一種檢測擬鹽皮質激素增多癥相關基因突變的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測擬鹽皮質激素增多癥相關基因突變樣品制備試劑盒。具體的涉及一種應用大規模平行測序平臺技術檢測擬鹽皮質激素增多癥相關基因的產品，該試劑盒包括：A.獨特設計并制備捕獲探針，針對基因HSD11B2全部外顯子片段；B.設計獨特帶有標簽序列的接頭；C.通用引物對探針序列進行PCR擴增；D.設計獨特的混合后目的片段的捕獲操作。這個方法和試劑盒制備的大規模平行測序平臺樣品通量大、效率高、操作簡便，極大地降低了測序檢驗成本。
【專利說明】一種檢測擬鹽皮質激素增多癥相關基因突變的試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學診斷和生物技術，涉及一種檢測擬鹽皮質 激素增多癥相關基因突變的體外診斷試劑盒，是一種應用于新一代測序平臺技術的一種擬 鹽皮質激素增多癥相關基因突變的試劑盒。 技術背景
[0002] 擬鹽皮質激素增多癥（Apparent mineralocorticoid excess，ΑΜΕ)AME 患者體內 并不存在鹽皮質激素過多，恰恰相反，這類患者血壓異常升高的原因是糖皮質激素過多，主 要是皮質醇增多所致。
[0003] 人體鹽皮質激素受體和糖皮質激素受體同源性高達94%。體外實驗證明，糖皮質 激素和鹽皮質激素對醛固酮受體具有同樣的親和性。考慮到血中糖皮質激素濃度遠遠高于 鹽皮質激素，因此體內必然存在一種機制以保證鹽皮質激素和其受體特異結合，這種機制 便是 11 β -輕固醇脫氧酶（11 β -hydroxysteroid dehydrogenase，11 β -HSD)對皮質醇的 滅活作用。
[0004] 11 β-HSD有兩種異構體，11 β-HSD I主要存在于肝臟，11 β-HSD II主要存在于腎 臟和胎盤。AME是由于11 β-HSD II缺陷造成的。已報道的11 β-HSD II基因突變多達十 幾種，分別位于第3、4、5外顯子和內含子3。
[0005] HSD11B2基因位于16q22,該基因發生突變可導致11 β -HSD II酶無活性或活性 降低，大量皮質醇不能被轉化成皮質酮，大量蓄積的皮質醇占據遠端腎小管的鹽皮質激 素受體，激活轉錄因子及血清糖皮質類固醇激酶，使泛素連酶Nedd4-2磷酸化，磷酸化的 Nedd4-2不能與ENaC結合進而滅活ENaC，導致ENaC活性升高，鈉重吸收增加，出現類似醛 固酮增高的臨床表現-高血壓和低血鉀，即稱類鹽皮質激素增多癥（AME)。HSD11B2基因突 變不僅導致基因表達降低或對底物的親和力降低，也可導致11 β-HSD II蛋白酶的穩定性 降低，半衰期顯著縮短。
[0006] 擬鹽皮質激素增多癥是一種常染色體隱性遺傳性疾病，可導致高血壓和低血鉀， 糖皮質激素治療有效。該病是由于HSD11B2基因突變所致，該基因可編碼腎2型11 β羥 固醇脫氫酶同工酶。正常情況下，該酶可將血循環中的皮質醇滅活為較低活性的代謝產物 皮質酮，而基因的失活性突變可導致腎皮質醇濃度升高。皮質醇濃度較高時可激活鹽皮 質激素受體，從而產生類醛固酮效應，出現低鉀血癥、高血壓和高鈉血癥等。其他疾病，如 Liddle綜合征，也可表現出擬鹽皮質激素增多癥的相似癥狀，可通過計算尿游離皮質醇/ 尿游離皮質酮比值做出診斷，由于擬鹽皮質激素增多癥患者的皮質酮水平降低，因此該值 較正常人偏高。另外，還可以通過患者對于留鉀類利尿劑的反應對這兩種綜合征做鑒別診 斷，Liddle綜合征的患者只對與上皮鈉離子通道結合的利尿劑有效，而擬鹽皮質激素增多 癥的患者除了該類利尿劑，還可通過鹽皮質激素受體結合劑被糾正。擬鹽皮質激素增多癥 極為罕見，目前世界范圍內報道的病例不超過100例。 (原文： Apparent mineralocorticoid excess syndrome Apparentmineralocorticoidexcess (AME) isan autosomal recessive[1]disorder causing hypertension and hypokalemia(abnormally low levels of potassium). The condition responds to glucocorticoid treatment. It results from mutations in the HSD11B2 gene, which encodes the kidney isozyme of 11β -hydroxysteroid dehydrogenase type 2. In an unaffected individual, this isozyme inactivates circulating cortisol to the less-active metabolite cortisone. The inactivating mutation leads to elevated local concentrations of cortisol in the kidney. Cortisol at high concentrations can cross-react and activate the mineralocorticoid receptor (MR)， leading to aldosterone-like effects in the kidney. This is what causes the hypokalemia, hypertension, and hypernatremia associated with the syndrome. Other conditions such as Liddlei s Syndrome can mimic the clinical features of AMEj so diagnosis can be made by calculating the ratio of free urinary cortisol to free urinary cortisone. Since AME patients create less cortisone, the ratio will much be higher than non-affected patients. [2] Alternatively, one could differentiate between the two syndromes by administering a potassium-sparing diuretic. Patients with Liddlei s Syndrome syndrome will only respond to a diuretic that binds the ENaC channel, whereas those with AME will respond to a diuretic that binds to ENaC or the mineralcorticoid receptor. AME is exceedingly rare, with less than 100 cases recorded worldwide. [2] )
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[0010] 對于擬鹽皮質激素增多癥綜合征的鑒別診斷傳統的方法主要依靠生化檢查和影 像學檢查。這些手段存在很大的缺點：
[0011] 1.檢查種類多；
[0012] 2.靈敏度和特異度低；
[0013] 3.易受藥物和精神狀況等因素的影響；
[0014] 4.檢測時間要求苛刻；
[0015] 基因診斷的優勢在于：
[0016] 1.方便，安全，快捷：僅抽取2-4毫升血；
[0017] 2.任何時間都可以檢查；
[0018] 3.不限制飲食，服藥，任何身體狀況都可以檢測；
[0019] 4.相比反復，多項傳統檢查，更為經濟；
[0020] 5.發病前，疾病極早期診斷的唯一方式；
[0021] 6.源頭確診，一次檢測，終身受益。
[0022] 這一切都揭示了基因診斷在臨床上有巨大的應用前景。
[0023] 近年，大規模 DNA 平行測序平臺（massively parallel DNA sequencing platform)已經發展為主流的測序技術，這項測序技術的出現不僅令DNA測序費用降到了 以前的百分之一，還讓基因組測序這項以前專屬于大型測序中心的"特權"能夠被眾多研 究人員分享。
[0024] 但是直接使用大規模DNA平行測序平臺檢測的成本目前仍然令個人難以承受。本 發明可以同時把多個甚至幾十病人的擬鹽皮質激素增多癥相關基因精確的選擇性捕獲，然 后用于大規模測序平臺，可以極大地降低基因診斷的成本，使之廣泛應用于臨床成為可能。
【發明內容】
[0025] 本發明的目的是，提供一種檢測擬鹽皮質激素增多癥相關基因突變的目標捕獲再 測序的試劑盒。該試劑盒提高了基因捕獲的通量和基因平行測序的通量，操作簡便、成本 低。
[0026] 為實現上述目的，本發明采用捕獲目的HSD11B2基因全部外顯子片段以及鄰近 50bp的非編碼區的探針；用于擴增待測片段的通用引物；測序接頭序列；緩沖液；dNTP ;高 保真聚合酶；鏈霉素磁珠。本發明采用的技術方案是：一種新的目標捕獲再測序方法，包括 以下步驟：
[0027] A.設計并制備用于捕獲擬鹽皮質激素增多癥相關基因突變的探針。并將這些探針 結合在磁珠、薄膜或者玻片上。探針序列見序列表。
[0028] B.將待測基因 DNA樣品分別片段化至200-400bp，然后將末端補平，加入的ATP使 片段兩端引入粘性末端。
[0029] C.分別加入IIlumina公司Nextera? DNA Sample Prep Kit中設計好的一端帶有 標簽序列的接頭序列片段，加入連接酶，使每個片段都與的一對接頭連接，形成新的片段。
[0030] D.調節反應溫度激活DNA聚合酶，用一對Illumina公司Nextera? Index Kit-PCR primers通用引物，對步驟c所得不同基因組完成連接的片段序列混合后進行PCR 擴增反應；
[0031] E.將步驟d所得全部樣品的PCR擴增反應產物與步驟a所設計的捕獲探針雜交， 然后經過多次洗脫純化反應，得到待測片段。
[0032] F.將待測片段通過illumina公司Miseq測序儀的標準方案進行大規模平行測序。
[0033] G.將得到的測序結果同標準數據庫進行比較，得到診斷結果。
[0034] 為實現上述技術方案，步驟A所述的捕獲探針是脫氧核糖核酸（DNA)，或是核糖核 酸（RNA)組成，但不僅限于DNA和RNA。探針為120bp的與目標互補的片段組成。探針可以 是結合在磁珠上的，也可以結合在載玻片上，但不僅限于這些介質。鏈霉素磁珠材質是鋁鎳 鈷系永磁合金或是鋇鐵氧體、釹鐵硼永磁材料、釹鐵硼永磁材料、橡膠磁，但不僅限于這些 材質。
[0035] 其中，步驟A所述的捕獲探針，包括覆蓋基因 HSD11B2全部編碼外顯子片段和兩 端50bp范圍內的序列。這些探針以疊瓦式設計，片段長度為50bp-180bp，最優為75bp ; 片段長度為60bp-200bp，最優為80bp ;片段長度為65bp-220bp，最優為85bp ;片段長度為 70bp-240bp，最優為90bp ;探針之間重疊部分為5-20bp，最優為8bp ;目標區堿基的探針覆 蓋度為IX至IOX，最優為3X。
[0036] 本發明的主要優點在于：
[0037] 1.本發明可以在一次測序反應中同時進行多個不同來源樣本全部擬鹽皮質激素 增多癥相關基因的檢測；全部序列直接測出，準確率可以達到99. 99%。
[0038] 2.本發明的試劑盒可以一次完成1-48個樣品的平行捕獲，提高了捕獲效率，極大 地降低了樣品準備的成本。
[0039] 3.本發明的試劑盒可以一次完成1-1152個樣品的全部擬鹽皮質激素增多癥相關 基因，近4000條序列的平行檢測，充分利用設備的高通量特性，極大降低了每個樣品的測 序成本。
[0040] 4.本發明的試劑盒可以一次反應同時分辨錯義、插入和缺失突變。大大增加了臨 床檢出率和準確性。
[0041] 5.本發明的檢測方法步驟簡單，減少重復操作的環節，因而避免了復雜操作過程 中存在的諸多不確定引物，提高了檢測準確率和穩定性。
[0042] 6.本發明所提供的檢測方法所需時間大大少于sanger法的測序技術.
[0043] 實例：在完成同樣的檢測量（100人份的檢測量），sanger法需要2個人工同時工 作一周。我們的方法只需要一個人在一天內完成全部的檢測量。
[0044] 7.檢測的準確度大大優于基因芯片技術，更符合臨床檢測要求。基因芯片只能檢 測堿基錯義突變，而插入和缺失突變無法同時檢測。我們的方法可以同時檢測錯義、插入、 缺失和可變剪切的基因突變。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0045] 圖示為目標區域序列和探針。
【具體實施方式】
[0046] 下面用實施例僅是對本發明實際應用的舉例描述，本發明的實際應用不僅限于以 下實施例：
[0047] 實施例一、
[0048] 一、探針設計：
[0049] 按表合成鏈霉素標記的探針。探針溶液采用agilent公司的SureSelect緩沖系 統體系。
[0050] 二、基因組提取：
[0051] 采用 Qiagen FlexiGene DNA Kit(Code No :51204)進行提取待測 96 份樣本的基 因組， 〇〇26〇/280 值達到1. 8-2. 0,各取1-3 μ g做為起始模板。
[0052] 三、測序前樣品制備
[0053] 1.目的基因片段化：
[0054] 取定量過的270份基因組DNA，稀釋至20-35ng/ μ L。取130 μ L，用超聲破碎儀分 別進行片段化。
[0055] 2. AMpure XP 片段化選擇
[0056] 1.取96孔板，加入80-100 μ L磁珠后，再加入樣品DNA，移液器反復吹打混勻；
[0057] 2.混合液 26°C 放置 5min ;
[0058] 3.將96孔板靜置在磁板上3min ;
[0059] 4.小心移取全部上清至新的孔中，小心不要碰到磁環；
[0060] 5.再在移至新孔的上清中加入100-150 μ L磁珠，移液器反復吹打，充分混勻；
[0061] 6.混合液 26°C 放置 5min ;
[0062] 7.將96孔板靜置在磁板上3min，小心移去上清；
[0063] 8.加入70%乙醇200 μ L，靜置30s，小心移去上清；
[0064] 9.重復步驟8操作一次；
[0065] 10.將96孔板從磁板上取下，敞口放置，使乙醇充分揮發；
[0066] 11.加入40 μ L IOmM pH = 8. 0 Tris-HCl，移液器反復吹打混勻；
[0067] 12.將96孔板靜置在磁板上Imin，至溶液變清；
[0068] 13.小心移取上清至新的PCR管內，得到純化后的基因組DNA。
[0069] 3.末端平齊和純化
[0070] 1.取96孔板，按下表所示，在冰盒上加入各種試劑，保持冰浴狀態。
[0071]
【權利要求】
1. 一種檢測擬鹽皮質激素增多癥相關基因突變的試劑盒，其包括：捕獲目的HSD11B2 基因全部外顯子片段以及鄰近50bp的非編碼區的探針；用于擴增待測片段的通用引物；測 序接頭序列；緩沖液；dNTP ;高保真聚合酶；鏈霉素磁珠。
2. 根據權利要求1所述"一種檢測擬鹽皮質激素增多癥相關基因突變的試劑盒"，全部 探針在3'采用生物素修飾。
3. 根據權利要求1所述"一種檢測擬鹽皮質激素增多癥相關基因突變的試劑盒"這種 探針是寡聚核糖核酸（RNA)，或寡聚脫氧核糖核酸（DNA)，但是不僅限于RNA和DNA，可以包 括生物素、熒光或者同位素等修飾后的DNA或者RNA。
4. 根據權利要求1所述"一種檢測擬鹽皮質激素增多癥相關基因突變的試劑盒"的探 針是結合在磁珠上的，或結合在載玻片上，但不僅限于這些介質。
5. 根據權利要求1所述"一種檢測擬鹽皮質激素增多癥相關基因突變的試劑盒"的探 針針對目標區域以高密度疊瓦式設計，探針序列與HSD11B2為互補序列。
6. 根據權利要求1所述"一種檢測擬鹽皮質激素增多癥相關基因突變的試劑盒"探針 長度在50-180bp，最優為75bp。
7. 根據權利要求1所述"一種檢測擬鹽皮質激素增多癥相關基因突變的試劑盒"探針 長度在60-200bp，最優為80bp。
8. 根據權利要求1所述"一種檢測擬鹽皮質激素增多癥相關基因突變的試劑盒"探針 長度在65-2200bp，最優為85bp。
9. 根據權利要求1所述"一種檢測擬鹽皮質激素增多癥相關基因突變的試劑盒"探針 長度在70-240bp，最優為90bp。
10. 根據權利要求1所述"一種檢測擬鹽皮質激素增多癥相關基因突變的試劑盒"探針 重疊部分適宜范圍為5bp_20bp，最優為8bp。
11. 根據權利要求1所述"一種檢測擬鹽皮質激素增多癥相關基因突變的試劑盒"鏈 霉素磁珠材質是鋁鎳鈷系永磁合金或是鋇鐵氧體、釹鐵硼永磁材料、釹鐵硼永磁材料、橡膠 磁，但不僅限于這些材質。
【文檔編號】C12Q1/68GK104388552SQ201410613210
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月5日 優先權日:2014年11月5日
【發明者】劉哲 申請人:百世諾（北京）醫療科技有限公司