增加前體物供應以提高鹽霉素發酵水平的方法
【專利摘要】一種增加前體物供應以提高鹽霉素發酵水平的方法，是通過整合型載體pSET152在白色鏈霉素DSMZ41398(Streptomyces albus DSMZ41398)染色體上分別加倍來源于天藍色鏈霉菌的乙酰輔酶A羧化酶基因，來源于自身的甲基丙二酰輔酶A變位酶基因和來源于自身的巴豆酰輔酶A還原酶基因，來增加鹽霉素合成中所需三種前提物質的供應，實現鹽霉素產量的提高。本發明所得到工程菌株鹽霉素的發酵終產量提高260％，實驗室搖瓶水平達到2g/L。
【專利說明】增加前體物供應以提高鹽霉素發酵水平的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物工程技術，特別涉及一種增加前體物供應以提高鹽霉素發酵水平 的方法。 技術背景
[0002] 放線菌是一類高GC含量的革蘭氏陽性菌，目前已知抗生素中有60%以上是由放 線菌合成。鏈霉菌是一類高等放線菌，具有強大的抗生素合成能力和復雜的形態分化，故一 直受到人們的關注。聚酮類化合物是一類由放線菌產生的重要的次級代謝產物，其在抗腫 瘤、抗寄生蟲、抗生素領域都有極其重要的應用。前期的實驗已經證明，聚酮類化合物的生 物合成主要依賴I型、II型和III型聚酮生物合成基因簇，其主要使用的前體物是乙酰輔 酶A、丙二酰輔酶A、甲基丙二酰輔酶A、乙基丙二酰輔酶A等等。
[0003] 鹽霉素屬于聚醚類抗生素，是由白色鏈霉菌（Streptomycesalbus)產生的。鹽霉 素具有廣泛的抗球蟲譜，50mg/kg就有顯著的抑制作用。此外，鹽霉素也能夠抑制大多數革 蘭氏陽性菌的生長。鹽霉素作用的機理同其它聚醚類抗生素相同為鈉鉀離子的螯合載體， 通過結合鈉鉀離子改變細胞離子梯度，導致細胞死亡。1979年日本就批準使用鹽霉素作為 抗球蟲病藥物。1987年歐共體批準使用鹽霉素作為球蟲抑制劑和生長促進劑。自1993年 經我國農業部批準后，鹽霉素作為雞球蟲抑制劑和飼料添加劑被廣泛的應用于家禽業和畜 牧業。目前，研究人員又發現鹽霉素能夠高效且特異性的殺死上皮腫瘤干細胞，其活性是目 前臨床上應用的紫杉醇的100倍，這引發了國際上對鹽霉素的研究熱潮。鑒于鹽霉素的重 要性，本 申請人:的微生物代謝國家重點實驗室在2011年鑒定完成了鹽霉素生物合成基因 簇，2012年完成了其產生菌白色鏈霉素DSMZ41398(Str印tomycesalbusDSMZ41398)的全 基因組測序。通過對基因組進行分析，我們發現DSMZ41398中存在著完整的三種前體（丙 二酰輔酶A、甲基丙二酰輔酶A和乙基丙二酰輔酶A)的生物合成途徑，但是部分關鍵酶只 有一個拷貝且不具有特別突出的轉錄活性，這暗示著菌體內前體物的供應并沒有處于很高 的水平，鹽霉素的生產能力可能受到前體物供應的制約。
[0004]通過文獻調研，發現前體物的充足供應會影響到聚酮鏈的延生，進而影響聚酮類 化合物的最終產量。在天藍色鏈霉菌中，通過加倍乙酰輔酶A羧化酶基因可以使放線紫紅 素產量提高6倍；在棒狀鏈霉菌CKD1119中，通過加倍甲基丙二酰輔酶A變位酶可以使F靠 06產量提高2倍；然而對于白色鏈霉菌DSMZ41398來說，是否可以通過加倍前體合成途徑 中的限速基因，使得菌體可以產生更多的前體，進而提高抗生素的發酵水平并不清楚。為 此，本發明嘗試通過分別加倍三個前體合成途徑中的限速步驟基因來提高鹽霉素的產量， 為鹽霉素工業化規模的擴大和生產成本的降低提供有效的參考。
【發明內容】
[0005]本發明的目的，在于提供一種通過增加前體物供應以提高鹽霉素發酵水平的方 法。
[0006] 為了實現本發明的目的，本發明采用了以下技術方案：
[0007] -種增加前體物供應以提高鹽霉素發酵水平的方法，是通過整合型載體PSET152 在白色鏈霉素DSMZ41398(Str印tomycesalbusDSMZ41398)染色體上分別加倍來源于天藍 色鏈霉菌的乙酰輔酶A羧化酶基因、來源于自身的甲基丙二酰輔酶A變位酶基因和來源于 自身的巴豆酰輔酶A還原酶基因，使鹽霉素在發酵中的產量得到提高；
[0008] 所述乙酰輔酶A羧化酶基因的序列如SEQIDNO. 1所示；所述甲基丙二酰輔酶A變 位酶基因的序列如SEQIDNO. 2所示；所述巴豆酰輔酶A還原酶基因的序列如SEQIDNO. 3 所示。
[0009] 所述加倍的構建步驟如下：
[0010] 第一步：設計并構建用于加倍來源于天藍色鏈霉菌的乙酰輔酶A羧化酶基因的整 合型質粒載體I;
[0011]第二步：設計并構建用于加倍來源于DSMZ41398的甲基丙二酰輔酶A變位酶基因 的整合型質粒載體II;
[0012] 第三步：設計并構建用于加倍來源于DSMZ41398的巴豆酰輔酶A還原酶基因的整 合型質粒載體III;
[0013] 第四步：將上述三步構建得到的質粒載體I、II、III結合轉移導入受體菌白色鏈 霉素DSMZ41398中進行同源重組；
[0014] 第五步：通過對突變株的篩選和驗證阿伯拉霉素抗性驗證超量表達特定基因的突 變株。
[0015] 所述的質粒載體I的構建方法是在質粒PIB139的Ndel/EcoRI位點插入來自天藍 色鏈霉菌的3. 67kb的乙酰輔酶A羧化酶基因PCR片段Ndel/EcoRI;所述的質粒載體II的 構建方法是在質粒PIB139的Ndel/EcoRI位點插入來自DSMZ41398的4. 17kb的甲基丙二酰 輔酶A變位酶基因PCR片段Ndel/EcoRI;所述的質粒載體III的構建方法是在質粒pIB139 的Ndel/EcoRI位點插入來自DSMZ41398的I. 37kb的巴豆酰輔酶A還原酶基因PCR片段 Ndel/EcoRI。
[0016] 所述的發酵是指將鏈霉菌孢子或者菌絲體在TSBY培養基中于33°C、220轉/分 鐘的轉速下培養36?48小時后，轉接到種子培養基，于33°C、220轉/分鐘的轉速下培養 16?20小時后，再轉接到發酵培養基發酵9天。
[0017] 所述TSBY培養基含有：TSB3%，酵母提取物0.5%，蔗糖10. 3%;所述種子培養基 含有：葡萄糖4 %，黃豆餅粉3 %，酵母提取物1 %，碳酸鈣0. 2 % ;所述發酵培養基含有：胚 芽粉0. 8 %，黃豆餅粉0. 5 %，氯化鉀0. 22 %，氯化鈉0. 1 %，尿素0. 16 %，酒石酸0. 2 %，硫 酸鎂0. 01 %，磷酸氫二鉀0. 01 %，碳酸鈣0. 5 %，大豆油15 %。
[0018] 所述的轉接到種子培養基是將TSBY培養物按照3%的接種量轉接于種子培養基， 所述的轉接到發酵培養基是將種子培養物按照10%的接種量轉接于發酵培養基。
[0019] 采用本發明的方法，可以增加菌體內總的前體物的供應，進而提高用于鹽霉素合 成的前體供應以此來提高鹽霉素發酵，最終乙酰輔酶A羧化酶加倍突變株的鹽霉素發酵產 量提高幅度最大，達到260 %以上，最終產量達到2. 0g/L，可顯著提高鹽霉素的發酵產量， 同時使發酵成本大幅降低。
[0020] 本發明所涉及的菌株白色鏈霉菌DSMZ41398已經在SCI數據庫文獻《Yurkovich ME,TyrakisPA,HongH,SunY,SamborskyyM,KamiyaK,LeadlayPF:Alate-stage intermediateinsalinomycinbiosynthesisisrevealedbyspecificmutationinthe biosyntheticgenecluster..Chembiochem2012,Jan2 ;13 (I) :66_71》中公開。
[0021] 本發明所涉及的質粒PIB139已經在SCI數據庫文獻《WilkinsonCJ， Hughes-ThomasZA1MartinCJ,BohmI1MironenkoT1DeaconM1WheatcroftM1Wirtz G,StauntonJ,LeadlayPF. :Increasingtheefficiencyofheterologouspromotersin actinomycetes.JMolMicrobiolBiotechnol2002,Jul;4(4) :417-26.》中公開。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022] 圖1為乙酰輔酶A羧化酶基因（pLQ59)、甲基丙二酰輔酶A變位酶基因（pLQ61)和 巴豆酰輔酶A還原酶基因（pLQ60)加倍質粒構建流程；
[0023] 圖2為加倍突變株半定量PCR的結果；
[0024] 圖3為加倍突變株與空載對照的鹽霉素發酵產量示意圖。
[0025] 具體實施方法
[0026] 以下實例將結合附圖對本發明進一步作說明。本實施例在以本發明技術方案為前 提下進行實施，并給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施 例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法的，按照常規條件或制造廠商的建議條件。 實施例
[0027] 步驟一：質粒pLQ59、pLQ60和pLQ61的構建
[0028] 以天藍色鏈霉菌基因組DNA為模板，分別使用兩組引物accA2_F/R和accBE-F/R 通過PCR擴增得到乙酰輔酶A羧化酶的兩個亞基accA2 (1802bp)和accBE(1839bp)，通過基 因測序確認序列的正確性。在質粒PIB139的Ndel/EcoRI位點插入accA2 (Ndel/Hindlll) 和accBE(Hindlll/EcoRI)，通過上述方法得到用于乙酰輔酶A羧化酶加倍的質粒pLQ59。在 37攝氏度水浴條件下，采用Ndel，HindIII和EcoRI三種限制性內切酶進行酶切處理可以 觀察到1802bp和1839bp的兩條目標條帶，表明質粒構建正確。
[0029] 以白色鏈霉菌DSMZ41398基因組DNA為模板，使用引物ccr-F/R通過PCR擴增得到 巴豆酰輔酶A還原酶基因CCr(1338bp)，通過基因測序確認序列的正確性。在質粒pIB139 的Ndel/EcoRI位點插入ccr(NdeI/EcoRI)，通過上述方法得到用于巴豆酰輔酶A還原酶加 倍的質粒PLQ60.在37攝氏度水浴條件下，采用NdeI和EcoRI兩種限制性內切酶進行酶切 處理可以觀察到1338bp的目標條帶，表明質粒構建正確。
[0030] 由于甲基丙二酰輔酶A變位酶基因由兩個相鄰的亞基mutA和mutB組成，但是 其長度太長不容易PCR，所以選擇序列中的天然酶切位點將其分成三部分PCR擴增隨后 再拼接。以白色鏈霉菌DSMZ41398基因組DNA為模板，使用引物mcm-I-F/R、mcm-11-F/ R和mcm-III-F/R通過PCR擴增得到甲基丙二酰輔酶A變位酶基因的三個片段，通過基因 測序確認序列的正確性。在質粒PIB139的Ndel/EcoRI位點插入mcm-I(Ndel/BamHI)、 mcm-II(BamHI/BsrGI)和mcm-III(BsrGI/EcoRI)，通過上述方法得到用于甲基丙二醜輔酶 A變位酶加倍的質粒pLQ61。在37攝氏度水浴條件下，采用NdeI和EcoRI兩種限制性內切 酶進行酶切處理可以觀察到4. 9kb的目標條帶，表明質粒構建正確。
[0031] 步驟二：將用于插入染色體中整合位點的整合質粒pLQ59、pLQ60、pLQ61和空載質 粒導入野生型菌株DSMZ41398,并篩選得到具有阿伯拉霉素抗性的突變株，這些突變株表征 了三個限速酶：乙酰輔酶A羧化酶、甲基丙二酰輔酶A變位酶和巴豆酰輔酶A還原酶的分別 加倍。
[0032] 基因加倍的具體操作如下：將已構建完成用于基因缺失的質粒pLQ59轉化進入宿 主ET12567(含有pUZ8002質粒）中。取ET12567于含有Amp，Kan和Chl三種抗生素的LB 中于37°C過夜培養，用相同的培養基，將過夜培養物按10%的比例轉接一次并培養2. 5小 時，然后用新鮮的LB溶液漂洗菌體以除去培養物中的抗生素。于此同時制備野生型菌株 DSMZ41398的新鮮孢子約109個，用TES溶液漂洗2?3次之后再用2mLTES溶液懸浮孢子， 于50°C熱激IOmin后再冷卻至室溫，等體積加入2X孢子預萌發培養液后于37°C培養3小 時。將預萌發的孢子液與之前制備的宿主菌ET12567混合（孢子和宿主菌的比例約為10 : 1)均勻后涂布于SFM平板，待平板吹干后轉移至30°C培養箱正置培養17小時后取出平板， 分別取阿伯拉霉素和萘啶酮酸兩種抗生素的儲存液40μL和12μL加入I. 5mL無菌水中混 勻后覆蓋在SFM平板上，將平板晾干后轉移至30°C培養箱中培養。一般3?5天后可見平 板上有單菌落結合子長出，通過菌絲體PCR和抗性驗證的方法驗證結合子，其中乙酰輔酶A 羧化酶基因加倍的突變株采用acc-C-F/acc-C-R為引物進行PCR驗證，甲基丙二酰輔酶A 變位酶基因加倍的突變株采用mcm-C-F/mcm-C-R為引物進行PCR驗證，巴豆酰輔酶A還原 酶基因加倍的突變株采用ccr-C-F/ccr-C-R為引物進行PCR驗證。
[0033] 上述步驟中所用到的引物序列如表1所示
[0034]表1
[0035]
【權利要求】
1. 一種增加前體物供應以提高鹽霉素發酵水平的方法，是通過整合型載體PSET152在 白色鏈霉素 DSMZ41398(Str印tomyces albus DSMZ41398)染色體上分別加倍來源于天藍色 鏈霉菌的乙酰輔酶A羧化酶基因、來源于自身的甲基丙二酰輔酶A變位酶基因和來源于自 身的巴豆酰輔酶A還原酶基因，使鹽霉素在發酵中的產量得到提高； 所述乙酰輔酶A羧化酶基因的序列如SEQ ID NO. 1所示；所述甲基丙二酰輔酶A變位 酶基因的序列如SEQ ID NO. 2所示；所述巴豆酰輔酶A還原酶基因的序列如SEQ ID NO. 3 所示。
2. 根據權利要求1所述增加前體物供應以提高鹽霉素發酵水平的方法，其特征在于， 所述加倍的構建步驟如下： 第一步：設計并構建用于加倍來源于天藍色鏈霉菌的乙酰輔酶A羧化酶基因的整合型 質粒載體I ; 第二步：設計并構建用于加倍來源于DSMZ41398的甲基丙二酰輔酶A變位酶基因的整 合型質粒載體II ; 第三步：設計并構建用于加倍來源于DSMZ41398的巴豆酰輔酶A還原酶基因的整合型 質粒載體III ; 第四步：將上述三步構建得到的質粒載體I、II、III結合轉移導入受體菌白色鏈霉素 DSMZ41398中進行同源重組； 第五步：通過對突變株的篩選和驗證阿伯拉霉素抗性驗證超量表達特定基因的突變 株。
3. 根據權利要求2所述增加前體物供應以提高鹽霉素發酵水平的方法，其特征在于， 所述的質粒載體I的構建方法是在質粒PIB139的Ndel/EcoRI位點插入來自天藍色鏈霉 菌的3. 67kb的乙酰輔酶A羧化酶基因 PCR片段Ndel/EcoRI ;所述的質粒載體II的構建方 法是在質粒PIB139的Ndel/EcoRI位點插入來自DSMZ41398的4. 17kb的甲基丙二酰輔酶 A變位酶基因 PCR片段Ndel/EcoRI ;所述的質粒載體III的構建方法是在質粒pIB139的 Ndel/EcoRI位點插入來自DSMZ41398的1. 37kb的巴豆酰輔酶A還原酶基因 PCR片段Ndel/ EcoRI〇
4. 根據權利要求1所述增加前體物供應以提高鹽霉素發酵水平的方法，其特征在于： 所述的發酵是指將鏈霉菌孢子或者菌絲體在TSBY培養基中于33 °C、220轉/分鐘的轉速下 培養36?48小時后，轉接到種子培養基，于33°C、220轉/分鐘的轉速下培養16?20小 時后，再轉接到發酵培養基發酵9天。
5. 根據權利要求4所述增加前體物供應以提高鹽霉素發酵水平的方法，其特征在于： 所述TSBY培養基含有：TSB 3%，酵母提取物0.5%，蔗糖10. 3% ;所述種子培養基含有：葡萄糖4 %，黃豆餅粉3 %，酵母提取物1 %，碳酸鈣0. 2 % ;所述發酵培養基含有：胚芽粉 0. 8 %，黃豆餅粉0. 5 %，氯化鉀0. 22 %，氯化鈉0. 1 %，尿素0. 16 %，酒石酸0. 2 %，硫酸鎂 0.01%，磷酸氫二鉀0.01%，碳酸鈣0.5%，大豆油15%。
6. 根據權利要求4所述增加前體物供應以提高鹽霉素發酵水平的方法，其特征在于： 所述的轉接到種子培養基是將TSBY培養物按照3%的接種量轉接于種子培養基，所述的轉 接到發酵培養基是將種子培養物按照10 %的接種量轉接于發酵培養基。
【文檔編號】C12P17/18GK104357506SQ201410591377
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月28日 優先權日:2014年10月28日
【發明者】白林泉, 蘆晨陽, 蔣明, 康前進 申請人:上海交通大學