一種魚類粘孢子蟲的pcr快速檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種魚類粘孢子蟲PCR快速檢測試劑盒及檢測方法。本發(fā)明所述魚類粘孢子蟲的PCR快速檢測試劑盒，包括：緩沖液；上、下游引物；聚合酶；陽性、陰性對照液；ddH2O。本發(fā)明提供一種新型PCR快速檢測試劑盒及檢測方法，分別在PCR管中加入緩沖液，上、下游引物，聚合酶以及模板，混合均勻后，置于PCR擴(kuò)增儀中，進(jìn)行變性、退火、延伸共循環(huán)30次；反應(yīng)結(jié)束后，取10μL產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上，電泳，在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物，與標(biāo)準(zhǔn)分子量相對照，陽性樣品可出現(xiàn)580bp片段。本發(fā)明對魚類粘孢子蟲進(jìn)行臨床診斷切實(shí)可行，且具有快速、準(zhǔn)確、特異的優(yōu)點(diǎn)，滿足臨床診斷的要求，為檢測魚類粘孢子蟲提供便利條件。
【專利說明】-種魚類粘孢子蟲的PCR快速檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)，特別涉及一種魚類粘孢子蟲的檢測試劑及檢測方 法，適用于魚類粘孢子蟲的檢測。
【背景技術(shù)】
[0002] 粘孢子蟲病是由于粘孢子蟲（Myxosporea)引起的一類寄生性病害,近年來已發(fā) 展成危害嚴(yán)重的水產(chǎn)動物病害之一。粘孢子蟲屬粘體動物門（Myxozoa)，迄今國內(nèi)外已報到 2500余種，寄主范圍涉及從無脊椎動物到脊椎動物所有門動物的廣泛宿主，但水產(chǎn)動物，尤 其是魚類是其最主要寄主。國內(nèi)由于對其它宿主的研究缺乏，也往往認(rèn)為其是魚類專屬寄 生蟲。大多數(shù)粘孢子蟲在長期進(jìn)化歷程中與相應(yīng)宿主形成了穩(wěn)定的宿主-寄生蟲相互關(guān) 系，對宿主危害較小，但隨著世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖環(huán)境、模式等的改變，新的養(yǎng) 殖品種的引入等因素，粘孢子蟲已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要限制因子之一。目前， 學(xué)界普遍認(rèn)為一旦粘孢子蟲侵入魚體進(jìn)入孢子發(fā)育期（Sporogony)或發(fā)育成成熟粘孢子 (Myxospore)，由于粘孢子蟲包囊壁的致密結(jié)構(gòu)及粘孢子的堅(jiān)硬幾丁質(zhì)殼等原因，藥物大都 因不可能滲透之原因而效果甚微。為了及早發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖魚類是否被粘孢子蟲感染，有必要建 立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法。
[0003] 傳統(tǒng)寄生蟲的診斷需要進(jìn)行顯微鏡觀察，缺乏進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、敏感的檢測方法。 PCR方法具有操作簡單、特異、快速、敏感等優(yōu)點(diǎn)，正逐步應(yīng)用于病原微生物的檢測與研究 中。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種魚類粘孢子蟲的 特異性PCR檢測方法，能快速、高效地用于粘孢子蟲的檢測。
[0005] -種檢測魚類粘孢子蟲的PCR快速檢測試劑盒：所述試劑盒包括：（1)反應(yīng)混合 緩沖液，包含以下成分：KC1，MgCl 2, pH5. 8的Tris-HCl，dNTP ;(2)檢測引物的設(shè)計(jì)合成： 根據(jù)GenBank中發(fā)布的粘孢子蟲的基因序列，設(shè)計(jì)一對特異性檢測引物，上游引物M-F : 5' -ACCGTGGAAAATCTAGAGCTA-3,下游引物 M-R :5' -GCTACTCTCTTGTCCAACTAC-3' ；（3) Taq 酶； ⑷滅菌的CldH2O ; (5)陽性對照液：粘孢子蟲的基因組DNA ; (6)陰性對照液：ddH20。
[0006] 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，采用試劑盒檢測魚類粘孢子蟲的 方法為：
[0007] (1)粘孢子蟲DNA的提取：取鰓、肌肉或內(nèi)臟組織，加入滅菌處理的雙蒸水，用 玻璃勻漿器充分研磨后，置于-20°C冰箱反復(fù)凍融3次，6000rpm低溫離心，取上清，加入 Tris-飽和酚，充分振蕩混勻后，靜置5分鐘，然后12000rpm離心，取上清液加入等量的酚： 氯仿：異戊醇抽提二次，取上清加入2倍體積的異丙醇，混勻后，靜置，12000rpm離心，去掉 上清后，加入預(yù)冷的75%的乙醇，靜置，12000rpm離心，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后， 用CldH 2O溶解，即為試驗(yàn)用DNA模板，提取的DNA模板置于-70°C保存?zhèn)溆茫?br>
[0008] (2)PCR反應(yīng)體系：采用的PCR反應(yīng)體系，在PCR反應(yīng)管內(nèi)分別加入反應(yīng)混合緩沖 液，上游引物、下游引物，Taq DNA聚合酶，DNA模板，用滅菌超純水，同時分別用陽性對照 液和陰性對照液作為模板，設(shè)置陽性和陰性對照組，混合均勻后離心數(shù)秒，置于PCR反應(yīng)儀 上；
[0009] (4) PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性30秒，55 °C退火30秒，72 °C 延伸30秒，共循環(huán)35次；72°C延伸10分鐘，最后4°C保存；
[0010] (5) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測：PCR反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠） 上，使用TAE緩沖液進(jìn)行電泳，在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物，檢查PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小；
[0011] (6)結(jié)果與判定：在紫外燈下觀察并與標(biāo)準(zhǔn)分子量相對照，若檢測樣品在580bp處 出現(xiàn)明亮的條帶，而陰性對照沒有目的條帶，則為粘孢子蟲陽性；若陽性對照可見目的條 帶，而檢測樣品無目的條帶出現(xiàn)，則為陰性，沒有或不是所要檢測的目的粘孢子蟲。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的粘孢子蟲的特異性PCR快速檢測試劑盒及其檢測 方法具有以下特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)：
[0013] (1)通過最近幾年對魚類寄生蟲病流行病學(xué)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前魚類寄生蟲病害越 來越嚴(yán)重，危害越來越大，尤其是粘孢子蟲，成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要限制因子之 一。本發(fā)明根據(jù)粘孢子蟲的核苷酸序列設(shè)計(jì)出一對特異性引物，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR) 技術(shù)，對魚類粘孢子蟲進(jìn)行定性檢測，經(jīng)檢測并測序驗(yàn)證，可用于魚類粘孢子蟲的快速、高 效地檢測。
[0014] (2)本發(fā)明提供了針對上述PCR優(yōu)化的PCR反應(yīng)液、反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。反應(yīng)時 將反應(yīng)液、酶、引物、模板和適量的水混合，整個反應(yīng)所需要的時間在1.5個小時內(nèi)即可完 成。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 圖1為魚類粘孢子蟲的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中，橫坐標(biāo)中：標(biāo)號1為陰性對照（以陰 性對照液作為模板）；標(biāo)號2為陽性對照（以陽性對照液作為模板）；標(biāo)號3為粘孢子蟲感 染魚類組織樣品；標(biāo)號M為分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 (購自寶生物工程有限公司）；縱坐標(biāo)中：bp 為堿基對，2000、1000、750、500、250、100為對應(yīng)片段的堿基對的數(shù)量。
[0016] 圖2為對不同病原的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中，橫坐標(biāo)中：標(biāo)號1為粘孢子蟲；標(biāo)號2 為嗜水氣單胞菌；標(biāo)號3為維氏氣單胞菌；標(biāo)號4為柱狀黃桿菌；標(biāo)號5為殺鮭氣單胞菌； 標(biāo)號6為溫和氣單胞菌；標(biāo)號7為假單胞菌；標(biāo)號8為草魚出血病病毒；標(biāo)號9為鯽魚皰疫 病毒,標(biāo)號M為分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ;縱坐標(biāo)中：bp為堿基對，2000、1000、750、500、250、100 為對應(yīng)片段的堿基對的數(shù)量。
[0017] 圖3為8尾鯽魚組織樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中，橫坐標(biāo)中：標(biāo)號1為陰性對照 (以陰性對照液作為模板）；標(biāo)號2為陽性對照（以陽性對照液作為模板）；標(biāo)號3-10為 8尾不同鯽魚組織樣品；標(biāo)號M為分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ;縱坐標(biāo)中：bp為堿基對，2000、1000、 750、500、250、100為對應(yīng)片段的堿基對的數(shù)量。
[0018] 圖4為5尾鯽魚組織樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中，橫坐標(biāo)中：標(biāo)號1為陰性對照 (以陰性對照液作為模板）；標(biāo)號2為陽性對照（以陽性對照液作為模板）；標(biāo)號3-7為5尾 不同地區(qū)鯽魚組織樣品；標(biāo)號M為分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ;縱坐標(biāo)中：bp為堿基對，2000、1000、 750、500、250、100為對應(yīng)片段的堿基對的數(shù)量。
[0019] 圖5為2尾草魚組織樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中，橫坐標(biāo)中：標(biāo)號1為陰性對照 (以陰性對照液作為模板）；標(biāo)號2為陽性對照（以陽性對照液作為模板）；標(biāo)號3-4為2尾 不同草魚組織樣品；標(biāo)號M為分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ;縱坐標(biāo)中：bp為堿基對，2000、1000、750、 500、250、100為對應(yīng)片段的堿基對的數(shù)量。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明：
[0021] 實(shí)施例一：魚類粘孢子蟲的PCR快速檢測試劑盒
[0022] 本實(shí)施例所述的魚類粘孢子蟲的PCR快速檢測試劑盒的所有化學(xué)試劑及引物均 從專業(yè)的試劑公司購買。但上述試劑和引物來源不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，本發(fā)明可自 行配制有關(guān)試劑和合成有關(guān)引物。
[0023] 試劑盒由下列部分構(gòu)成（9樣份）：
[0024] (1)2X反應(yīng)混合緩沖液（Reaction Mix Buffer) I. OmL,包含以下成分：
【權(quán)利要求】
1. 一種檢測魚類粘孢子蟲的PCR快速檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： (1) 反應(yīng)混合緩沖液，包含以下成分：KCl，MgCl2, pH5. 8的Tris-HCl，dNTP ; (2) 檢測引物的設(shè)計(jì)合成：根據(jù)GenBank中發(fā)布的粘孢子蟲的基因序列，設(shè)計(jì)一 對特異性檢測引物，上游引物M-F :5' -ACCGTGGAAAATCTAGAGCTA-3'，下游引物M-R : 5' -GCTACTCTCTTGTCCAACTAC-3' ； (3) Taq 酶； ⑷滅菌的CldH2O ; (5) 陽性對照液：粘孢子蟲的基因組DNA ; (6) 陰性對照液：ddH20。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，采用試劑盒檢測魚類粘孢子蟲的方法 為： (1) 粘孢子蟲DNA的提?。喝■w、肌肉或內(nèi)臟組織，加入滅菌處理的雙蒸水，用玻璃勻漿 器充分研磨后，置于-20°C冰箱反復(fù)凍融3次，6000rpm低溫離心，取上清，加入Tris-飽和 酚，充分振蕩混勻后，靜置5分鐘，然后12000rpm離心，取上清液加入等量的酚：氯仿：異戊 醇抽提二次，取上清加入2倍體積的異丙醇，混勻后，靜置，12000rpm離心，去掉上清后，力口 入預(yù)冷的75%的乙醇，靜置，12000rpm離心，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用CldH 2O溶 解，即為試驗(yàn)用DNA模板，提取的DNA模板置于-70°C保存?zhèn)溆茫? (2) PCR反應(yīng)體系：采用的PCR反應(yīng)體系，在PCR反應(yīng)管內(nèi)分別加入反應(yīng)混合緩沖液，上 游引物、下游引物，Taq DNA聚合酶，DNA模板，用滅菌超純水，同時分別用陽性對照液和陰性 對照液作為模板，設(shè)置陽性和陰性對照組，混合均勻后離心數(shù)秒，置于PCR反應(yīng)儀上； (4) PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸 30秒，共循環(huán)35次；72°C延伸10分鐘，最后4°C保存； (5) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測：PCR反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠）上，使 用TAE緩沖液進(jìn)行電泳，在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物，檢查PCR產(chǎn)物的預(yù)期大??； (6) 結(jié)果與判定：在紫外燈下觀察并與標(biāo)準(zhǔn)分子量相對照，若檢測樣品在580bp處出現(xiàn) 明亮的條帶，而陰性對照沒有目的條帶，則為粘孢子蟲陽性；若陽性對照可見目的條帶，而 檢測樣品無目的條帶出現(xiàn)，則為陰性，沒有或不是所要檢測的目的粘孢子蟲。
【文檔編號】C12Q1/04GK104313170SQ201410610204
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月1日
【發(fā)明者】雷燕, 肖洋, 戚瑞榮, 張會軍 申請人:廣州金水動物保健品有限公司