甘藍(lán)粉虱特異性ss-coi引物對及快速pcr檢測方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及甘藍(lán)粉虱特異性SS-COI引物對及快速PCR檢測方法和試劑盒。所述引物對包括引物APZYJF：5'-CAGCTTTATAATGTATTGGTCACA-3′；和引物APZYJR：5′-CTCAAATTTTATACCCAACAAA-3′。該引物只對甘藍(lán)粉虱具有擴(kuò)增能力，其檢測靈敏度達(dá)到了1/25600頭雌性成蟲。是對甘藍(lán)粉虱形態(tài)學(xué)檢測鑒定方法的補(bǔ)充和改進(jìn)。同時，本方法采用SS-COI PCR技術(shù)，提高了檢測的準(zhǔn)確性，節(jié)約了檢測時間，可以試劑盒的形式在我國口岸、有機(jī)蔬菜生產(chǎn)基地、鮮切花生產(chǎn)基地，以及蔬菜、觀賞植物種苗和植株調(diào)運(yùn)中推廣。
【專利說明】甘藍(lán)粉虱特異性SS-COI引物對及快速PCR檢測方法和試劑 合 Sl
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明甘藍(lán)粉虱特異性SS-COI引物對及快 速PCR檢測方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘藍(lán)粉風(fēng)Aleyrodes proletella(L.)，屬同翅目、粉風(fēng)科、粉風(fēng)屬，是一種世界性 檢疫害蟲。甘藍(lán)粉虱的寄主植物較多，有12科38種加3屬，分別為十字花科16種加1屬， 菊科10種加3屬，毛艮科3種，傘形科1種加1屬，玄參科1屬，結(jié)?？?種，鳳仙花科、小 檗科、大戟科、殼斗科、豆科和罌粟科各1種。而且，隨著甘藍(lán)粉虱入侵區(qū)域的逐漸擴(kuò)大和定 居時間的推移，其寄主植物的種類和危害程度有進(jìn)一步增加的趨勢。甘藍(lán)粉虱以成蟲和若 蟲進(jìn)行危害，危害方式主要有兩種，一是直接危害，亦即以刺吸式口器吸食寄主植物汁液， 與植物爭奪營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致寄主葉片黃化、提前落葉、落花甚至落果，嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量和 質(zhì)量；二是間接危害，亦即成蟲和若蟲分泌的蜜露誘發(fā)煤污病，不僅影響植物的光合作用、 降低作物產(chǎn)量，還嚴(yán)重影響作物的品質(zhì)和觀賞植物的觀賞價值。而有關(guān)其是否傳播植物病 毒，尚不得而知。如甘藍(lán)粉虱近年來在歐洲各國嚴(yán)重危害十字花科蔬菜，并在英國多次暴發(fā) 成災(zāi)，對歐洲蕓苔屬蔬菜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成了極大威脅，而且已對擬除蟲菊酯類殺蟲劑 產(chǎn)生了抗性。
[0003] 甘藍(lán)粉虱原產(chǎn)于英國南部，二十世紀(jì)九十年代之前是歐洲十字花科蔬菜的一種次 要害蟲。然而，隨著國際貿(mào)易的日趨頻繁，甘藍(lán)粉虱傳播擴(kuò)散迅速，目前已廣泛分布于歐洲 如奧地利、英格蘭、捷克斯洛伐克、芬蘭、法國、德國、匈牙利、意大利、波蘭、西班牙、瑞典、瑞 士、南斯拉夫；非洲如加那利群島、埃及、摩洛哥、安哥拉、肯尼亞、莫桑比克，北非和東非； 亞洲如俄羅斯（塔吉克斯坦帕米爾山脈）、中國臺灣、伊拉克、印度；澳洲的澳大利亞；太平 洋群島的新西蘭；大西洋群島的百慕大群島；南美洲的巴西，以及北美洲的美國東部等國 家和地區(qū)。我國大陸于2012年7月在北京市朝陽區(qū)首次發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)粉虱危害菊科雜草抱莖 苦荬菜，2013年8月在新疆烏魯木齊和吐魯番發(fā)現(xiàn)其危害生菜。甘藍(lán)粉虱最嗜食十字花科 和菊科植物，而我國幅員遼闊，除海南省地處熱帶以外，橫跨暖溫帶和亞熱帶；菊科植物是 我國主要觀賞植物類型，而十字花科植物是我國主要的蔬菜種植類型，在青海和西藏以外 的全國各省市區(qū)均有種植。甘藍(lán)粉虱是新傳入我國的一種粉虱類入侵害蟲，目前僅在北京 和新疆發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)生即可造成嚴(yán)重危害。而蔬菜花卉的調(diào)運(yùn)以及觀光旅游等是甘藍(lán)粉虱 進(jìn)一步擴(kuò)散蔓延的主要方式，因此加強(qiáng)對甘藍(lán)粉虱的檢疫和監(jiān)測檢測是杜絕其進(jìn)一步傳播 擴(kuò)散的根本途徑。
[0004] 甘藍(lán)粉虱體型微小，雌性成蟲體長I. 5mm，雄性個體稍??；卵長約0. 3mm，初產(chǎn)蠟白 色，半透明；初孵若蟲體長約〇.4_，淡黃綠色；卵及初孵若蟲肉眼均難以發(fā)現(xiàn)。而加強(qiáng)檢疫 和監(jiān)測檢測必需建立一套快速準(zhǔn)確的分子檢測方法。目前國際上用于甘藍(lán)粉虱鑒定的方法 主要是：1)形態(tài)特征鑒定。而且目前國內(nèi)針對甘藍(lán)粉虱尚沒有標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法。
[0005] COI技術(shù)曾用于鑒別甘藍(lán)粉虱的近緣種。mtDNA COI技術(shù)檢測是利用通用型的引 物，在DNA聚合酶的催化下，對目標(biāo)DNA進(jìn)行體外擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物回收、純化、測序，根 據(jù)序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建來判斷檢測結(jié)果。SS-COI PCR技術(shù)檢測是在mtDNA COI技術(shù) 的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的特異序列擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記，是利用特異性的引物，根據(jù)預(yù)期DNA條帶的 有無來判斷檢測結(jié)果，無需測序和序列比對，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、簡便且重現(xiàn)性 和穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的目的為提供一對甘藍(lán)粉虱特異性SS-COI引物。
[0007] 本發(fā)明的另一目的為提供一種甘藍(lán)粉虱的特異性快速PCR檢測方法。
[0008] 本發(fā)明的再一目的為提供一種甘藍(lán)粉虱的特異性快速PCR檢測試劑盒。
[0009] 本發(fā)明根據(jù)甘藍(lán)粉虱的線粒體DNA序列，設(shè)計(jì)一對種特異性引物，該引物只對甘 藍(lán)粉虱具有擴(kuò)增能力。是對甘藍(lán)粉虱形態(tài)學(xué)鑒定識別方法的補(bǔ)充和改進(jìn)。同時，本方法采 用SS-COI PCR技術(shù)，提高了檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度，節(jié)約了檢測時間，在甘藍(lán)粉虱檢測/監(jiān) 測方面具有很高的應(yīng)用價值，可以試劑盒的形式在我國口岸、有機(jī)蔬菜生產(chǎn)基地、鮮切花生 產(chǎn)基地，以及蔬菜和觀賞植物種苗及植株等的調(diào)運(yùn)中推廣。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的一對甘藍(lán)粉虱特異性SS-COI引物為：
[0011] $*APZYJF:5，-CAGCTTTATAATGTATTGGTCACA-3，jn
[0012] 引物 PPZYJR :5，-CTCAAATTTTATACCCAACAAA-3，。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的甘藍(lán)粉虱種特異性檢測方法包括使用上述SS-COI引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增的步驟。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的甘藍(lán)粉虱種特異性檢測試劑盒包括上述甘藍(lán)粉虱特異性SS-COI引 物。
[0015] 本發(fā)明的甘藍(lán)粉虱種特異性SS-COI引物及快速PCR檢測方法，用于快速檢測甘藍(lán) 粉虱。與國際現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明具有以下的技術(shù)優(yōu)勢：
[0016] 1)檢測準(zhǔn)確性高。本方法根據(jù)甘藍(lán)粉虱種特異性SS-COI標(biāo)記設(shè)計(jì)的引物APZYJF 和APZYJR，在PCR快速檢測甘藍(lán)粉虱時，可擴(kuò)增出384bp的片段，不僅對甘藍(lán)粉虱的單頭成 蟲和2齡、三齡、四齡若蟲可以進(jìn)行檢測，對于單粒卵和單頭初孵若蟲也能準(zhǔn)確檢測。
[0017] 2)操作簡便快捷。本發(fā)明采用PCR技術(shù)，操作過程簡單、快速、高效。一般整個過 程可在5個小時內(nèi)完成。
[0018] 3)特異性強(qiáng)。本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物可特異性檢測甘藍(lán)粉虱，在其近緣種、屬粉虱中無 擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0019] 因此本方法實(shí)用性強(qiáng)，可滿足植物檢疫及害蟲監(jiān)測/檢測的需要。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 圖1為引物APZYJF/APZYJR對甘藍(lán)粉虱及其近緣種、屬粉虱的SS-COI PCR擴(kuò)增結(jié) 果，
[0021] M:分子量標(biāo)準(zhǔn) Trans2K? ;1:甘藍(lán)粉風(fēng) Aleyrodes proletella(L. ) ;2:雙鉤巢粉 虱；3:螺旋粉虱；4:煙粉虱Asia 113隱種；5:煙粉虱Asia IIl隱種；6:煙粉虱Chinal隱 種；7:煙粉虱Asia I隱種；8:煙粉虱MED隱種；9:溫室粉虱；10:柑橘粉虱；11:非洲小粉 虱；12:陰性對照（超純水）。
[0022] 圖2為引物APZYJF/APZYJR對甘藍(lán)粉虱不同蟲態(tài)和性別的SS-COI PCR擴(kuò)增結(jié)果，
[0023] M:分子量標(biāo)準(zhǔn)Trans2K? ;1:單粒卵；2: -齡若蟲；3:二齡若蟲；4:三齡若蟲；5: 四齡若蟲；6:雌性成蟲；7:雄性成蟲；8:陰性對照（超純水）。
[0024] 圖3為引物APZYJF/APZYJR對甘藍(lán)粉虱檢測閾值的測定，
[0025] M:分子量標(biāo)準(zhǔn) Trans2K? ; 1-16 分別為 1:1/25 ;2:1/50 ;3:1/100 ;4:1/200 ; 5:1/400 ；6: 1/800 ；7: 1/1600 ；8: 1/3200 ；9:1/6400 ；10: 1/12800 ；11 : 1/25600 ； 12:1/51200 ;13:1/102400 ;14:1/204800 ;15:1/409600 ;16:1/819200 頭雌性成蟲；17:陰 性對照（超純水）。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)施實(shí)例1 :引物APZYJF/APZYJR對甘藍(lán)粉虱的擴(kuò)增效果
[0027] 1)粉虱模板DNA的制備
[0028] 將單頭粉虱置于滴有20 μ L提取緩沖液（50mM Tris-HClUmM EDTA、1% SDS、20mM NaCl，pH8.0)的parafilm膜上，以0. 2mL的PCR管底部作為勻漿器充分研磨，勻漿液以微 量移液器移入I. 5mL離心管；然后以200 μ L緩沖液分2次清洗勻漿器，移入同一離心管， 混勻，加入5yL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混勻后于60°C水浴Ih(中途混勻1次）；然后沸 水浴8min，加入220 μ L氯仿/異戊醇（V: V = 24:1)抽提液，輕柔混勻數(shù)十次后，冰上放置 30min ;4°C、12000r/min離心20min，取上清液，加入440μ L預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，待 出現(xiàn)少量絮狀沉淀后于_20°C放置30min ;4°C、12000r/min離心15min，小心棄去上清液。 加入50(^1^預(yù)冷的75%乙醇洗滌，41：、1200017 /1^11離心151^11，小心棄去上清液；然后將 離心管倒扣于潔凈濾紙上，自然干燥20min后每管加入50 μ L超純水，充分溶解后于-20°C 保存?zhèn)溆谩?br>
[0029] 2)檢驗(yàn)甘藍(lán)粉虱的特異性引物的合成
[0030] Primer APZYJF ：5; -CAGCTTTATAATGTATTGGTCACA-3;
[0031] Primer APZYJR :5' -CTCAAATTTTATACCCAACAAA-3'由上海生工生物工程技術(shù)服 務(wù)有限公司合成。
[0032] 3) PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0033] 反應(yīng)體系為 20μ L，其中 10XPCR buffer(含Mg2+)2. 0μ UdNTP(IOmM)O. 3μ UTaq 聚合酶（2. 5U/yL)0. 2yL、上游引物和下游引物（10μΜ)各0. 3yL、模板DNA2. OyL、超純 水 14. 9 μ L。
[0034] 4) PCR擴(kuò)增程序
[0035] 94?預(yù)變性 IOmin ;35 個循環(huán)：94°C 30sec、52°C 30sec、72°C 30sec ;最后 72? 延伸lOmin。
[0036] 5) PCR產(chǎn)物的鑒定
[0037] 取5 μ L PCR產(chǎn)物用1. 0% (重量/體積）瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色 后于凝膠成像系統(tǒng)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。
[0038] 實(shí)施結(jié)果
[0039] 利用引物primer APZYJF/APZYJR以甘藍(lán)粉虱線粒體DNA為模板，以不同隱種的煙 粉虱（包括=Asia 113隱種、Asia IIl隱種、Chinal隱種、Asia I隱種、MED隱種）以及雙 鉤巢粉虱、螺旋粉虱、溫室粉虱、柑橘粉虱、非洲小粉虱等5種其他常見種類的粉虱為對照 進(jìn)行SS-COI PCR擴(kuò)增。在1泳道的甘藍(lán)粉虱中擴(kuò)增出了 384bp的目的條帶（見附圖1的 1泳道），在其他10種近緣種、屬的粉虱中均無擴(kuò)增產(chǎn)物。說明我們所篩選的來自甘藍(lán)粉虱 線粒體DNA的特異性SS-COI PCR擴(kuò)增引物的特異性強(qiáng)。
[0040] 384bp片段的序列：
【權(quán)利要求】
1. 甘藍(lán)粉虱特異性SS-COI引物對，其特征在于，所述引物對包括以下引物： 引物 APZYJF : 5' -CAGCTTTATAATGTATTGGTCACA-3';和 引物 APZYJR : 5' -CTCAAATTTTATACCCAACAAA-3'。
2. -種甘藍(lán)粉虱特異性檢測方法，其特征在于，所述方法包括使用權(quán)利要求1所述 SS-C0I引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟。
3. -種甘藍(lán)粉虱檢測特異性檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所 述的甘藍(lán)粉虱特異性SS-C0I引物對。
4. 用于檢測甘藍(lán)粉虱的特異性序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
【文檔編號】C12Q1/68GK104263728SQ201410596872
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】張桂芬, 萬方浩, 郭建洋, 郭建英, 李小鳳, 陳苗苗 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所