莫能菌素預混劑的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種莫能菌素預混劑的制備方法，具體為將肉桂地鏈霉菌菌種制備后先進行種子搖瓶培養和種子罐培養，當培養至種子齡為20～24h，培養液pH值為6.6～7.1，生物量為10％以上，鏡檢結果顯示菌絲粗壯呈網狀、舒展、染色深、無雜菌時，轉為發酵培養。待殘油量為0.7％以下，生物量在40％以上，菌絲濃度為40～50％，莫能菌素效價不低于40000u/mL時，發酵結束。最后采用一步噴霧干燥法進行莫能菌素的提取，所制得的莫能菌素成品含量為20％以上，顆粒率達75％以上。另外，該方法發酵工藝簡單，能有效提高發酵單位，降低生產成本，同時避免了動物源性氮源以及化學有機溶劑的使用。
【專利說明】莫能菌素預混劑的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于獸藥領域，涉及一種抗生素預混劑的制備方法，具體涉及莫能菌素預混劑的制備方法。
【背景技術】
[0002]莫能菌素(monensin),屬聚醚類抗生素,在1967年首先由Haney等人從肉桂地鏈霉菌(Streptomyces cinnamonensis)的發酵液中分離得到。20世紀70年代作為抗球蟲藥物開始投放市場。美國、日本分別于1974年、1977年正式批準將其作為飼料添加劑，我國于1985年獲批，并應用于生產。目前已有40多個國家用作肉牛、肉羊的增重劑和豬的生長促進劑。莫能菌素對陰性菌無作用，但對葡萄球菌、桿菌、梭菌、鏈球菌、霉菌(青霉菌、念珠菌)有一定的抑制作用。莫能菌素可以影響反芻動物瘤胃內能量代謝，改善瘤胃發酵，提高丙酸與乙酸的產出比例，降低揮發性脂肪酸，減少甲烷生成，提高蛋白質利用效率。因此能夠顯著提高反芻動物的飼料利用率和促進生長的作用。
[0003]隨著畜牧業的進一步發展，近年來莫能預混劑的市場需求量不斷擴大，而國內外客戶對莫能預混劑的質量要求越來越高，而現有的一些制備方法存在下述缺點:提取工藝復雜,化學溶劑消耗量大,從而產生大量的廢溶劑和廢渣,生產成本和環保成本較大；產品顆粒率較低，不利于莫能菌素在飼料中的分散；發酵培養過程中使用了國內外飼料行業中嚴格禁止使用的原料如魚粉等，致使生產擴大化無法實現。有鑒于此，有必要對現有的莫能菌素預混劑的制備方法作進一步的改進。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種莫能菌素預混劑的制備方法，該方法采用一步噴霧干燥，提高了產品顆粒率。
[0005]本發明采用的具體技術方案如下:
[0006]莫能菌素預混劑的制備方法，包括以下步驟:
[0007]a.種子培養
[0008]將經過菌種制備得到的肉桂地鏈霉菌依次進行種子搖瓶培養和種子罐培養；所述種子搖瓶培養的培養條件為以220?260rpm的轉速，在32±0.5°C條件下培養24?27h ；所述種子罐培養的接種量為0.0035%種子液；所述種子罐培養的培養條件為在溫度為32 ± 0.5°C，罐壓為0.02?0.05MPa條件下培養20?24h ；
[0009]所述種子搖瓶培養所需的培養基按質量百分濃度計由以下成分組成:黃豆餅粉I?1.5%，酵母粉0.1?0.3%，葡萄糖0.2?0.5%，糊精1.0?2.0%，碳酸鈣0.05?0.1%,余量為水；培養基滅菌后pH值為6.9?7.1 ;
[0010]所述種子罐培養的培養基按質量百分濃度計由以下成分組成:黃豆餅粉1.0?1.5%，酵母粉0.1?0.25%，葡萄糖L 5?2.5%，碳酸鈣0.1?0.25%，消泡劑0.05?
0.1%,余量為水；培養基滅菌后pH值為6.6?7.1 ;
[0011]b.發酵培養
[0012]將步驟a培養過后的含菌種的培養液轉入發酵罐內進行發酵培養，發酵培養條件為:罐內溫度34土1°C，溶氧量30%以上，罐壓0.03?0.05MPa ;發酵過程中通過添加氨水溶液、植物油和無菌水，以使發酵液PH值維持在6.5?6.6之間，植物油按質量百分濃度計不低于3 %，溶氧量不低于30%，發酵過程結束前24?48小時停止加植物油；當發酵液pH值達6.6?7.0，殘油量為0.7%以下，生物量在40%以上，莫能菌素效價不低于40000U/mL時，發酵結束；
[0013]發酵培養基按質量百分濃度計由以下成分組成:葡萄糖2.0?3.8%，黃豆餅粉
1.8?3.7%，植物油1.9?2.5%，油酸甲酯0.05?1.0%，碳酸鈣0.15?0.35%，硫酸鈉0.15?0.22 %，硝酸鈉0.15?0.22 %，氯化錳0.0I?0.03 %,硫酸亞鐵0.005?0.0I %,抗壞血酸0.001?0.002%，硫酸鋁0.05?0.07%，磷酸氫二鉀0.005?0.01%，消泡劑0.01?0.02%，余量為水；
[0014]c.提取
[0015]發酵結束后，先將發酵液pH值調至10?11，然后再加熱至63 °C并保溫3小時，分別加入無水硅酸鈉和碳酸鈣后，將發酵液PH值調至7?8并放置30分鐘，最后噴霧干燥；所述無水娃酸鈉加入量為發酵液重量的6%,所述碳酸?丐加入量為發酵液重量的O?35%;所述噴霧干燥的條件為:進風溫度140?160°C ;干燥室內溫度65?95°C，排風溫度60?70 °C，干燥器內壓力-280?-380MPa。
[0016]優選的，所述步驟a中所述種子搖瓶培養所需的培養基按質量百分濃度計由以下成分組成:黃豆餅粉1.5%，酵母粉0.2 %，葡萄糖0.4 %，糊精1.0%，碳酸鈣0.06 %，余量為水。
[0017]優選的，所述步驟a中所述種子罐培養的培養基按質量百分濃度計由以下成分組成:黃豆餅粉1.5%，酵母粉0.2%，葡萄糖2%，碳酸鈣0.25%，消泡劑0.1 %，余量為水。
[0018]優選的，所述步驟a中所述發酵培養基按質量百分濃度計由以下成分組成:葡萄糖3 %，黃豆餅粉3%，植物油2%，油酸甲酯1.0%，碳酸鈣0.2%，硫酸鈉0.2%，硝酸鈉0.2%,氯化錳0.02 %，硫酸亞鐵0.01 %，抗壞血酸0.001 %，硫酸鋁0.06 %，磷酸氫二鉀0.01%,消泡劑0.01%,余量為水。
[0019]優選的，所述步驟a為將經過菌種制備得到的菌種依次進行種子搖瓶培養和種子罐培養；所述種子搖瓶培養的培養條件為以220?260rpm的轉速，在32±0.5°C條件下培養25h ;所述種子罐培養的接種量為0.0035%種子液；所述種子罐培養的培養條件為在溫度為32 ± 0.5°C，罐壓為0.04MPa條件下培養24h。
[0020]優選的，所述步驟b為將步驟a培養過后的含菌種的培養液轉入發酵罐內進行發酵培養，發酵培養條件為:罐內溫度為34土 1°C，溶氧量在30%以上，罐壓在0.03MPa，發酵過程中通過添加氨水溶液、植物油和無菌水，以使發酵液PH值維持在6.5?6.6之間，植物油按質量百分濃度計不低于3%，溶氧量不低于30%，發酵過程結束前24?48小時停止加植物油；當發酵液PH為6.9，殘油量為0.6%，生物量在45%，莫能菌素效價為45690u/mL時，發酵結束。
[0021]優選的，所述步驟c為先將發酵液pH值調至10.8，然后加熱到63°C并保溫3小時，加入無水硅酸鈉和碳酸鈣后將發酵液PH值調至7并放置30分鐘，最后噴霧干燥；所述無水娃酸鈉加入量為發酵液重量的6%,所述碳酸?丐加入量為發酵液重量的20%;所述噴霧干燥的條件為:進風溫度155°C ;干燥室內溫度87°C，排風溫度67°C，干燥器內壓力_300MPa。
[0022]在種子搖瓶培養過程中，當培養液pH值為6.6?6.7，生物量為6.9?15%，顏色為灰白色，且鏡檢結果顯示菌絲生長良好，帶有許多分枝成纖維狀、無雜菌時，轉為種子罐培養。
[0023]在種子罐培養過程中，當培養至種子齡為20?24h，培養液pH值為6.6?7.1，生物量為10%以上，鏡檢結果顯示菌絲粗壯呈網狀、舒展、染色深、無雜菌時，轉為發酵培養。
[0024]本發明的有益效果在于:本發明發酵工藝簡單，能有效提高發酵單位，降低生產成本，同時避免了動物源性氮源以及化學有機溶劑的使用，防止有機溶劑對莫能菌素預混劑造成污染，避免了對動物的危害；并且采用本發明所述培養基利于莫能菌素特殊結構的合成，從而提高莫能菌素收率，還能有利于后續對莫能菌素預混劑的提取；另外，采用一步噴霧干燥，不會產生污水，降低了環境污染；所制得的莫能菌素成品含量為20%以上，顆粒率達75%以上，顯著提高了產品顆粒率，實現莫能菌素穩定高效生產。
【具體實施方式】
[0025]下面對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0026]實施例1
[0027]莫能菌素預混劑的制備方法如下:
[0028]a.種子培養
[0029]I)菌種制備
[0030]取含肉地桂鏈霉菌的砂土管,無菌條件下加入5mL無菌水搖勻，然后用無菌接種針將其涂于產孢子斜面培養基中，并置于32°C ±0.5°C培養11天。
[0031]2)種子搖瓶培養
[0032]將步驟I)制備的孢子接種到搖瓶培養的培養基中，以220_260rpm的轉速，在32±0.5°C下恒溫培養25小時。
[0033]搖瓶培養的培養基按質量百分濃度計由下列組分組成:黃豆餅粉1.5%，酵母粉0.2%，葡萄糖0.4%，糊精1.0%，碳酸鈣0.06%，余量為水；滅菌后培養基pH值為7.05。
[0034]3)種子罐培養
[0035]將步驟2)培養過后的菌種加入種子罐中，接種量為0.0035%種子液，在溫度為32 ± 0.5°C，罐壓為0.04MPa條件下培養24h，取樣檢測。
[0036]檢測結果:外觀呈淺黃色，稠，氣味正常，無雜菌，pH值為6.7，生物量為18%，莫能菌素效價為160U/mL，菌絲粗壯呈網狀、舒展、染色深，達到種子培養液質控指標。
[0037]所用培養基按質量百分濃度計由以下成分組成:黃豆餅粉1.5%，酵母粉0.2%，葡萄糖2%，碳酸鈣0.25%，消泡劑0.1%，余量為水；滅菌后pH值為6.7。
[0038]b.發酵培養
[0039]將種子培養的培養液移種至發酵罐內，罐內溫度維持在34土1°C，溶氧量在30%以上，罐壓在0.03MPa。發酵過程中通過添加氨水溶液、植物油和無菌水，以使發酵液pH值維持在6.5?6.6之間，植物油按質量百分濃度計不低于3%，溶氧量不低于30%，發酵過程結束前24?48小時停止加植物油；發酵至290小時結束，取樣檢測。
[0040]檢測結果:pH值為6.9，生物量為45 %，莫能菌素效價為45690U/mL，殘油為0.6%,此時菌絲開始斷節,部分自溶。
[0041 ] 所述發酵培養的培養基按質量百分濃度計為:葡萄糖3 %，黃豆餅粉3 %，植物油2%，油酸甲酷1.0*%，碳酸令丐0.2%,硫酸納0.2*%，硝酸納0.2*%，氣化猛0.02%,硫酸亞鐵0.01%,抗壞血酸0.001 %，硫酸鋁0.06%，磷酸氫二鉀0.01 %，消泡劑0.01 %，余量為水。培養基用NaOH調pH值至8.2，定容滅菌后備用。
[0042]c.提取
[0043]發酵結束后，先用NaOH將發酵液pH值調至10.8，然后加熱到63°C保溫3小時，再加入無水硅酸鈉，無水硅酸鈉加入量為發酵液重量的6%，然后加入碳酸鈣，加入量為發酵液重量的20%，之后用硫酸或鹽酸將發酵液pH值調至7并放置半小時，最后噴霧干燥。噴霧干燥條件為:進風溫度155°C ;干燥室內溫度87°C，排風溫度67°C，干燥器內壓力為-300MPa。最后莫能菌素成品含量為34%，顆粒率87%。
[0044]實施例2
[0045]莫能菌素預混劑的制備方法如下:
[0046]a.種子培養
[0047]I)菌種制備同實施例1。
[0048]2)種子搖瓶培養
[0049]操作同實施例1。
[0050]搖瓶培養的培養基按質量百分濃度計由下列成分組成:黃豆餅粉1.4%，酵母粉0.2%，葡萄糖0.35%，糊精1.5%，碳酸鈣0.08 %，余量為水。培養基滅菌后pH值為7.0。
[0051]3)種子罐培養
[0052]將步驟2)培養過后的菌種加入種子罐中，接種量為0.0035%種子液，在溫度為32 ± 0.5°C，罐壓為0.04MPa條件下培養23h，取樣檢測。
[0053]檢測結果:外觀呈淺黃色，稠，氣味正常，無雜菌，pH值為6.9，生物量為20%，莫能菌素效價為178U/mL，菌絲粗壯呈網狀、舒展、染色深，達到種子培養液質控指標。
[0054]所用培養基按質量百分濃度計由下列成分組成:黃豆餅粉1.0%，酵母粉0.15%,葡萄糖2.1%，碳酸鈣0.2%，消泡劑0.1%，余量為水。滅菌后培養基pH值為6.7。
[0055]b.發酵培養
[0056]將步驟3)培養的菌種移種至發酵罐內，罐內溫度維持在34±1°C，溶氧量在30%以上。發酵過程中通過添加氨水溶液、植物油和無菌水，以使發酵液PH值維持在6.5?6.6之間，植物油按質量百分濃度計不低于3%，溶氧量不低于30%，發酵過程結束前24?48小時停止加植物油；發酵至275小時結束，取樣檢測。
[0057]檢測結果:pH值為6.8，生物量為50%，莫能菌素效價為51430u/mL，殘油為
0.7%，此時菌絲開始斷節，部分自溶。
[0058]所述發酵培養的培養基按質量百分濃度計為:葡萄糖3%，黃豆餅粉2.2%，植物油2.2 *%，油酸甲酷1.0 %,碳@^丐0.2%,硫酸納0.2 *%，硝酸納0.2 *%，氣化猛0.01 %,硫酸亞鐵0.01 %，抗壞血酸0.001 %，硫酸鋁0.05%，磷酸氫二鉀0.01 %，消泡劑0.01 %，余量為水。培養基用NaOH調pH值至8，定容滅菌后備用。
[0059]c.提取
[0060]先將發酵液pH值調至10.5，然后加熱到63°C保溫3小時，再加入無水硅酸鈉，力口入量為發酵液重量的6%,之后加入碳酸I丐,其加入量為發酵液重量的15%。再將發酵液的pH值調至7.2并放置半小時,最后噴霧干燥。噴霧干燥條件為:進風溫度160°C ;干燥室內溫度90°C，排風溫度72°C，干燥器內壓力為-310 MPa。最后莫能菌素成品含量為30%，顆粒率80%。
[0061]需要說明的是，提取過程中碳酸鈣的加入量與放罐效價有關，放罐時莫能菌素效價高，則碳酸鈣加入量增大。
[0062]最后說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的范圍。
【權利要求】
1.莫能菌素預混劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: a.種子培養 將經過菌種制備得到的肉桂地鏈霉菌依次進行種子搖瓶培養和種子罐培養；所述種子搖瓶培養的培養條件為以220?260rpm的轉速，在32±0.5°C條件下培養24?27h ；所述種子罐培養的接種量為0.0035%種子液；所述種子罐培養的培養條件為在溫度為32 ± 0.5°C，罐壓為0.02?0.05MPa條件下培養20?24h ； 所述種子搖瓶培養所需的培養基按質量百分濃度計由以下成分組成:黃豆餅粉I?1.5%，酵母粉0.1?0.3%，葡萄糖0.2?0.5%，糊精1.0?2.0%，碳酸鈣0.05?0.1%，余量為水；培養基滅菌后pH值為6.9?7.1 ; 所述種子罐培養的培養基按質量百分濃度計由以下成分組成:黃豆餅粉1.0?1.5%，酵母粉0.1?0.25 %，葡萄糖L 5?2.5 %，碳酸鈣0.1?0.25 %，消泡劑0.05?0.1 %，余量為水；培養基滅菌后pH值為6.6?7.1 ; b.發酵培養 將步驟a培養過后的含菌種的培養液轉入發酵罐內進行發酵培養，發酵培養條件為:罐內溫度34土 1°C，溶氧量30%以上，罐壓0.03?0.05MPa ;發酵過程中通過添加氨水溶液、植物油和無菌水，以使發酵液PH值維持在6.5?6.6之間，植物油按質量百分濃度計不低于3 %，溶氧量不低于30%，發酵過程結束前24?48小時停止加植物油；當發酵液pH值達6.6?7.0，殘油量為0.7%以下，生物量在40%以上，莫能菌素效價不低于40000U/mL時，發酵結束； 發酵培養基按質量百分濃度計由以下成分組成:葡萄糖2.0?3.8%，黃豆餅粉1.8?3.7%，植物油1.9?2.5%，油酸甲酯0.05?1.0%，碳酸鈣0.15?0.35%，硫酸鈉0.15?0.22%,硝酸鈉0.15?0.22 %，氯化錳0.0I?0.03 %，硫酸亞鐵0.005?0.0I %，抗壞血酸0.001?0.002%，硫酸鋁0.05?0.07%，磷酸氫二鉀0.005?0.01%，消泡劑0.01?0.02%，余量為水； c.提取 發酵結束后，先將發酵液pH值調至10?11，然后再加熱至63°C并保溫3小時，分別加入無水硅酸鈉和碳酸鈣后，將發酵液PH值調至7?8并放置30分鐘，最后噴霧干燥；所述無水娃酸鈉加入量為發酵液重量的6%,所述碳酸I丐加入量為發酵液重量的O?35%;所述噴霧干燥的條件為:進風溫度140?160°C;干燥室內溫度65?95°C，排風溫度60?70°C，干燥器內壓力-280?-380MPa。
2.根據權利要求1所述莫能菌素預混劑的制備方法，其特征在于，所述步驟a中所述種子搖瓶培養所需的培養基按質量百分濃度計由以下成分組成:黃豆餅粉1.5%，酵母粉0.2%，葡萄糖0.4%，糊精1.0%，碳酸鈣0.06 %，余量為水。
3.根據權利要求1所述莫能菌素預混劑的制備方法，其特征在于，所述步驟a中所述種子罐培養的培養基按質量百分濃度計由以下成分組成:黃豆餅粉1.5%，酵母粉0.2%，葡萄糖2 %，碳酸鈣0.25%，消泡劑0.1%，余量為水。
4.根據權利要求1所述莫能菌素預混劑的制備方法，其特征在于，所述步驟a中所述發酵培養基按質量百分濃度計由以下成分組成:葡萄糖3%，黃豆餅粉3 %，植物油2%，油酸甲酷1.0*%，碳Ifef丐0.2%,硫酸納0.2*%，硝酸納0.2*%，氣化猛0.02 %，硫酸亞鐵0.01 %,抗壞血酸0.0Ol %，硫酸鋁0.06%，磷酸氫二鉀0.01 %，消泡劑0.01 %，余量為水。
5.根據權利要求1所述莫能菌素預混劑的制備方法，其特征在于，所述步驟a為將經過菌種制備得到的菌種依次進行種子搖瓶培養和種子罐培養；所述種子搖瓶培養的培養條件為以220?260rpm的轉速，在32±0.5°C條件下培養25h ;所述種子罐培養的接種量為0.0035%種子液；所述種子罐培養的培養條件為在溫度為32±0.5°C，罐壓為0.04MPa條件下培養24h。
6.根據權利要求1所述莫能菌素預混劑的制備方法，其特征在于，所述步驟b為將步驟a培養過后的含菌種的培養液轉入發酵罐內進行發酵培養，發酵培養條件為:罐內溫度為34±1°C，溶氧量在30%以上，罐壓在0.03MPa，發酵過程中通過添加氨水溶液、植物油和無菌水，以使發酵液PH值維持在6.5?6.6之間，植物油按質量百分濃度計不低于3%，溶氧量不低于30 %，發酵過程結束前24?48小時停止加植物油；當發酵液pH為6.9，殘油量為0.6 %，生物量在45 %，莫能菌素效價為45690u/mL時，發酵結束。
7.根據權利要求1?6任一項所述莫能菌素預混劑的制備方法，其特征在于，所述步驟c為先將發酵液pH值調至10.8，然后加熱到63°C并保溫3小時，加入無水硅酸鈉和碳酸鈣后將發酵液PH值調至7并放置30分鐘，最后噴霧干燥；所述無水硅酸鈉加入量為發酵液重量的6%，所述碳酸鈣加入量為發酵液重量的20% ;所述噴霧干燥的條件為:進風溫度1550C ;干燥室內溫度87°C，排風溫度67°C，干燥器內壓力_300MPa。
【文檔編號】C12R1/465GK104313079SQ201410608474
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月3日 優先權日:2014年11月3日
【發明者】謝昌賢, 鄧維康, 劉運添, 王鵬飛 申請人:金河生物科技股份有限公司