一種用于檢測ugt1a1基因多態性的引物、探針、試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于檢測UGT1A1基因多態性的引物、探針、試劑盒及檢測方法，屬于生物【技術領域】。所述用于檢測UGT1A1基因多態性的引物和探針包括用于檢測所述UGT1A1*6基因多態性的UGT1A1*6多態性的引物和探針、以及用于檢測所述UGT1A1*28基因多態性的UGT1A1*28多態性的引物和探針中的至少一種，所述引物包括：正向引物和反向引物。所述試劑盒包括：上述引物和探針。本發明提供的引物和探針能夠高靈敏地檢測UGT1A1基因多態性。
【專利說明】-種用于檢測UGT1A1基因多態性的引物、探針、試劑盒及 檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，特別涉及一種用于檢測UGT1A1基因多態性的引物、探 針、試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 伊立替康（irinotecan，CPT-11)是喜樹堿半合成衍生物，伊立替康在體內經竣 酸酯酶（carboxylesterases，CE)水解轉化為7_乙基-10-輕基喜樹喊（7-ethyl_l〇-hy droxy-camptothecin，SN-38)，伊立替康是治療轉移性結直腸癌（metastaticcolorectal cancer，mCRC)最有效的化療藥物之一。伊立替康經靜脈注射后，在體內轉化為細胞毒性更 強的活性代謝產物SN-38后，經尿苷二磷酸葡萄糖醒酸轉移酶家族（uridinediphosphate glucuronosyltransferases，UGTs)滅活為葡萄糖醒酸產物（l〇-〇-glucuronyl-SN_38, SN-38G)后，經膽汁排泄入腸，在腸道細菌葡萄糖醛酸酶作用下轉換為SN-38后能夠引 發腸黏膜損傷及遲發性腹瀉；而腸道內的UGTs酶又可再度催化SN-38為SN-38G解毒，人類 的UGTs被分為UGT1和UGT2兩個家族，UGT1基因至少包括13個亞型其中包括UGT1A1，其 中UGT1A1基因多態性的表達及其活性與伊立替康的療效及不良反應均密切相關。
[0003] UGT1A1基因啟動子區TATA盒區域的變化，在CPT-11治療中，UGT1A1*28等位基因 的存在導致活性代謝產物SN-38的顯著增加，從而發生腹瀉或中性粒細胞減少的幾率顯著 增加。提示UGT1A1基因型的檢測可用于臨床預測與CPT-11相關的嚴重毒副作用的發生。 同時，在亞洲人群應用伊立替康進行治療的患者中UGT1A1*6(第1外顯子211位）雜合突 變型G/A和純合突變型A/A顯著增加患者發生3?4級中性粒細胞減少、血小板減少及腹 瀉的風險，針對以上突變的患者臨床需減少伊利替康給藥劑量，以控制毒副作用，通過對人 UGT1A1基因啟動子區TATA盒區域和第1外顯子211位核苷酸基因多態性進行檢測，從基因 水平上預測伊利替康對腫瘤患者的毒副作用，為臨床醫生制定伊利替康的給藥劑量提供參 考。
[0004] 目前基因突變檢測的"金標準"仍然是測序法，但傳統的測序方法步驟繁瑣，操作 時間長，同時，測序法檢測的靈敏度低，不能準確檢測出UGT1A1基因的多態性，使用者迫切 需要一種高靈敏度的檢測方法替換Sanger測序法
【發明內容】
[0005] 為了解決現有技術中檢測UGT1A1基因多態性的方法的靈敏度低的問題，本發明 實施例提供了一種用于檢測UGT1A1基因多態性的引物、探針、試劑盒及檢測方法。所述技 術方案如下：
[0006] -方面，本發明實施例提供了一種用于檢測UGT1A1基因多態性的引物和探針，所 述用于檢測UGT1A1基因多態性的引物和探針包括用于檢測所述UGT1A1*6基因多態性的 UGT1A1*6多態性的引物和探針、以及用于檢測所述UGT1A1*28基因多態性的UGT1A1*28多 態性的引物和探針中的至少一種，所述引物包括：正向引物和反向引物，其中，
[0007] UGT1A1*6多態性的正向引物如序列表中SEQIDNO. 1所示；
[0008] UGT1A1*6多態性的反向引物如序列表中SEQIDNO. 2所示；
[0009] UGT1A1*6多態性的探針如序列表中SEQIDNO. 3所示；
[0010] UGT1A1*28多態性的正向引物如序列表中SEQIDNO. 4所示；
[0011] UGT1A1*28多態性的反向引物如序列表中SEQIDNO. 5所示；
[0012] UGT1A1*28多態性的探針如序列表中SEQIDNO. 6所示；
[0013] 所述探針的5'端均連接有FAM熒光基團，所述探針的3'端均連接有BHQ淬滅基 團。
[0014] 另一方面，本發明實施例提供了一種用于檢測UGT1A1基因多態性的試劑盒，所述 試劑盒包括：上述的引物和探針。
[0015] 具體地，所述試劑盒還包括：PCR反應液、陽性質控品、陰性質控品、測序反應液、 消化酶系和測序PCR產物純化試劑。
[0016] 具體地，所述？0?反應液包括：含]\%2+的5\?0?緩沖液5111、2.5臟〇1/1(1階1 38 1. 5ii1、5U/ii1Taq酶 0? 2ii1 和 20ng/ii1 的模板DNA2ii1。
[0017] 具體地，所述消化酶系包括堿性磷酸酶和核酸外切酶I。
[0018] 具體地，所述測序反應液包括：0.3iil5XBigdye、0.45iil2.5XBuffer、 3iimol/L如序列表中SEQIDNO. 5所示的UGT1A1*28多態性的反向引物1ill和3iimol/L 如序列表中SEQIDNO. 1所示的UGT1A1*6多態性的正向引物1ill。
[0019] 具體地，所述測序PCR產物純化試劑包括0. 75mol/LNaCl和納米磁珠。
[0020] 具體地，所述陰性質控品為含有UGT1A1野生型基因片段的重組質粒。
[0021] 具體地，所述陽性質控品為含有UGT1A1基因多態性片段的重組質粒。
[0022] 又一方面，本發明實施例提供了一種檢測UGT1A1基因多態性的方法，采用上述的 試劑盒，所述方法包括：
[0023] 提取樣本的基因組DNA;
[0024] 以獲得的所述基因組DNA作為所述模板DNA，采用所述試劑盒進行PCR擴增反應， 得到PCR擴增產物；
[0025] 對所述PCR擴增產物進行純化，得到純化的PCR擴增產物；
[0026] 將所述純化的PCR擴增產物作為模板，進行測序PCR擴增，得到測序PCR擴增產 物；
[0027] 將所述測序PCR擴增產物進行純化；
[0028] 將純化后的所述測序PCR擴增產物測序分析，并與所述UGT1A1基因多態性對應的 野生型進行對比，判定所述樣本中的所述UGT1A1基因多態性。
[0029] 本發明實施例提供的技術方案帶來的有益效果是：本發明實施例提供的引物和探 針具有高靈敏度，能夠準確檢測UGT1A1基因多態性。本發明提供的試劑盒包括本發明實施 例提供的引物和探針，使得本發明實施例提供的試劑盒具有高靈敏度。本發明實施例提供 的檢測方法，能夠準確檢測UGT1A1基因多態性，同時，對待測樣本的基因片段采用熒光PCR 進行擴增，擴增情況可以通過擴增曲線和Ct值判斷，這能顯著提高基因多態性的檢測靈敏 度。PCR擴增產物采用堿性磷酸酶和核酸外切酶進行消化，這能有效去除PCR擴增產物中殘 留的dNTP、引物和單鏈DNA等，省去了凝膠電泳的步驟，不但節省了時間還避免了污染，此 夕卜，本發明實施例采用磁珠法對測序PCR產物進行純化，與傳統的乙醇/醋酸鈉法相比操作 簡單快捷、對設備要求簡單（只需一個磁力架）、純化結果穩定，得到的測序峰圖干凈清晰、 無染料峰。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030] 為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使 用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于 本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他 的附圖。
[0031] 圖1是本發明實施例三提供的UGT1A1*6多態性的測序峰圖；
[0032] 圖2是本發明實施例三提供的UGT1A1*28多態性的測序峰圖；
[0033] 圖3是本發明實施例三提供的擴增曲線圖。
【具體實施方式】
[0034] 為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施方式作進一 步地詳細描述。
[0035] 實施例一
[0036] 本發明提供了一種用于檢測UGT1A1基因多態性的引物和探針，用于檢測UGT1A1 基因多態性的引物和探針包括用于檢測UGT1A1 *6基因多態性的UGT1A1 *6多態性的引物和 探針、以及用于檢測UGT1A1*28基因多態性的UGT1A1*28多態性的引物和探針中的至少一 種，引物包括：正向引物和反向引物，其中，
[0037] UGT1A1*6多態性的正向引物如序列表中SEQIDNO. 1所示；
[0038] UGT1A1*6多態性的反向引物如序列表中SEQIDNO. 2所示；
[0039] UGT1A1*6多態性的探針如序列表中SEQIDNO. 3所示；
[0040] UGT1A1*28多態性的正向引物如序列表中SEQIDNO. 4所示；
[0041] UGT1A1*28多態性的反向引物如序列表中SEQIDNO. 5所示；
[0042] UGT1A1*28多態性的探針如序列表中SEQIDNO. 6所示；
[0043] 探針的5'端均連接有FAM熒光基團，探針的3'端均連接有BHQ淬滅基團。
[0044] 本發明實施例提供的引物和探針具有高靈敏度，能夠準確檢測UGT1A1基因多態 性。
[0045] 實施例二
[0046] 本發明實施例提供了一種用于檢測UGT1A1基因多態性的試劑盒，試劑盒包括：本 發明實施例一提供的引物和探針、以及PCR反應液、陽性質控品、陰性質控品、測序反應液、 消化酶系和測序PCR產物純化試劑。
[0047] 具體地，在試劑盒中，10iimol/L正向引物各0? 75iil，10iimol/L反向引物各 0.75iil，10iimol/L探針各 0.5ii1。
[0048] 具體地，PCR反應液包括：含Mg2+的 5XPCR緩沖液 5iil、2. 5mmol/LdNTPsl. 5iil、 5U/ii1Taq酶 0? 2ii1 和 20ng/ii1 的模板DNA2ii1。
[0049]具體地，消化酶系包括堿性磷酸酶和核酸外切酶I，且堿性磷酸酶和核酸外切酶 I的酶活力比為2:5。
[0050] 具體地，測序反應液包括：0.3ii 1 5XBigdye、0.45ii1 2.5XBuffer、3iimol/L 如序列表中SEQIDNO. 5所示的UGT1A1*28多態性的反向引物1ill和3iimol/L如序列表 中SEQIDNO. 1所示的UGT1A1*6多態性的正向引物1yl。該測序反應液用于檢測PCR擴 增產物。
[0051] 具體地，測序PCR產物純化試劑包括0. 75mol/LNaCl和納米磁珠。
[0052] 具體地，陰性質控品為含有UGT1A1野生型基因片段的重組質粒。
[0053] 具體地，陽性質控品為含有UGT1A1基因多態性片段的重組質粒。
[0054] 本發明提供的用于檢測UGT1A1基因多態性的試劑盒，該試劑盒包括本發明實施 例提供的引物和探針，使得該試劑盒能夠準確檢測UGT1A1基因多態性。
[0055] 實施例三
[0056] 本發明實施例提供一種檢測UGT1A1基因多態性的方法，采用本發明實施例二提 供的試劑盒，具體檢測方法如下：
[0057] 1、提取樣本的基因組DNA
[0058] 樣本收集：用真空采集管抽取受檢者靜脈血2ml，注入無菌收集管中，其中，該受 檢者靜脈血含有UGT1A1基因多態性。
[0059] 樣本保存和運輸：樣本可立即用于檢測；如不立即檢測，樣本應在4°C保存不超過 24小時，或者-20°C保存不超過3個月，再或者-70°C可長期保存，且保存在_20°C和_70°C 的樣本反復凍融不超過5次。樣本長途運送應采用0°C冰壺，運輸時間不超過6天。
[0060] 選用商品化血液基因組DNA提取試劑盒，提取的樣本的基因組DNA采用紫外分光 光度計測定濃度及質量，檢測0D260/0D280結果在1. 8-2. 0之間，樣本的基因組DNA濃度在 4ng/ia以上。提取完的基因組DNA立即進行檢測，若提取完的基因組DNA未及時進行檢測 應在-20°C保存。
[0061] 2、PCR擴增
[0062] 準備2個PCR反應管，用微量加樣器在每一個PCR反應管內加入引物、探針和PCR 反應液，其中，10Umol/L正向引物各0? 75iil，10iimol/L反向引物各0? 75iil，10iimol/L 探針各0.5111，？0?反應液包括：含]\%2+的5\?0?緩沖液5111、2.5臟〇1/1(1階1^1.5111、 5U/illTaq酶0.2ill和20ng/ill的模板DNA2iil，補水至25iil，其中，2個PCR反應管 分別對應UGT1A1*6和UGT1A1*28,再向PCR反應管中加入提取的樣本的基因組DNA、陰性質 控品和陽性質控品各2yl，蓋緊PCR反應管，經5000rpm離心數秒，得到上清液，取該上清液 進行PCR擴增反應。
[0063] 在熒光PCR儀上設置以下程序：
[0064]
【權利要求】
1. 一種用于檢測UGT1A1基因多態性的引物和探針，其特征在于，所述用于檢測UGT1A1 基因多態性的引物和探針包括用于檢測所述UGT1A1*6基因多態性的UGT1A1*6多態性的引 物和探針、以及用于檢測所述UGT1A1*28基因多態性的UGT1A1*28多態性的引物和探針中 的至少一種，所述引物包括：正向引物和反向引物，其中， UGT1A1*6多態性的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示； UGT1A1*6多態性的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示； UGT1A1*6多態性的探針如序列表中SEQ ID NO. 3所示； UGT1A1*28多態性的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 4所示； UGT1A1*28多態性的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 5所示； UGT1A1*28多態性的探針如序列表中SEQ ID NO. 6所示； 所述探針的5'端均連接有FAM熒光基團，所述探針的3'端均連接有BHQ淬滅基團。
2. -種用于檢測UGT1A1基因多態性的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：如權利 要求1所述的引物和探針。
3. 根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：PCR反應液、陽性質 控品、陰性質控品、測序反應液、消化酶系和測序PCR產物純化試劑。
4. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液包括：含Mg2+的5XPCR 緩沖液 1、2. 5mmol/L dNTPsl. l、5U/ii 1 Taq 酶 0? 1 和 20ng/ii 1 的模板 DNA2ii 1。
5. 根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述消化酶系包括堿性磷酸酶和核酸 外切酶I。
6. 根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述測序反應液包括： 0.31115\81§(^6、0.451112.5\81^€61'、311111〇1/1如序列表中5￡0 10勵.5所示的 UGT1A1*28多態性的反向引物liil和3iimol/L如序列表中SEQ ID NO. 1所示的UGT1A1*6 多態性的正向引物lu 1。
7. 根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述測序PCR產物純化試劑包括 0. 75mol/L NaCl和納米磁珠。
8. 根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性質控品為含有UGT1A1野生型 基因片段的重組質粒。
9. 根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性質控品為含有UGT1A1基因多 態性片段的重組質粒。
10. -種檢測UGT1A1基因多態性的方法，采用權利要求3-9任一項所述的試劑盒，其特 征在于，所述方法包括： 提取樣本的基因組DNA ; 以獲得的所述基因組DNA作為所述模板DNA，采用所述試劑盒進行PCR擴增反應，得到 PCR擴增產物； 對所述PCR擴增產物進行純化，得到純化的PCR擴增產物； 將所述純化的PCR擴增產物作為模板，進行測序PCR擴增，得到測序PCR擴增產物； 將所述測序PCR擴增產物進行純化； 將純化后的所述測序PCR擴增產物測序分析，并與所述UGT1A1基因多態性對應的野生 型進行對比，判定所述樣本中的所述UGT1A1基因多態性。
【文檔編號】C12N15/11GK104328181SQ201410604304
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月30日 優先權日:2014年10月30日
【發明者】林佳, 李品, 霍然, 唐景峰 申請人:武漢百泰基因工程有限公司