一種快速區分非嗜肺、嗜肺與嗜肺ⅰ型軍團菌的三重pcr檢測方法
【專利摘要】本發明一種快速區分非嗜肺、嗜肺與嗜肺Ⅰ型軍團菌的三重PCR檢測方法，是一種軍團菌屬多重PCR檢測方法，屬于微生物分子檢測領域。本發明利用分別針對軍團菌屬、嗜肺軍團菌種和嗜肺軍團菌Ⅰ型的16SrRNA、danJ和ORF9基因的引物，對dNTPs和引物濃度比例以及退火溫度進行優化，建立快速區分非嗜肺、嗜肺與嗜肺Ⅰ型軍團菌的三重PCR方法。本發明方法簡便、快捷、成本低、結果準確可靠，可以對分離培養到的可疑軍團菌菌株進行快速有效的判定。
【專利說明】—種快速區分非嗜肺、嗜肺與嗜肺I型軍團菌的三重PCR檢測方法
【技術領域】
[0001]一種快速區分非嗜肺、嗜肺與嗜肺I型軍團菌的三重PCR檢測方法，是一種軍團菌屬多重PCR檢測方法，屬于微生物分子檢測領域。
【背景技術】
[0002]90%以上的軍團菌病是由嗜肺軍團菌(Leg1nella Pneumophila, LP)引起,其中85%為LPl型軍團菌肺炎，所以嗜肺軍團菌和LPl型嗜肺軍團菌是我們監測的重點。依據WS394-2012《公共場所集中空調通風系統衛生規范》，所有公共場所集中空調通風系統冷卻塔水和冷凝水中不得檢出嗜肺軍團菌，該規范的標準檢測方法為培養法。然而，傳統的培養法在對分離到的可疑軍團菌菌落進行判定時存在盲區，生化檢測的不確定性和血清學檢測的多交叉反應性，導致一些可疑軍團菌菌落不能被最終判別。本發明可以彌補生化和血清學鑒定檢測的不足，快速準確的對分離培養到的可疑軍團菌菌落進行判定，且簡單、方便、成本低。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于快速準確的對分離培養到的可疑軍團菌菌落進行判定，以克服傳統培養法中生化和血清學鑒定檢測的缺點。
[0004]本發明的技術方案:一種快速區分非嗜肺(非LP)、嗜肺(LP)與嗜肺I型(LPl)軍團菌的三重PCR檢測方法，步驟為:
1、制備PCR模板，挑取待檢測可疑單個菌落于0.5mL滅菌無核酸酶的去離子水中，制備成菌懸液，100°C煮沸15min，冷卻后備用。
[0005]2、引物序列:
16S rRNA 基因:上游引物 5’ -AAGATTAGCC TGCGTCCGAT-3’，下游引物 5’ -GTCAACTTATCGCGTTTGCT-3’，預期擴增片段長度為654 bp ；
dan J 基因:上游引物 5 ’ -AGGTGGTTTT GGCGGATTTG G_3 ’，下游引物 5 ’ -TGAATTCTGACTTGCCCCAT G-3’，預期擴增片段長度為285 bp ；
0RF9 基因:上游引物 5 ’ -CAGGATTACC GCTCATTATT G-3 ’，下游引物 5 ’ -GTAATTCCCAGCCATTTACC AGATC-3’，預期擴增片段長度為561 bp ；
3、PCR反應體系:1.6uL dNTP、三種上、下游引物(使用濃度均為2μΜ)均各2yL，模板DNA2yL、、rTaq酶0.08 μ LUOXbuffer緩沖液2 μ L，無核酸酶的去離子水補足至20μ L ；
4、擴增條件:95°C預變性 5 min ；95 V 30 S，52 V 30 S，72 V 40 s 進行 30 個循環；72 1:終末延伸5 min ；
5、凝膠電泳:在1.5%瓊脂糖凝膠，0.5XTBE緩沖液中電泳，電泳后凝膠成像獲取結果； 6、判定方法:獲得3條目的條帶為LPl，兩條目的條帶為LP，I條目的條帶為非LP，O條目的條帶為非軍團菌。
[0006]本發明的有益效果:本方法簡便、快捷、成本低、結果準確可靠，可以對分離培養到的可疑軍團菌菌株進行快速有效的判定，快速區分非嗜肺、嗜肺與嗜肺I型軍團菌。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0007]圖1是29株軍團菌PCR產物電泳圖譜。M:100bp DNA marker (最亮的條帶為500bp，向上、向下每條帶依次增、減100 bp) ;1、18為陰性對照,2為非嗜肺軍團菌Z.Jordanis(ATCC33623)，3 為 LP6 (ATCC33216)，4 為 LPl (ATCC33152), 5?17、19?34 為分離到的 29 株軍團菌。
[0008]具體實例方式
實施例1 一種快速區分非嗜肺、嗜肺與嗜肺I型軍團菌的三重PCR檢測方法，步驟為、
1、制備PCR模板，挑取待檢測可疑單個菌落于0.5mL滅菌無核酸酶的去離子水中，制備成菌懸液，100°C煮沸15min，冷卻后備用。
[0009]2、引物序列:
16S rRNA 基因:上游引物 5’ -AAGATTAGCC TGCGTCCGAT-3’，下游引物 5’ -GTCAACTTATCGCGTTTGCT-3’，預期擴增片段長度為654 bp ；
dan J 基因:上游引物 5 ’ -AGGTGGTTTT GGCGGATTTG G-3 ’，下游引物 5 ’ -TGAATTCTGACTTGCCCCAT G-3’，預期擴增片段長度為285 bp ；
0RF9 基因:上游引物 5 ’ -CAGGATTACC GCTCATTATT G-3 ’，下游引物 5 ’ -GTAATTCCCAGCCATTTACC AGATC-3’，預期擴增片段長度為561 bp。
[0010]3、PCR反應體系:1.6 yL dNTP、三種上、下游引物(使用濃度均為2μΜ)均各
2μ L，模板DNA 2 μ L、rTaq酶0.08 μ LUOXbuffer緩沖液2 μ L，無核酸酶的去離子水補足至20 μ L0
[0011]4、擴增條件:95°C預變性 5 min ；95°C 30 s，52V 30 s，72°C 40 s 進行 30 個循環；72°C終末延伸5 min。
[0012]5、凝膠電泳:在1.5%瓊脂糖凝膠、0.5XTBE緩沖液中電泳，電泳后凝膠成像獲取結果。
[0013]6、結果判定:獲得3條目的條帶為LPl，兩條目的條帶為LP，I條目的條帶為非LP，O條目的條帶為非軍團菌。
【權利要求】
1.一種快速區分非嗜肺、嗜肺與嗜肺I型軍團菌的三重PCR檢測方法，其特征在于步驟為: (1)制備PCR模板，挑取待檢測可疑單個菌落于0.5mL滅菌無核酸酶的去離子水中，制備成菌懸液，100°C煮沸15min，冷卻后備用； (2)引物序列: 16S rRNA 基因:上游引物 5’ -AAGATTAGCC TGCGTCCGAT-3’，下游引物 5’ -GTCAACTTATCGCGTTTGCT-3’，預期擴增片段長度為654 bp ； dan J 基因:上游引物 5 ’ -AGGTGGTTTT GGCGGATTTG G_3 ’，下游引物 5 ’ -TGAATTCTGACTTGCCCCAT G-3’，預期擴增片段長度為285 bp ； 0RF9 基因:上游引物 5 ’ -CAGGATTACC GCTCATTATT G-3 ’，下游引物 5 ’ -GTAATTCCCAGCCATTTACC AGATC-3’，預期擴增片段長度為561 bp ； (3)PCR反應體系:1.6μ L dNTP、濃度均為2 μ M的三種上、下游引物均各2 μ L，模板DNA.2 μ L、rTaq酶0.08 μ L、10 X buffer緩沖液2 μ L，無核酸酶的去離子水補足至20 μ L ； (4)擴增條件:95°C預變性5 min ；95°C 30 s，52°C 30 s，72°C 40 s 進行 30 個循環；.72 °C終末延伸5 min ；(5)凝膠電泳:在1.5%瓊脂糖凝膠、0.5XTBE緩沖液中電泳，電泳后凝膠成像獲取結果; (6)判定方法:獲得3條目的條帶為LP1，兩條目的條帶為LP，I條目的條帶為非LP，O條目的條帶為非軍團菌。
【文檔編號】C12Q1/04GK104313169SQ201410607389
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月3日 優先權日:2014年11月3日
【發明者】張琦, 周偉杰, 范曉東, 嚴潔, 沈波 申請人:無錫市疾病預防控制中心, 無錫市人民醫院