一種病原體核酸及耐藥性基因檢測試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及醫藥生物【技術領域】，尤其是一種病原體核酸及耐藥性基因檢測試劑盒及其應用技術。本發明設計的試劑盒包括以下兩種組成：PCR 反應緩沖液、酶混合液、沙眼衣原體/解脲支原體/人型支原體/耐藥性基因多重反應液；或PCR 反應緩沖液、酶混合液、沙眼衣原體/解脲支原體/人型支原體多重反應液、耐藥性基因反應液。本發明的試劑盒采用多重熒光定量PCR 技術，能在同一PCR 反應管中同時檢測多個靶標基因，為同時檢測病原體及其耐藥性基因提供有力技術支撐。其方法具有對樣本需要量少、成本低、操作簡便、靈敏度高，特異性好的特點，具有極大的社會和經濟意義。
【專利說明】-種病原體核酸及耐藥性基因檢測試劑盒及其應用
[0001]
【技術領域】
[0002] 本發明涉及醫藥生物【技術領域】，尤其是一種病原體核酸及耐藥性基因檢測試劑盒 及其應用，具體涉及一種沙眼衣原體/解脈支原體/人型支原體和耐藥性基因的試劑盒及 其應用。
【背景技術】
[0003] 性傳播疾病（STD)是一組全球性傳染病，主要通過性接觸傳播，部分STD則可通 過非性接觸傳播，比如通過共用針頭、哺乳甚至接觸傳播。
[0004] 目前STD在我國的發病率呈不斷上升的趨勢，其中由沙眼衣原體（化lamydia trachomatis, CT)、人型支原體（M. humenis, MH )和解脈支原體（Ureaplasma ureal^icum，UU) H種病原體引起的泌尿生殖道感染，已成為醫院婦科、皮膚性病科、泌尿 生殖科的常見疾病，為我國重點防治的對象。
[0005] 沙眼衣原體（CT)是一類在細胞內寄生的微生物，革蘭氏陰性。目前發現它有15 個血清型，不同的血清型能引起不同的疾病。沙眼衣原體可W引起沙眼、包涵體包膜炎、泌 尿生殖道感染、性病淋己肉芽腫等疾病。非淋菌性尿道炎（NGU)的40%?50%是由沙眼衣 原體感染引起的；為全國監測病種。
[0006] 解脈支原體（UU)是脈原體屬中的一種，是人類泌尿生殖道常見的寄生菌之一，是 非淋球菌性尿道炎（NGU)的常見病原體之一。解脈支原體多寄生在男性尿道、陰莖包皮和 女性陰道。若上行感染，可引起男性前列腺炎或附睪炎、女性陰道炎、宮頸炎，并可感染胎兒 導致流產、早產及低體重胎兒，也能引起新生兒呼吸道和中樞神經系統的感染。
[0007] 人型支原體（MH)是支原體的一種，寄居于人的泌尿生殖道，是引起泌尿生殖道感 染，尤其是女性泌尿生殖道感染的常見病原之一，可引起女性盆腔炎、腎孟腎炎、陰道炎等 疾病。
[0008] 近年來由于支原體衣原體引起的生殖道感染等疾病逐年增加，加上不規范治療和 盲目用藥，耐藥菌株不斷增加，對各種抗菌藥物的敏感性均顯著降低，療效也逐漸下降，抗 生素的耐藥性問題日益突出。耐藥菌的快速準確的檢測，在合理使用抗生素及減少耐藥性 發生和傳播等方面有重要意義。其中四環素類耐藥尤為嚴重。
[0009] 培養法 目前，臨床上人型支原體（MH)、解脈支原體扣U)及沙眼衣原體（CT)及耐藥性檢測方法 主要是病原體的分離培養。但培養法檢測耗時長，一般需經48-72小時才能得到結果；靈 敏度低，受采集、運送、保存等影響較大，容易出現假陰性結果；操作煩瑣，導致各種操作的 結果判別標準難W統一，需要的技術和設備要求高。免疫學方法相比培養法有了長足的進 步，但是因為生殖道微生物之間存在的交叉反應使得該方法的特異性受到影響，容易出現 假陽性反應，給治療帶來誤判的可能。病原體的多重實時英光定量PCR檢測可W快速準確 的確定病原體種類及耐藥性基因，可在臨床上作為早期快速診斷的方法，給病原體的用藥 選擇及用藥后監控，提供有力的技術支撐。目前臨床上還沒有相關同時檢測病原體與耐藥 性基因的產品。
[0010] 英光定量PCR檢測技術融匯了 PCR的靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術精確 定量的優點，是目前臨床檢驗中認同程度很高的一種檢測技術，已廣泛應用于科學研究和 臨床檢測。但多重英光定量PCR由于其技術難度在臨床上的應用才剛剛開始。目前已上市 產品中絕大多數為單通道檢測，只能進行單重PCR反應，一個PCR反應管一次反應只能檢測 一種基因或病原體，不能特異地對多個祀標基因或病原體進行檢測，且臨床上沒有相關方 法的支原體耐藥性檢測試劑。
【發明內容】
[0011] 為了克服現有技術的不足，本發明提供了一種病原體核酸及耐藥性基因檢測試劑 盒及其應用。
[0012] 一、本發明解決其技術問題所采用的技術方案是；一種病原體核酸及耐藥性基因 檢測試劑盒，該試劑盒包括W下各組組分： PCR反應液、酶混合液、沙眼衣原體/解脈支原體/人型支原體/耐藥性基因多重反應 液； 所述的沙眼衣原體/解脈支原體/人型支原體/耐藥性基因多重反應液包括W下組 分： 組分（1);由一對檢測沙眼衣原體的引物和一條檢測沙眼衣原體的探針組成；其中，兩 條引物的堿基序列分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示；探針的堿基序列為SEQ ID No. 3所示，該探針的5'端標記有英光報告基團，3'端標記有英光渾滅基團； 組分（2);由一對檢測解脈支原體的引物和一條檢測解脈支原體的探針組成；其中，兩 條引物的堿基序列分別為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；探針的堿基序列為SEQID No. 6所示，該探針的5'端標記有英光報告基團，3'端標記有英光渾滅基團； 組分（3);由一對檢測人型支原體的引物和一條檢測人型支原體的探針組成；其中，兩 條引物的堿基序列分別為SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示；探針的堿基序列為SEQID No. 9所示，該探針的5'端標記有英光報告基團，3'端標記有英光渾滅基團； 組分（4);由一對檢測解脈支原體四環素類藥物的耐藥性基因的引物和一條檢測解脈 支原體四環素類藥物的耐藥性基因的探針組成；其中，兩條引物的堿基序列分別為SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示；探針的堿基序列為SEQ ID No. 12所示，該探針的5'端標記 有英光報告基團，3'端標記有英光渾滅基團。
[0013] 二、根據本發明的另一個實施例，進一步包括所述試劑盒包括W下組分： PCR反應液、酶混合液、沙眼衣原體/解脈支原體/人型支原體多重反應液、耐藥性基 因反應液； 所述沙眼衣原體/解脈支原體/人型支原體多重反應液包含W下組分： 組分（1);由一對檢測沙眼衣原體的引物和一條檢測沙眼衣原體的探針組成；其中，兩 條引物的堿基序列分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示；探針的堿基序列為SEQ ID No. 3所示，該探針的5'端標記有英光報告基團，3'端標記有英光渾滅基團； 組分（2);由一對檢測解脈支原體的引物和一條檢測解脈支原體的探針組成；其中，兩 條引物的堿基序列分別為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；探針的堿基序列為SEQID No. 6所示，該探針的5'端標記有英光報告基團，3'端標記有英光渾滅基團； 組分（3);由一對檢測人型支原體的引物和一條檢測人型支原體的探針組成；其中，兩 條引物的堿基序列分別為SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示；探針的堿基序列為SEQID No. 9所示，該探針的5'端標記有英光報告基團，3'端標記有英光渾滅基團； 所述耐藥性基因反應液包含W下組分： 組分；由一對檢測解脈支原體四環素類藥物的耐藥性基因的引物和一條檢測解脈支原 體四環素類藥物的耐藥性基因探針組成；其中，兩條引物的堿基序列分別為SEQ ID No. 10 和SEQ ID No. 11所示；探針的堿基序列為SEQ ID No. 12所示，該探針的5'端標記有英光 報告基團，3'端標記有英光渾滅基團。
[0014] H、根據本發明的另一個實施例，進一步包括該試劑盒還包括有組分；陽性對照一 和陰性對照。
[0015] 四、根據本發明的另一個實施例，進一步包括該試劑盒還包括有組分；陽性對照二 和陰性對照。
[0016] 五、根據本發明的另一個實施例，進一步包括所述的英光報告基團選自FAM、VIC、 肥X、R0X、CY3或CY5英光報告基團，且沙眼衣原體/解脈支原體/人型支原體/耐藥性基 因多重反應液中組分（1)、組分（2)、組分（3)和組分（4)中的英光報告基團各不相同。
[0017] 六、根據本發明的另一個實施例，進一步包括所述的英光報告基團選自FAM、VIC、 肥X、R0X、CY3或CY5英光報告基團，且沙眼衣原體/解脈支原體/人型支原體多重反應液 中組分（1)、組分（2)和組分（3)的英光報告基團各不相同。
[0018] 走、根據本發明的另一個實施例，進一步包括所述的英光渾滅基團選自皿Q1、 B冊2、B冊3、D油巧1和Tamra任意四種英光渾滅基團。
[0019] 八、根據本發明的另一個實施例，進一步包括所述的PCR反應液包括10X緩沖液、 25mM MgC12、10mM dUTP 和 lOmM dNTPs。
[0020] 九、根據本發明的另一個實施例，進一步包括所述的酶混合液包括化q酶和UNG 酶，所述的化q酶為熱啟動化q酶，所述的UNG酶為尿嚼巧-N-糖基化酶。
[0021] 十、根據本發明的另一個實施例，進一步包括所述的陽性對照一包括W下組分： 組分（1);為含有部分沙眼衣原體（CT)的質粒pSoto址8基因片段，大小為16化P，此 基因片段核巧酸序列為SEQ ID No. 13 ; 組分（2);為含有部分解脈支原體扣U)16S核糖體RNA基因片段，大小為164bp，此基 因片段核巧酸序列為SEQ ID No. 14 ; 組分（3);為含有部分人型支原體GAP基因片段，大小為16化p，此基因片段核巧酸序列 為沈Q ID No. 15 ; 組分（4);為含有部分解脈支原體扣U)四環素耐藥化916基因片段，大小為40化p，此 基因片段核巧酸序列為SEQ ID No. 16 十一、根據本發明的另一個實施例，進一步包括所述的陽性對照二包括兩種組合： 組合1包含W下組分： 組分（1);為含有部分沙眼衣原體（CT)的質粒pSoto址8基因片段，大小為16化P，此 基因片段核巧酸序列為SEQ ID No. 13 ; 組分（2);為含有部分解脈支原體扣U)16S核糖體RNA基因片段，大小為164bp，此基 因片段核巧酸序列為SEQ ID No. 14 ; 組分（3);為含有部分人型支原體GAP基因片段，大小為16化p，此基因片段核巧酸序列 為沈Q ID No. 15 ; 組合2包含W下組分： 為含有部分解脈支原體扣U)四環素耐藥化916基因片段，大小為40化P，此基因片段核 巧酸序列為SEQ ID No. 16。
[0022] 十二、根據本發明的另一個實施例，進一步包括所述的陰性對照為無菌水。
[0023] 十H、本發明還進一步包括該試劑盒在非淋球菌性尿道炎、W及不孕不育常見病 原體檢測中的應用。
[0024] 本發明的有益效果是： (1)本發明的試劑盒能夠同時檢測出沙眼衣原體/解脈支原體/人型支原體和耐藥性 基因，填補了現有英光定量PCR產品只能檢測性病病原體不能檢測耐藥基因的空白。
[00巧](2)本發明還具有靈敏度高、特異性好、可重復性強、檢測結果快速客觀、且可節約 成本等優點，在沙眼衣原體/解脈支原體/人型支原體和耐藥性基因體外診斷領域具有極 大的應用前景。
[002引（2)本試劑盒操作簡便且能有效防止污染，PCR英光檢測時間（從標本處理開始） 僅為2-3小時，PCR英光檢測是全封閉操作，加入待測樣本核酸提取物之后可W不再打開 管蓋，減少了污染產生的機會。反應液中加入了 UNG酶，防止了擴增產物的污染。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027] 下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
[0028] 圖1是本發明試劑盒參考品檢測的曲線圖。
[0029] 圖2是本發明試劑盒檢測人型支原體（MH)靈敏度試驗結果圖。
[0030] 圖3是本發明試劑盒檢測解脈支原體（UU)的靈敏度試驗結果圖。
[0031] 圖4是本發明試劑盒檢測沙眼衣原體（CT)的靈敏度試驗結果圖。
[0032] 圖5是本發明試劑盒檢測四環素類類藥物靈敏度試驗結果圖。
[0033] 圖6是本發明試劑盒檢測人型支原體（MH)的特異性試驗結果圖。
[0034] 圖7是本發明試劑盒檢測解脈支原體（UU)的特異性試驗結果圖。
[00巧]圖8是本發明試劑盒檢測沙眼衣原體（CT)的特異性試驗結果圖。
[0036] 圖9是本發明試劑盒檢測四環素類類藥物的特異性試驗結果圖。
【具體實施方式】
[0037] 下面結合附圖1?9及實施例對本發明作進一步的詳細說明。
[0038] 實施例一 試劑盒包括W下組分： PCR反應液、酶混合液、沙眼衣原體/解脈支原體/人型支原體/耐藥性基因多重反應 液、陽性對照一、陰性對照； PCR 反應液包括 lOX 緩沖液、25mM MgC12、10mM 加TP 和 lOmM dNTPs ; 酶混合液包括化q酶和UNG酶，所述的化q酶為熱啟動化q酶，所述的UNG酶為尿嚼 巧-N-糖基化酶。
[0039] 沙眼衣原體/解脈支原體/人型支原體/耐藥性基因多重反應液上游下游引物、 及探針的配比為；6:4:2 ;優選的上游引物為600nM，下游引物為400nM，探針為200nM。
[0040] 本實施例中使用的人型支原體、解脈支原體、沙眼衣原體及解脈支原體四環素耐 藥基因的引物和探針的核巧酸序列可參見表1。
[0041] 表1本發明中人型支原體、解脈支原體、沙眼衣原體及解脈支原體四環素耐藥基 因的引物和探針的核巧酸序列表
【權利要求】
1. 一種病原體核酸及耐藥性基因檢測試劑盒，其特征是，該試劑盒包括以下各組組 分： PCR反應液、酶混合液、沙眼衣原體/解脲支原體/人型支原體/耐藥性基因多重反應 液； 所述的沙眼衣原體/解脲支原體/人型支原體/耐藥性基因多重反應液包括以下組 分： 組分（1):由一對檢測沙眼衣原體的引物和一條檢測沙眼衣原體的探針組成；其中，兩 條引物的喊基序列分別為SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所不；探針的喊基序列為SEQID No. 3所示，該探針的5'端標記有熒光報告基團，3'端標記有熒光淬滅基團； 組分（2):由一對檢測解脲支原體的引物和一條檢測解脲支原體的探針組成；其中，兩 條引物的喊基序列分別為SEQIDNo. 4和SEQIDNo. 5所不；探針的喊基序列為SEQID No. 6所示，該探針的5'端標記有突光報告基團，3'端標記有突光淬滅基團； 組分（3):由一對檢測人型支原體的引物和一條檢測人型支原體的探針組成；其中，兩 條引物的喊基序列分別為SEQIDNo. 7和SEQIDNo. 8所不；探針的喊基序列為SEQID No. 9所不，該探針的5'端標記有突光報告基團，3'端標記有突光洋滅基團； 組分（4):由一對檢測解脲支原體四環素類藥物的耐藥性基因的引物和一條檢測解脲 支原體四環素類藥物的耐藥性基因的探針組成；其中，兩條引物的堿基序列分別為SEQID No. 10和SEQIDNo. 11所示；探針的堿基序列為SEQIDNo. 12所示，該探針的5'端標記 有熒光報告基團，3'端標記有熒光淬滅基團。
2. 根據權利要求1所述的一種病原體核酸及耐藥性基因檢測試劑盒，其特征是，所述 試劑盒包括以下組分： PCR反應液、酶混合液、沙眼衣原體/解脲支原體/人型支原體多重反應液、耐藥性基 因反應液； 所述沙眼衣原體/解脲支原體/人型支原體多重反應液包含以下組分： 組分（1):由一對檢測沙眼衣原體的引物和一條檢測沙眼衣原體的探針組成；其中，兩 條引物的喊基序列分別為SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所不；探針的喊基序列為SEQID No. 3所示，該探針的5'端標記有熒光報告基團，3'端標記有熒光淬滅基團； 組分（2):由一對檢測解脲支原體的引物和一條檢測解脲支原體的探針組成；其中，兩 條引物的喊基序列分別為SEQIDNo. 4和SEQIDNo. 5所不；探針的喊基序列為SEQID No. 6所示，該探針的5'端標記有突光報告基團，3'端標記有突光淬滅基團； 組分（3):由一對檢測人型支原體的引物和一條檢測人型支原體的探針組成；其中，兩 條引物的喊基序列分別為SEQIDNo. 7和SEQIDNo. 8所不；探針的喊基序列為SEQID No. 9所不，該探針的5'端標記有突光報告基團，3'端標記有突光洋滅基團； 所述耐藥性基因反應液包含以下組分： 組分：由一對檢測解脲支原體四環素類藥物的耐藥性基因的引物和一條檢測解脲支原 體四環素類藥物的耐藥性基因探針組成；其中，兩條引物的堿基序列分別為SEQIDNo. 10 和SEQIDNo. 11所示；探針的堿基序列為SEQIDNo. 12所示，該探針的5'端標記有突光 報告基團，3'端標記有熒光淬滅基團。
3. 根據權利要求1 一種病原體核酸及耐藥性基因檢測試劑盒，其特征是，該試劑盒還 包括有組分：陽性對照一和陰性對照。
4. 根據權利要求2 -種病原體核酸及耐藥性基因檢測試劑盒，其特征是，該試劑盒還 包括有組分：陽性對照二和陰性對照。
5. 根據權利要求1所述的一種病原體核酸及耐藥性基因檢測試劑盒，其特征是，所述 的熒光報告基團選自FAM、VIC、HEX、ROX、CY3或CY5熒光報告基團，且沙眼衣原體/解脲 支原體/人型支原體/耐藥性基因多重反應液中組分（1)、組分（2)、組分（3)和組分（4)中 的突光報告基團各不相同。
6. 根據權利要求2所述的一種病原體核酸及耐藥性基因檢測試劑盒，其特征是，所述 的熒光報告基團選自FAM、VIC、HEX、ROX、CY3或CY5熒光報告基團，且沙眼衣原體/解脲 支原體/人型支原體多重反應液中組分（1)、組分（2)和組分（3)的熒光報告基團各不相同。
7. 根據權利要求1或權利要求2所述的一種病原體核酸及耐藥性基因檢測試劑盒，其 特征是，所述的熒光淬滅基團選自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl和Tamra任意四種熒光淬滅 基團。
8. 根據權利要求1或權利要求2所述的一種病原體核酸及耐藥性基因檢測試劑盒，其 特征是，所述的PCR反應液包括10X緩沖液、25mMMgC12、10mMdUTP和10mMdNTPs。
9. 根據權利要求1或權利要求2所述的一種病原體核酸及耐藥性基因檢測試劑盒，其 特征是，所述的酶混合液包括Taq酶和UNG酶，所述的Taq酶為熱啟動Taq酶，所述的UNG 酶為尿嘧啶-N-糖基化酶。
10. 根據權利要求3所述的一種病原體核酸及耐藥性基因檢測試劑盒，其特征是，所述 的陽性對照一包括以下組分： 組分（1):為含有部分沙眼衣原體（CT)的質粒pSotonE8基因片段，大小為166bp，此 基因片段核苷酸序列為SEQIDNo. 13 (具體序列見表2,以下涉及陽性對照核苷酸序列均 見表2); 組分（2):為含有部分解脲支原體（UU)16S核糖體RNA基因片段，大小為164bp，此基 因片段核苷酸序列為SEQIDNo. 14 ; 組分（3):為含有部分人型支原體GAP基因片段，大小為160bp，此基因片段核苷酸序列 為SEQIDNo. 15 ; 組分（4):為含有部分解脲支原體（UU)四環素耐藥Tn916基因片段，大小為406bp，此 基因片段核苷酸序列為SEQIDNo. 16。
11. 根據權利要求4所述的一種病原體核酸及耐藥性基因檢測試劑盒，其特征是，所述 的陽性對照二包括兩種組合： 組合1包含以下組分： 組分（1):為含有部分沙眼衣原體（CT)的質粒pSotonE8基因片段，大小為166bp，此 基因片段核苷酸序列為SEQIDNo. 13 ; 組分（2):為含有部分解脲支原體（UU)16S核糖體RNA基因片段，大小為164bp，此基 因片段核苷酸序列為SEQIDNo. 14 ; 組分（3):為含有部分人型支原體GAP基因片段，大小為160bp，此基因片段核苷酸序列 為SEQIDNo. 15 ; 組合2包含以下組分： 為含有部分解脲支原體（UU)四環素耐藥Tn916基因片段，大小為406bp，此基因片段核 苷酸序列為SEQIDNo. 16。
12. 根據權利要求1或權利要求2的一種病原體核酸及耐藥性基因檢測試劑盒，其特征 是，所述的陰性對照為無菌水。
13. 根據權利要求1~12所述的一種病原體核酸及耐藥性基因檢測試劑盒在非淋球菌 性尿道炎、以及不孕不育常見病原體檢測中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104513854SQ201410591197
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2014年10月29日 優先權日:2014年10月29日
【發明者】孔祥賓, 夏國慶, 丁燕芬, 朱嘯悅 申請人:常州百代生物科技有限公司