別采用紫外線和硫酸二乙酯單獨誘變或協同誘變方法對原始菌種進行反復誘變，篩選得到產糖化酶催化最適溫度與最適溫度下酶活力同時最高的菌株-黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641。4.根據權利要求所述:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641誘變篩選、制備過程與耐高溫糖化酶的生產過程，其特征在于，步驟3)黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641的培養的具體步驟為:選擇菌落出現較早、菌落直徑較大的誘變菌落挑取于黑曲霉液體培養基中，28-35°C條件下搖床培養35-60h，反復兩次，轉移至黑曲霉種子培養基28_35°C條件下搖床培養35-60h，其中黑曲霉種子培養基質量比:葡萄糖2%，淀粉4%，酵母提取物2%等，調節PH值至4.0-6.5，高壓滅菌。5.根據權利要求所述:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641誘變篩選、制備過程與耐高溫糖化酶的生產過程，其特征在于，步驟4)菌株發酵的具體步驟為:取上述種子培養基接種于黑曲霉發酵培養基，28-35°C條件下搖床培養3-7天，過濾、離心取上清，即得粗酶液，其中發酵培養基質量比:玉米淀粉6%，豆柏粉1.8%，玉米糖漿1.8%，硫酸鋅0.18%等，調節PH值至4.0-6.5，高壓滅菌。6.根據權利要求所述:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641誘變篩選、制備過程與耐高溫糖化酶的生產過程，其特征在于，步驟5)產物純化與濃縮的具體步驟為:50%-80%飽和度的硫酸銨對粗酶液進行沉淀，再用PH為4.0-6.5的檸檬酸緩沖液重懸，透析袋內透析，鹽析-透析過程反復兩次，用反透析法進行酶液的濃縮。7.根據權利要求所述:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641誘變篩選、制備過程與耐高溫糖化酶的生產過程，其特征在于，步驟6)糖化酶理化性質分析的具體步驟為:取粗酶液與純化后酶液分別進行了蛋白含量、酶催化最適溫度及酶活力的測定。【文檔編號】C12N1/14GK104357335SQ201410613332【公開日】2015年2月18日申請日期:2014年10月31日優先權日:2014年10月31日【發明者】胡鑫,李悅,梁冬雪,王玉華,于寒松,郭藝迪申請人:吉林大學