一種引物選擇合成測序分析pcr產物單體型的方法

一種引物選擇合成測序分析pcr產物單體型的方法
【專利摘要】本發明采用一種引物選擇合成測序分析PCR產物單體型的方法對兩個或者兩個以上位點變化（如SNP，突變等）的PCR產物（多個DNA模板）進行單體型分析，PCR產物被特定測序引物雜交后分成兩份，各自加入一種3’端封閉的單體試劑，測序引物在DNA模板指導下延伸位點發生變化的一個堿基后，該測序引物3’端被封閉而不能繼續延伸，然后對未封閉的引物繼續合成測序，得到特定DNA模板的序列信息,從而確定PCR產物的單體型。
【專利說明】一種引物選擇合成測序分析PCR產物單體型的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種采用引物選擇合成測序分析PCR產物單 體型的方法。

【背景技術】
[0002] 在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎，對生 命科學至關重要。隨著人類基因組計劃和各種模式生物基因組計劃的開展和完成，使人類 步入了后基因時代，分子生物學相關學科得到了迅猛的發展。從基因水平上認識生命的差 異，疾病發生、發展的規律，以及藥物與生命體的相互作用將成為可能。在基礎研究方面，研 究疾病基因的遺傳規律，克隆致病基因；在應用方面，直接尋找疾病的易感基因突變位點， 可以獲得有關與該疾病相關基因型的信息。通過DNA序列信息的分析可以為理解生命的起 源、疾病發生、以及個體化醫療等提供有用的相關核酸序列信息。人的基因組中存在諸多的 基因變異引起的疾病，如目前已經確定4000多種遺傳疾病是由單堿基突變引起的，而一些 重大疾病如癌癥、糖尿病、心血管疾病、抑郁癥、哮喘等，是受眾多基因相關。然而基因型的 信息本身是一種低外顯度遺傳變異，加上病例-對照研究方法的局限性，可能會出現假陰 性和假陽性結果；另外，在預測功能性SNP時，主要集中在可能引起蛋白質中氨基酸改變 和影響轉錄調節區活性的位點上，這樣勢必漏掉一些其他重要的功能位點，。已有的研究 發現，位于同一條染色體上的不同位點基因型之間不是孤立的，相鄰的等位基因往往傾向 于同時出現。如果相鄰的等位基因同時出現的頻率超過了隨機發生的概率時，稱為連鎖不 平衡，處于連鎖不平衡的、相鄰的SNP等位位點也傾向于以一個整體遺傳給后代。位于一 條染色體特定區域的一組相互關聯并傾向于以整體遺傳給后代的基因型的組合叫作單體 型，單體型的存在可以極大地減少疾病關聯研究的工作量。
[0003] 目前普遍采用間接的方法則是利用多個基因型的分型結果，以統計方法推斷單體 型，這種方法得到廣泛了的應用，且用于構建單體型的相關軟件也非常之多。然而，軟件分 析的結果對于臨床樣本而言，如果得不到直接的實驗證實終究是不踏實的，臨床檢測也很 難接受這樣的分析結果。通過實驗方法得到自然狀態下真實的單體型情況需要進行單分子 測序（如克隆測序、高通量測序等），這些方法由于成本高，不適于大規模的個體樣本分析。 對于常規PCR產物中包含多個SNP位點的實驗分析單體型方法，均采用一種等位基因特異 引物-PCR(AS-PCR)的方法，以第一個SNP位點為擴增起始點，用兩種特異引物將起始為兩 種的不同DNA模板分別進行擴增，然后分別進行測序，以確定其它SNP位點的堿基信息。然 而，這種方法由于需要等位基因的特異擴增引物，因而擴增引物的優化設計受到限制，其擴 增效率會因不同的擴增片段而不相同，甚至無法擴增出目的片段，操作繁瑣、效率不高；同 時需要標記兩個特異擴增引物，費用也不低廉。
[0004] 現有AS-PCR方法分析單體型是將不同的DNA模板分別擴增，然后進行序列分析來 實現的。如果能將不同DNA模板同時進行PCR擴增，但分別進行測序，同樣可以達到單體型 分析的目的，且擴增引物可以優化設計，適合所有兩相鄰基因型位點間的序列分析。基于上 述原理，本發明提出一種PCR產物的單體型分析方法，該方法可以設計優化PCR引物擴增需 要分析的核酸序列片段，然后進行序列分析，適合任意兩(多）位點間的單體型分析，操作相 對簡便，價格低廉，可以用于臨床檢測。


【發明內容】

[0005] 本發明所解決的技術問題是： 提供一種引物選擇合成測序分析PCR產物單體型的方法，當待檢樣本中含有兩個以上 的序列變化位點組成的單體型DNA模板時，沿著第一個序列變化位點有選擇地限制特定的 測序引物進行合成測序，從而測定相應DNA模板的序列，確定其單體型。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是： 提供一種引物選擇合成測序分析PCR產物單體型方法，針對待檢樣本中一段核酸序列 中含有兩個以上的序列變化位點組成的單體型DNA模板，可沿著第一個序列變化位點有選 擇地限制特定的測序引物進行合成測序，從而測定相應DNA模板的序列，確定其單體型，具 體步驟為： 步驟1)擴增：利用包含一個5'端修飾活性基團的PCR引物，對待檢樣本進行擴增； 步驟2) DNA單鏈制備：將PCR產物利用5'端修飾活性基團與其它經過修飾的載體結 合，并通過變性將未固定的PCR另一條DNA鏈清除，獲取固定的單鏈DNA模板； 步驟3)測序引物的雜交：根據檢測位點所包含的可能信息，在PCR單鏈DNA模板的第 一個分析位點前，雜交完全互補的測序引物； 步驟4)測序引物的封閉：根據檢測位點所包含的可能信息，加入一種3'端封閉的單體 試劑，測序引物在DNA模板指導下延伸位點發生變化的一個堿基后，該測序引物3'端被封 閉而不能繼續延伸； 步驟5)測序引物的延伸測序：當測序引物被部分封閉后，未封閉的測序引物采用現有 技術延伸，實現對DNA模板序列的測定； 步驟6) DNA模板單體型的確定：根據步驟5)測序信息，辨識出DNA模板中序列變化位 點得到堿基信息，構建DNA單體型。
[0007] 上述的一種PCR產物的單體型分析方法中，序列變化位點包括SNP、突變、插入或 缺失等造成的堿基序列發生變化。
[0008] 上述的一種PCR產物的單體型分析方法中，PCR引物5'端修飾的活性基團是在熱 條件下穩定的丙烯酰胺、生物素或氨基，所述載體為丙烯酰胺、表面修飾親和素或醛基或羧 基基團的載體，使得PCR引物5'端修飾的活性基團能夠與載體、或者載體表面基團發生化 學反應而固定到載體上。
[0009] 上述的一種PCR產物的單體型分析方法中，3'端羥基封閉的單體試劑包括 ddNTPs，3' -0-烯丙基、3' -0-氰乙基、3' -0-疊氮甲基等修飾的核苷酸；合成測序包括包括 單核苷酸加入焦磷酸測序、兩核苷酸加入焦磷酸測序，桑格測序技術，在焦磷酸測序方法測 定分析序列時，測序引物經封閉反應后，其測序反應體系可以直接用于測序反應；而在使用 桑格技術測序時，應先將測序引物經過封閉反應后的反應液清除，配制桑格測序反應液、使 測序引物延伸，延伸單鏈產物用于電泳測序分析。
[0010] 采用一種引物選擇合成測序分析PCR產物單體型的方法來分析MMP7 (U25346)基 因 PCR產物，該PCR產物包含A/G (rsll568818)和C/T ( rsll568819)核酸片段的單體型， 具體步驟為： (1) 將所有需檢測的樣本處理后提取DNA用作擴增模板，PCR擴增引物為SEQ ID NO: 1， 即 5'-AGTCTACAGAACTTTGAAAGTATGTG-3' 和 SEQ ID NO :2，即 5'-biotin-CTATGAGAGC AGTCATTTGACTTTG-3' ； (2) 將PCR擴增產物與親和素修飾的磁珠反應，使修飾生物素的DNA鏈固定到磁珠上， 在0. 2M NaOH溶液下變性，將未固定的另一條DNA鏈清除，然后用洗液洗滌，得到固定的單 鏈DNA模板，分成兩份用于下列實驗； ⑶將測序引物SEQ ID N0:3,即：5' -CTAAAACGAGGAAGTATTACATC-3'與磁珠固定的其 中一份單鏈DNA模板進行雜交； (4) 在焦磷酸測序反應體系中加入ddATP使測序引物完成一個堿基延伸； (5) 將上述（4)的反應體系置于焦磷酸測序儀（PSQ 96MA system (Biotage AB， Uppsala, Sweden))中，按照指定的單個核苷酸加入順序對未封閉測序引物雜交的DNA模板 進行序列測定。
[0011] (6) 按照（3)，（4)，（5)的流程，將測序引物SEQ ID NO: 3，即： 5' -CTAAAACGAGGAAGTATTACATC-3'與磁珠固定的第二份單鏈DNA模板雜交，在焦磷酸測序 反應體系中加入ddGTP使測序引物完成一個堿基延伸，最后反應體系置于焦磷酸測序儀 中進行序列測定。
[0012] (7)根據（5)，（6)得到的測序信息，辨識出DNA模板中序列變化位點得堿基信息， 構建DNA單體型。
[0013] 本發明的有益效果是： 提供了一種引物選擇合成測序分析PCR產物的單體型的方法對兩個或者兩個以上位 點變化的PCR產物進行單體型分析，PCR產物被特定測序引物雜交后分成兩份，各自加入一 種3'端封閉的單體試劑，測序弓丨物在DNA模板指導下延伸位點發生變化的一個堿基后，該 測序引物3'端被封閉而不能繼續延伸，然后對未封閉的引物繼續合成測序，得到特定DNA 模板的序列信息，從而確定PCR產物的單體型。
[0014] 與現有等位基因特異引物-PCR (AS-PCR)技術分析單體型相比，本發明對PCR引物 沒有限制，可以隨意在包含分析片段內的區域設計、優化PCR引物，對分析的片段區域沒有 限制，并擴增出足夠可用于序列測定的DNA模板量，適合所有片段的單體型分析。
[0015]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1.為一種測序引物選擇合成分析PCR產物的單體型分析方法的一般流程。圖中 1為固相載體，2為PCR產物（DNA模板)，3為互補雜交測序引物。PCR擴增產物的一條單鏈 通過與載體1結合得到固定、并變性后制備出單鏈DNA模板2,與測序引物3雜交（a);加 入ddATP，測序引物3在DNA模板第一個SNP位點堿基T的指導下發生合成反應（b)，此后， 該測序引物被封閉，不能繼續合成；加入dNTP進行焦磷酸測序反應（c)，測序信號均來自含 有"C"的DNA模板，當測序測定第二個SNP位點的堿基信息時，便能知道第二個SNP位點堿 基與第一個位點堿基C的關聯，從而確定單體型。
[0017] 圖 2 為麗P7 (U25346)基因 PCR產物包含A/G (rsll568818)和C/T ( rsll568819) 核酸片段的測序結果。（1)為單鏈PCR產物與測序引物雜交、且當測序引物用ddATP封閉 后，按照儀器上編輯程序依次加入單個核苷酸的焦磷酸測序結果，其序列特征表明：第一個 SNP位點堿基G相關聯的第二個SNP位點的堿基信息為T和C; (2)為單鏈PCR產物與測序 引物雜交、且當測序引物用ddGTP封閉后，按照儀器上編輯程序依次加入單個核苷酸的焦 磷酸測序結果，其序列特征表明：第一個SNP位點堿基A相關聯的第二個SNP位點的堿基信 息為C，與T無關聯。
[0018]

【具體實施方式】
[0019] 下面將結合說明書附圖，對本發明作進一步的說明。
[0020] 實例 I : MMP7 (U25346)基因 PCR 產物包含 A/G (rsll568818)和 C/T ( rsl 1568819)核酸片段的單體型分析 (1) 將血樣本采用傳統的蛋白激酶K與苯酚/氯仿抽提法提取外周血中的基因組DNA ; (2) 將 PCR 引物（5, -AGTCTACAGAACTTTGAAAGTATGTG-3'，5' -biotin-CTATGAGAGC AGTCATTTGACTTTG-3'，200 ng 基因組 DNA，0.2mM dNTP，l U Taq DNA 聚合酶，IX 擴增緩 沖液，I. 8 mM MgCl2的50 μ L PCR擴增體系進行擴增。擴增條件為：94°C起始變性5分鐘， 35個熱循環：94°C變性30秒?61°C退火45秒?72°C延伸45秒，最后72°C延伸7分鐘。
[0021] (3)將PCR擴增與親和素修飾的磁珠反應，使修飾生物素的DNA鏈固定到磁珠 上，在0. 2M NaOH溶液下變性，將未固定的另一條DNA鏈清除，然后用洗液（1〇11^1^8-Acetate, pH 7. 6)洗漆，得到固定的單鏈DNA模板，分成兩份用于下列實驗； ⑷）將測序引物（5' -CTAAAACGAGGAAGTATTACATC-3'）與磁珠固定的其中一份單鏈 DNA模板模板在反應體系（（10 mM Tris-HCl，2 M NaCl，I mM EDTA(乙二胺四乙酸鈉）， 0.1% Tween 20，pH 7.6) 80°C下放置5分鐘，然后自然冷卻至室溫，完成雜交； (5) 在焦磷酸測序反應體系（0.1 M Tris-Ac (pH 7.7)，2 mM EDTA(乙二胺四乙酸 鈉），10 mM Mg(Ac)2, 0.2% BSA(小牛血清蛋白），10 mM DTT(二巰蘇糖醇），10 mM APS(磷酰硫酸腺），0.4 mg/mL PVP(聚乙烯吡咯烷酮），4 mM D-Iuciferin(蟲熒光素）， 2 U/mL ATP sulfurylase(三憐酸腺苷硫酸化酶），0.4 mM Iuciferase (突光素酶），2 U/mL apyrase VII (三憐酸腺苷雙憐酸酶VII)，2 U/mL DNA聚合酶 I (Klenow fragment, exo -)中加入ddATP使測序引物在室溫下完成一個堿基延伸； (6) 將上述（5)的反應體系置于焦磷酸測序儀（PSQ 96MA system (Biotage AB， Uppsala, Sweden))中，按照儀器上編輯程序依次加入單個核苷酸對未封閉測序引物在DNA 模板指導下進行合成測序。得到圖2 (1)中的圖譜，根據系列特征可以得出，第一個SNP位 點堿基G相關聯與第二個SNP位點的堿基T和C均由關聯。
[0022] (7)按照（4)，（5)，（6)的流程，將測序引物（5, -CTAAAACGAGGAAGTATTACATC-3'） 與磁珠固定的第二份單鏈DNA模板模板雜交，在焦磷酸測序反應體系中加入ddGTP使測序 引物完成一個堿基延伸，最后反應體系置于焦磷酸測序儀中，按照儀器上編輯程序依次加 入單個核苷酸，對未封閉測序引物在DNA模板指導下進行合成測序。得到圖2 (2)中的圖 譜，根據序列特征可以得出，第一個SNP位點堿基A相關聯的第二個SNP位點的堿基信息為 C，與T無關聯。
[0023] (8)根據圖2中的圖譜，構建出的DNA單體型為下列三種： 單體型 I (SEQ ID N0:4) : 5'CTTATTGGCAGGAAGCACACAATGTATTTCTCTTTCAAA-3， 單體型 2 (SEQ ID NO:5) : 5J GTTATTGGCAGGAAGCACACAATGTATTCGTCTTTCAAA-3? 單體型 3 (SEQ ID NO:6) : -ATTATTGGCAGGAAGCACACAATGTATTCGTCTTTCAAA-3, 以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員 應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明 的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和 改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效 物界定。
【權利要求】
1. 一種引物選擇合成測序分析PCR產物單體型的方法，其特征在于：一段核酸序列的 待檢樣本中含有兩個以上的序列變化位點組成的單體型DNA模板，沿著第一個序列變化位 點有選擇地限制特定的測序引物進行合成測序，從而測定相應DNA模板的序列，確定其單 體型，具體步驟為： 步驟一擴增：利用包含一個5'端修飾活性基團的PCR引物，對待檢樣本進行擴增； 步驟二DNA單鏈制備：將PCR產物利用5'端修飾活性基團與其它經過修飾的載體結 合，并通過變性將未固定的PCR另一條DNA鏈清除，獲取固定的單鏈DNA模板； 步驟三測序引物的雜交：根據檢測位點所包含的可能信息，在PCR單鏈DNA模板的第一 個分析位點前，雜交完全互補的測序引物； 步驟四測序引物的封閉：根據檢測位點所包含的可能信息，加入一種3'端封閉的單體 試劑，測序引物在DNA模板指導下延伸位點發生變化的一個堿基后，該測序引物3'端被封 閉而不能繼續延伸； 步驟五測序引物的延伸測序：當測序引物被部分封閉后，未封閉的測序引物采用現有 技術延伸，實現對DNA模板序列的測定； 步驟六DNA模板單體型的確定：根據步驟5)測序信息，辨識出DNA模板中序列變化位 點得到堿基信息，構建DNA單體型。
2. 根據權利要求1所述的一種PCR產物的單體型分析方法，其特征在于序列變化位點 包括SNP、突變、插入或缺失造成的堿基序列發生變化。
3. 根據權利要求1所述的一種PCR產物的單體型分析方法，其特征在于所述PCR引物 5'端修飾的活性基團為在熱條件下穩定的丙烯酰胺、生物素或氨基之一，所述載體為丙烯 酰胺、表面修飾親和素或醛基或羧基基團的載體之一，使得PCR引物5'端修飾的活性基團 能夠與載體、或者載體表面基團發生化學反應而固定到載體上。
4. 根據權利要求1所述的一種PCR產物的單體型分析方法，其特征在于所述3'端羥基 封閉的單體試劑為ddNTPs，3' -O-烯丙基、3' -O-氰乙基、3' -O-疊氮甲基修飾的核苷酸之 〇
5. 根據權利要求1所述的一種PCR產物的單體型分析方法，其特征在于所述合成測序 包括單核苷酸加入焦磷酸測序、兩核苷酸加入焦磷酸測序，桑格測序技術，在焦磷酸測序方 法測定分析序列時，測序引物經封閉反應后，其測序反應體系可以直接用于測序反應；而在 使用桑格技術測序時，應先將測序引物經過封閉反應后的反應液清除，配制桑格測序反應 液、使測序引物延伸，延伸單鏈產物用于電泳測序分析。
6. 根據權利要求1所述方法分析MMP7 (U25346)基因PCR產物，該PCR產物包含A/G (rsll568818)和C/T ( rsll568819)核酸片段的單體型，具體步驟為： a. 將所有需檢測的樣本處理后提取DNA用作擴增模板，PCR擴增引物為SEQ ID NO: 1， 即 5'-AGTCTACAGAACTTTGAAAGTATGTG-3' 和 SEQ ID NO :2,即 5'-biotin-CTATGAGAGCAGTC ATTTGACTTTG-3' ； b. 將PCR擴增產物與親和素修飾的磁珠反應，使修飾生物素的DNA鏈固定到磁珠上， 在0. 2M NaOH溶液下變性，將未固定的另一條DNA鏈清除，然后用洗液洗滌，得到固定的單 鏈DNA模板，分成兩份用于下列實驗； 〇.將測序引物3￡0 10勵:3,8卩：5'-〇^44406466446了411^041'(：-3'與磁珠固定的其中 一份單鏈DNA模板進行雜交； d. 在焦磷酸測序反應體系中加入ddATP使測序引物完成一個堿基延伸； e. 將上述（d)的反應體系置于焦磷酸測序儀中，按照指定的核苷酸加入順序對未封閉 測序引物雜交的DNA模板進行序列測定； f. 按照（c)，（d)，（e)的流程，將測序弓丨物SEQ ID NO: 3，即： 5' -CTAAAACGAGGAAGTATTACATC-3'與磁珠固定的第二份單鏈DNA模板雜交，在焦磷酸測序 反應體系中加入ddGTP使測序引物完成一個堿基延伸，最后反應體系置于焦磷酸測序儀 中進行序列測定； g根據（e)，（f)得到的測序信息，辨識出DNA模板中序列變化位點得堿基信息，構建 DNA單體型。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313168SQ201410605987
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月30日 優先權日:2014年10月30日
【發明者】肖鵬峰, 潘榮芳, 浦丹 申請人:東南大學