一種重組牦牛皺胃凝乳酶及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，公開了包含該核苷酸序列的重組載體、重組菌，以及SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列編碼的凝乳酶。本發明還公開了利用本發明重組菌制備重組牦牛皺胃凝乳酶的方法。本發明重組牦牛皺胃凝乳酶的可溶，活性高，具有工業應用價值。
【專利說明】一種重組牦牛皺胃凝乳酶及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種重組牦牛皺胃凝乳酶及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 凝乳酶屬于酸性蛋白酶，是最初在犢牛皺胃中發現的一個天冬氨酸蛋白酶，該酶 能作用于k-酪蛋白分子中的Phe^-Met^肽鍵，形成不溶性的k-酪蛋白，最終引起牛奶凝 集。因此，被廣泛應用于不同種類傳統奶酪制作預處理步驟。凝乳酶以前體蛋白的形式合 成（凝乳酶原前體，381個氨基酸），包含一個16個氨基酸的信號肽。切除這個信號肽后形 成凝乳酶原，然后在胃里的酸性條件下，該蛋白在N端切除42個氨基酸后形成有活性的凝 乳酶。
[0003] 目前商業上使用的凝乳酶共有4種來源：動物、植物、微生物和重組凝乳酶。傳統 上，動物源的凝乳酶主要從未斷奶犢牛的皺胃中提取。由于世界市場對凝乳酶需求的上升 和犢牛數量的下降，目前這種來源的凝乳酶已經不能滿足市場的需求。盡管植物凝乳酶已 經從洋薊這樣的物種中被提取出來，但是這類酶受到地理區域的限制，并且只能用來制作 特定類型的奶酪。微生物來源的凝乳酶已經從米曲霉或栗疫病菌等培養基的上清中獲得。 這類型的凝乳酶含有低特異性的蛋白酶，可能會導致奶酪出現苦味或者影響奶酪產量。
[0004] 牦牛是青藏高原地區的珍貴稀有的草食家畜，直接從牦牛皺胃中提取的牦牛皺胃 凝乳酶的成本高，采用基因工程的方式制備牦牛皺胃凝乳酶可以降低成本，然而，制備得到 一種可以表達有活性的牦牛皺胃凝乳酶的重組菌并非易事，目前未見采用基因工程的方式 制備牦牛皺胃凝乳酶的報道。
【發明內容】
[0005] 為了解決上述問題，本發明提供了一種重組牦牛皺胃凝乳酶。
[0006] 本發明提供了一種如SEQIDN0 :1所示的核苷酸序列。
[0007] 還提供了一種重組載體，它包含SEQIDN0 :1所示的核苷酸序列。
[0008] 其中，所述的重組載體是重組pPICZaA質粒，即pPICZaA-CYM質粒。
[0009] 還提供了一種重組菌，它包含前述的重組載體。
[0010] 其中，所述的重組菌為重組畢赤酵母。
[0011] 還提供了一種凝乳酶，它由SEQIDN0 :1所示的核苷酸序列編碼。
[0012] 優選地，它的氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示。
[0013] 本發明還提供了采用前述重組菌發酵的方法，包含如下步驟：
[0014] i、取前述的重組菌，接種到BMGY培養基上培養，培養溫度為30°C，pH為6. 0,至 〇D600 = 2 ?6 ;
[0015] ii、收集菌體，將其培養在BMMY培養基中，培養溫度為30°C，pH為6. 0,培養至0D_ =1時，加入甲醇至濃度1% (v/v)進行誘導表達，之后每24小時添加一次甲醇，每次添加 甲醇至濃度為1% (v/v)，誘導時間為24?184h;
[0016] m、離心，取上清，即包含凝乳酶的發酵產物。
[0017] 本發明還提供了前述方法制備得到的發酵產物。
[0018] 本發明構建了一種新的表達凝乳酶的畢赤酵母工程菌，該工程菌制備的重組牦牛 皺胃凝乳酶的酶活高，給業界提供一種新的能制作各種傳統奶酪的凝乳酶，具有良好的市 場應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019] 圖1凝乳酶原基因的PCR產物。泳道1 :DNA分子量標記DL2000 ;泳道2 :凝乳酶 原；
[0020] 圖2重組牦牛凝乳酶的牛奶凝集實驗。1 :含空pPICZaA表達載體的畢赤酵母培 養基上清處理的牛奶；2 :含凝乳酶原基因的畢赤酵母培養基上清處理的牛奶；
[0021] 圖3重組牦牛凝乳酶原的SDS-PAGE分析。泳道M:蛋白Maker;泳道1 :含空 pPICZaA載體的基因工程菌株的培養基上清；泳道2和3 :含重組牦牛凝乳酶原基因的基 因工程菌株的培養基上清；
[0022] 圖4含重組牦牛凝乳酶原的畢赤酵母菌株在不同培養時間點上清中凝乳酶活性 變化曲線。
【具體實施方式】
[0023] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發明上述內 容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
[0024] 實驗材料和試劑：
[0025] 菌株、載體和培養基：
[0026] 大腸桿菌菌株DH5a和pMD19-T載體（TAKARA,Dalian,China)主要用于DNA的操 作和擴增。畢赤酵母X33及載體pPICZaA商購獲得。
[0027]LB培養基（10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、和10g/LNaCl，pH〇f7_7. 5.)加入 氨節青霉素（l〇〇yg/mL)或者Zeocin(25iig/mL)用于大腸桿菌菌株DH5a的培養。
[0028]YPD培養基（10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖）加入 Zeocin(100yg/mL)被用于選擇畢赤酵母X33轉化菌株。
[0029]BMGY培養基（20g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，3g/LK2HP04, 11. 8g/L KH2P04, 100mL/L10XYNB，lmL/L500X生物素and10mL/L甘油）和BMMY培養基（20g/L胰 蛋白胨，l〇g/L酵母提取物，3g/LKH2P04, 11. 8g/LKH2P04,lOOmL/L10XYNB，lmL/L500X生 物素以及5mL/L甲醇）主要用于篩選出的基因工程菌以表達重組牦牛凝乳酶。
[0030] 實施例1本發明重組蛋白的制備
[0031] 1、重組表達
[0032] (1)凝乳酶原基因的克隆
[0033] 皺胃組織從一頭剛屠宰的哺乳犢牦牛皺胃中采集，DEPC水沖洗后，皺胃組織被立 刻放入了液氮中進行保存。總RNA按Trizol試劑（Invitrogen,USA)的操作說明進行提 取。總RNA的濃度和質量用紫外分光光度計進行分析。第一鏈cDNA合成用PrimeScript? RT-PCR試劑盒（TAKARA，Dalian,China)，并按生產商的操作說明進行合成。
[0034] 凝乳酶原基因序列由設計的引物分別從pMD19-T-Pro質粒中擴增出來，引物序列 如下表1所示：
[0035]表1研究中使用的引物序列
[0036]
【權利要求】
1. 一種如SEQ ID NO :1所不的核苷酸序列。
2. -種重組載體，其特征在于：包含SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
3. 根據權利要求2所述的重組載體，其特征在于：所述的重組載體是重組pPICZ a A質 粒。
4. 一種重組菌，其特征在于：它包含權利要求2或者3所述的重組載體。
5. 根據權利要求4所述的重組菌，其特征在于：所述的重組菌為重組畢赤酵母。
6. -種凝乳酶，其特征在于：它由SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列編碼。
7. 根據權利要求6所述的凝乳酶，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
8. -種采用權利要求4或者5所述的重組菌發酵的方法，其特征在于：包含如下步驟： i、 取權利要求4或者5所述的重組菌，接種到BMGY培養基上培養，培養溫度為30°C， pH為6. 0,至0D關=2?6 ; ii、 收集菌體，將其培養在BMMY培養基中，培養溫度為30°C，pH為6. 0,培養至0D_ = 1時，加入甲醇至濃度1% (v/v)進行誘導表達，之后每24小時添加一次甲醇，每次添加甲 醇至濃度為1% (v/v)，誘導時間為24?184h ; iii、 離心，取上清，即包含凝乳酶的發酵產物。
9. 權利要求8所述方法制備得到的發酵產物。
【文檔編號】C12N9/64GK104328134SQ201410607090
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月31日 優先權日:2014年10月31日
【發明者】江明鋒, 羅樊 申請人:西南民族大學