一種α-葡萄糖苷酶及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種α-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO：1。本發(fā)明的α-葡萄糖苷酶的最適作用溫度為60℃，且在50-65℃范圍內(nèi)能保持80％以上的酶活力；最適作用pH為4.5，且在pH3.0-6.0范圍內(nèi)能保持80％以上的酶活力。該α-葡萄糖苷酶能高效轉(zhuǎn)化麥芽糖，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖的含量最高，分別達(dá)到44.1％、23.0％和21.2％，三糖總含量為88.3％。因此，本發(fā)明所述α-葡萄糖苷酶可廣泛應(yīng)用于低聚異麥芽糖漿的生產(chǎn)，市場前景廣闊。
【專利說明】一種Ct-葡萄糖苷酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種葡萄糖苷酶及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] a-葡萄糖苷酶（a-glucosidase，簡稱AGLU酶，EC3. 2. 1. 20)，又名a-D-葡萄 糖苷水解酶，它可以從低聚糖類底物的非還原末端切開a-1，4糖苷鍵，釋放出葡萄糖；或 將游離出的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到另一糖類底物上形成a-1，6糖苷鍵，從而形成具有非發(fā)酵 性的功能性低聚糖--低聚異麥芽糖（簡稱頂〇s，主要包括異麥芽糖，潘糖，異麥芽三糖 等）。工業(yè)上a-葡萄糖苷酶主要應(yīng)用于低聚異麥芽糖的大量生產(chǎn)。低聚異麥芽糖是一類 含有至少一個(gè)a-(1，6)糖苷鍵的低聚糖，主要是異麥芽糖，潘糖，異麥芽三糖，天然少量存 在于醬油，蜂蜜中，它己經(jīng)慢慢被用來替代傳統(tǒng)的蔗糖作為食品添加劑。它被攝入人體后不 會被消化道吸收，也不能被有害菌利用，但可以被腸道的益生菌如雙歧桿菌作為碳源利用， 故其具有良好的雙歧因子作用，可以改善人體腸道的功能。此外，由于低聚異麥芽糖的甜度 只有普通糖的一半，可以有效防止兒童齲齒，適宜糖尿病人食用，可以作為飲料糖果和保健 品的添加劑。在飼料工業(yè)中，低聚異麥芽糖被認(rèn)為可以在提高家禽存活率的同時(shí)，又不會存 在合成飼料帶來對人體的副作用，據(jù)報(bào)道，日本50%左右的飼料中都含有低聚異麥芽糖。目 前，低聚異麥芽糖已經(jīng)在食品、醫(yī)藥和飼料加工行業(yè)有了很廣泛的應(yīng)用。
[0003] 生產(chǎn)AGLU酶的微生物種類有細(xì)菌、曲霉、古細(xì)菌等?，F(xiàn)在工業(yè)上生產(chǎn)環(huán)糊精所使 用的AGLU酶主要來自黑曲霉。由于能分泌AGLU酶的野生菌株的生產(chǎn)能力普遍較低，為了克 服野生菌株的低生產(chǎn)能力，國內(nèi)外研究者通過構(gòu)建基因工程菌生產(chǎn)重組AGLU酶。在國內(nèi)， 對a-葡萄糖苷酶的研究還主要在a-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)菌種選育和酶學(xué)性質(zhì)方面，雖然 有通過RT-PCR方法擴(kuò)增得到A.nigera-葡萄糖苷酶cDNA，構(gòu)建重組質(zhì)粒并嘗試在大腸桿 菌中表達(dá)，但酶表達(dá)量偏低，而且重組蛋白是胞內(nèi)酶，分離純化的成本相對高。
[0004] 迄今為止，國內(nèi)生產(chǎn)低聚異麥芽糖用a-葡萄糖苷酶主要依賴日本進(jìn)口，為了降 低低聚異麥芽糖的商業(yè)成本，首先必須降低葡萄糖苷酶的生產(chǎn)成本。因此，進(jìn)一步篩選 出性能優(yōu)良的a-葡萄糖苷酶基因并實(shí)現(xiàn)其在宿主菌中的高效表達(dá)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種新型a-葡萄糖苷酶及其應(yīng)用。本發(fā)明 通過將來源于黑葡萄穗霉（Stachybotryschartarum)的a-葡萄糖苷酶基因轉(zhuǎn)化入黑曲 霉（Aspergillusniger)中，構(gòu)建得到重組工程菌株，實(shí)現(xiàn)了該酶在體外的高效表達(dá)，為其 商業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
[0006] 本發(fā)明一方面提供了一種a-葡萄糖苷酶，其特征在于：
[0007] 1)其氨基酸序列為SEQIDN0 :1的a-葡萄糖苷酶；
[0008] 2)在1)中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸得到的，具有1)中 a-葡萄糖苷酶活性的酶。
[0009] 本發(fā)明另一方面提供了編碼上述a-葡萄糖苷酶的基因，其一種核苷酸序列為 SEQIDN0:2。
[0010] 本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，其包含上述編碼a-葡萄糖苷酶的核苷酸序列。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種表達(dá)宿主細(xì)胞，其攜帶有表達(dá)上述a-葡萄糖苷酶基因的表 達(dá)載體。
[0012] 上述表達(dá)宿主細(xì)胞為黑曲霉（Aspergillusniger)。
[0013] 本發(fā)明提供了一種新型a-葡萄糖苷酶，并構(gòu)建得到了表達(dá)該酶的黑曲霉重組菌 株。本發(fā)明的a-葡萄糖苷酶的最適作用溫度為60°C，且在50_65°C范圍內(nèi)能保持80% 以上的酶活力；最適作用pH為4.5,且在pH3. 0-6.0范圍內(nèi)能保持80%以上的酶活力。該 a-葡萄糖苷酶能高效轉(zhuǎn)化麥芽糖，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖的含量最高， 分別達(dá)到44. 1 %、23.0%和21. 2%，三糖總含量為88. 3%。因此，本發(fā)明所述a-葡萄糖苷 酶可廣泛應(yīng)用于低聚異麥芽糖漿的生產(chǎn)，市場前景廣闊。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014] 圖1 :本發(fā)明構(gòu)建的pGm-aglu重組表達(dá)載體質(zhì)粒圖譜。
[0015] 圖2 :黑曲霉aglu發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳分析圖，其中M所示為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子 量標(biāo)記，由上至下為116. 0kD，66. 2kD，45. 0kD，35. 0kD，25.OkD;泳道1所示為宿主菌黑曲霉 G1分泌蛋白表達(dá)情況；泳道2、3、4所示為重組菌株黑曲霉aglu分泌蛋白表達(dá)情況，箭頭所 指90kDa處為本發(fā)明所述來源于的黑葡萄穗霉的a-葡萄糖苷酶。
[0016]圖3:本發(fā)明a-葡萄糖苷酶相對酶活_溫度曲線圖。
[0017] 圖4 :本發(fā)明a-葡萄糖苷酶相對酶活-pH曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的a-葡萄糖苷酶進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0019] 實(shí)施例1 :a-葡萄糖苷酶基因的克隆
[0020] 使用真菌基因組DNA提取試劑盒（Omega)從黑葡萄穗霉過夜培養(yǎng)物中提取基因組 DNA。
[0021] 以黑葡萄穗霉基因組DNA為擴(kuò)增模板擴(kuò)增黑葡萄穗霉中的a-葡萄糖苷酶基 因，其中所用到的正向引物aGluS6480-F序列為（下劃線所示序列為SnaBI酶切位點(diǎn)）；
【權(quán)利要求】
1. 一種a-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述的a-葡萄糖苷酶包含有： 1) 氨基酸序列為SEQ ID NO :1的a -葡萄糖苷酶； 2) 在1)中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸得到的，具有1)中 a -葡萄糖苷酶活性的酶。
2. -種基因，其特征在于，所述基因編碼權(quán)利要求1所述的a-葡萄糖苷酶。
3. 如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
4. 一種表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體上攜帶有權(quán)利要求2所述的基因。
5. -種表達(dá)宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的表達(dá)宿主細(xì)胞攜帶有權(quán)利要求4所述的表 達(dá)載體。
6. 權(quán)利要求5所述的表達(dá)宿主細(xì)胞為黑曲霉（Aspergillus niger)。
7. 權(quán)利要求1所述的a-葡萄糖苷酶在生產(chǎn)異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12P19/14GK104328096SQ201410597020
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】王華明, 徐娟, 黃亦鈞 申請人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司