作為昆蟲控制劑的dsrna的制作方法

作為昆蟲控制劑的dsrna的制作方法
【專利摘要】本發明涉及使用雙鏈RNA分子來控制有害生物侵襲的方法。本發明提供了制備表達所述雙鏈RNA分子的轉基因植物的方法，以及通過本發明植物生產的殺蟲劑和商品產品。
【專利說明】作為屋蟲控制劑的DSRNA
[000。 本申請為2006年9月18日提交的、發明名稱為"作為昆蟲控制劑的DSRNA"的PCT 申請PCT/IB2006/004003的分案申請，所述PCT申請進入中國國家階段的日期為2008年5 月16日，申請號為200680042821. 5。 發明領域
[0002] -般而言，本發明涉及對有害生物（pest)侵襲的遺傳學控制。更具體地，本發明 涉及雙鏈RNA重組技術，用于阻遏或抑制有害生物中祀編碼序列的表達。
[0003] 導論
[0004] 環境中充滿有害生物，人們已經試圖使用多種方法來控制有害生物對植物的侵 襲。用于控制顯微有害生物侵襲的組合物已經W抗生素、抗病毒和抗真菌組合物的形式提 供。通常，用于控制較大有害生物（例如，線蟲）侵襲的方法是化學組合物的形式，其被應 用于有害生物駐留的表面，或者W小丸、散劑、片劑、糊劑或膠囊劑的形式施用給受侵襲的 動物。
[0005] 商業作物通常是昆蟲攻擊的目標。過去數十年來已經做出了相當的進展，開發出 了更高效的方法和組合物用于控制植物中的昆蟲侵襲。化學殺蟲劑對于根除有害生物侵襲 非常有用。然而，使用化學殺蟲劑有若干種缺點。化學殺蟲劑有可能對于環境有害，而且， 化學殺蟲劑還不是選擇性的，其對于多種作物和非祀標動物群體同樣有害。化學殺蟲劑持 續存在于環境中，通常代謝得很慢（如果有代謝）。它們在食物鏈中積累，特別是高等食肉 動物物種中。該些化學殺蟲物質的積累導致對該些物質抗性的發展，并且可能在進化梯中 高等的物種中，成為誘變劑和/或致癌物，導致不可逆的和有害的遺傳修飾。
[0006] 因為與化學殺蟲劑相關的該些危險，已經開發了分子手段來控制植物上的有害生 物侵襲。例如，蘇云金芽抱桿菌炬acillus thuringiensis)炬.t.)細菌已經可商業獲得， 其在超過H十年來用作為環境安全的、可接受的殺昆蟲劑。化學殺蟲物質應用的減少已經 產生了更干凈的±壤，W及從從±壤流入周圍溪流、河流、池塘和湖泊的更干凈的水。除了 該些環境益處之外，由于化學殺昆蟲物質使用的減少，在生長轉基因昆蟲抗性作物的作物 田間，有益昆蟲數量也顯著增加了。
[0007] RNA干擾（RNAi)提供了用于控制基因表達的潛在的強大工具，因為其能特異 性祀向選擇，并且W顯著高的效率進行祀向mRNA遏制。RNAi指通過短干擾RNA(SiRNA) 介導的序列特異性轉錄后基因沉默狂amore，P.等人，Cell 101:25-33(2000) ;Fire，A. 等人，化1:腳6 391:806(1998);化 milton 等人，Science 286, 950-951(1999) ;Lin 等 人，化化re 402:128-129(1999))。雖然RNAi的機制還沒有獲得完全表征，但是人們認為， 細胞中dsRNA的存在通過激活核糖核酸酶III切酶來觸發RNAi Gamore, P.等人，（2000); Hammond等人，化化re 404,293(2000))。切酶將的dsRNA加工為短片段，其被稱為短干 擾RNA(SiRNA)，其為大約21至大約23個核巧酸長，包含約19個堿基對雙鏈體狂amore等 人，（2000) ;E化ashir 等人，Genes Dev. ,15, 188 (2001))。遞送進細胞后，SiRNA 分子與內 切核酸酶復合物相關聯，該復合體通常被稱為RNA誘導性沉默復合物巧ISC)，其將SiRNA的 反義鏈和細胞mRNA基因祀帶到一起。RISC切割mRNA，然后所述mRNA釋放并被降解。重要 地，然后RISC能降解祀mRNA的額外拷貝。
[0008] 因此，本發明提供了通過阻遏、延遲或降低特定有害生物中的基因表達來控制有 害生物侵襲的方法和組合物。


【發明內容】

[0009] 在一個方面，本發明提供了經分離的核巧酸序列，其包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、 11、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160-163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、 215、220、225、230、240-247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、 498、503、508-513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、 609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、 878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066-1071、1073、 1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、1099、1101'1103、 1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、 1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、 1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、 2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、 2120 - 2338、2339、2344、2：349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、 2466、2471、2476和2481中示出的核酸序列。在一種實施方案中，本發明提供了雙鏈核糖 核巧酸序列，其是多核巧酸序列的表達產生的，其中，植物的有害生物攝入所述核糖核巧酸 序列能抑制所述有害生物的生長。在又一實施方案中，攝入所述序列抑制與所述序列充分 互補的核巧酸序列的表達。在另一實施方案中，用該多核巧酸轉化細胞。在還一實施方案 中，用該多核巧酸轉化植物或植物細胞。在又一實施方案中，從經轉化的植物產生種子或產 品。在再一實施方案中，產品選自食品、飼料、纖維、紙、餐食、蛋白質、淀粉、面粉、青膽飼料、 咖啡、茶和油構成的組。
[0010] 在另一實施方案中，本發明提供了與 SEQ ID N0s:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、 21、23、49 - 158、159、160-163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、 230、240-247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、 508-513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621" 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、 890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066-1071、1073、1075、1077、 1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101'1103、1105、1107、 1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、 1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、 1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、 2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、 2339、2：344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、 2476和2481中的任何序列示出的核酸序列具有至少70%序列同一性的核巧酸序列。在 一種實施方案中，本發明提供了雙鏈核糖核巧酸序列，其是多核巧酸序列的表達產生的，其 中，植物的有害生物攝入所述核糖核巧酸序列能抑制所述有害生物的生長。在又一實施方 案中，攝入所述序列抑制與所述序列充分互補的核巧酸序列的表達。在另一實施方案中，用 該多核巧酸轉化細胞。在還一實施方案中，用該多核巧酸轉化植物或植物細胞。在又一實施 方案中，從經轉化的植物產生種子或產品。在再一實施方案中，產品選自食品、飼料、纖維、 紙、餐食、蛋白質、淀粉、面粉、青膽飼料、咖啡、茶和油。
[0011] 在另一方面，本發明提供了包含 SEQ ID N0s:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、 23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、 247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、 519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、 783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、 896、908-1040、1041'1046'1051'1056、1061'1071'1073'1075'1077、1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 中任 何序列或其互補序列的至少17個連續核巧酸的基因的直向同源物。在一種實施方案中，本 發明提供了雙鏈核糖核巧酸序列，其是多核巧酸序列的表達產生的，其中，植物的有害生物 攝入所述核糖核巧酸序列能抑制所述有害生物的生長。在又一實施方案中，攝入所述序列 抑制與所述序列充分互補的核巧酸序列的表達。在另一實施方案中，用該多核巧酸轉化細 胞。在還一實施方案中，用該多核巧酸轉化植物或植物細胞。在又一實施方案中，從經轉化 的植物產生種子或產品。在再一實施方案中，產品選自食品、飼料、纖維、紙、餐食、蛋白質、 淀粉、面粉、青膽飼料、咖啡、茶和油。
[0012] 在另一個方面，本發明提供了包含源自有害生物物種的雙鏈核糖核酸序列的植 物。在一種實施方案中，有害生物選自昆蟲、蜘蛛類、甲殼類、真菌、細菌、病毒、線蟲、扁形動 物、蝴蟲、燒蟲、鉤蟲、緣蟲、錐蟲、血吸蟲、狂禍、跳圣、壁風、峨和風。在另一實施方案中，植 物是胞質雄性不育的。在另一實施方案中，序列能抑制有害生物的生物學活性。在另一實 施方案中，序列能抑制祀序列的表達。在又一實施方案中，祀序列是昆蟲、線蟲、細菌或真菌 序列。
[0013] 在另一個方面，本發明提供了控制有害生物侵襲的方法，所述方法包括；向有害 生物提供植物材料，所述植物材料包含能抑制有害生物生物學活性的多核巧酸序列。在一 種實施方案中，所述多核巧酸序列是569 10^:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160-163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240-247、 249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、508-513、515、517、 519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、 783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、 908-1040、1041'1046、1051'1056、1061'1066-1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 I161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：M9、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 中的 任何序列或其互補序列示出的。
[0014] 在另一個方面，本發明提供了包含表達祀多核巧酸序列的植物的殺蟲劑。
[0015] 在另一個方面，本發明提供了一種方法，用于控制有害生物侵襲，所述方法包括： (a)鑒定出有害生物中的祀序列；化）將所述序列引入植物；W及（C)向所述有害生物提供 所述植物或其部分。
[0016] 在另一個方面，本發明提供了一種方法，用于控制有害生物侵襲，所述方法包括： (a)鑒定出第一有害生物物種中的祀序列；化）搜索出第二有害生物物種中的直向同源祀 序列；(C)將所述直向同源序列引入植物；W及（d)向所述第二有害生物提供所述植物或其 部分。在另一實施方案中，所述祀是來自馬鈴墓葉甲（Ldecemlineata)的基因，所述植物 選自金合歡、首薦、蘋果、杏、朝鮮葫、白蠟樹、天口冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜化eet)、 禪木、山毛棒、黑霉、藍霉、挪菜、抱子甘藍、甘藍、卡諾拉油菜（canola)、甜瓜、胡蘿K木墓、 花挪菜、雪松、谷類、芹菜、栗、禮、大白菜、巧橘、克萊口氏小巧橘、H葉草、咖啡、棉、班豆、黃 瓜、柏木、茄子、偷、宦賣菜（endive)、按樹、茵香、無花果、冷杉、老鶴草、葡萄、葡萄抽、落花 生、酸漿、橡膠鐵杉（gum hemlock)、山核桃、羽衣甘藍、縣猴桃、孽藍、落葉松、窩宦、韭蔥、 巧樣、來樣、洋槐、松、鐵線藤、玉米、芒果、械樹、瓜、泰、磨茹、白芥、堅果、橡樹、燕麥、秋葵、 蔥、枯、觀賞植物或花或樹、番木瓜、蹤擱、歐芹、歐洲防風草、魏豆、桃、花生、梨、沼澤植物 (peat)、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石惱、馬鈴墓、西葫蘆、菊宦（radicchio)、蘿 K油菜（rapeseed)、息鉤子、稻、黑麥、高梁、柳樹、玻菜、云杉、南瓜、草霉、糖蘿K甘藏、向 日葵、甘墓、甜玉米、紅枯（tangerine)、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、憲青、蔓生植物、 核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、墓葫、紅豆杉和夏南瓜。
[0017] 在另一個方面，本發明提供了一種方法，用于提高作物產量，所述方法包括（a)向 植物中引入多核巧酸；W及化）種植所述植物，W令多核巧酸表達，其中，所述表達抑制有 害生物進食（feeding) W及由于有害生物侵襲導致的產量損失。在一種實施方案中，所述 有害生物選自昆蟲、線蟲和真菌。在另一實施方案中，多核巧酸表達產生下述RNA分子，其 能在攝入了所述作物植物的一部分的昆蟲有害生物中遏制下述祀基因，其中，所述祀基因 執行選自W下的至少一種重要功能：有害生物進食、有害生物生存能力（Vi油ility)、有害 生物細胞調亡、有害生物或任何有害生物細胞的分化和發育、有害生物的有性繁殖、肌肉形 成、肌肉顫搖、肌肉收縮、保幼激素形成和/或降低、保幼激素調節、離子調節和轉運、細胞 膜電位保持、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子形成、信息素合成、信息素感知、觸角形成、 翅膀形成、腿形成、卵形成、幼蟲成熟、消化酶形成、血淋己合成、血淋己保持、神經傳遞、幼 蟲期轉換、蛹化、從蛹化出現、細胞分裂、能量代謝、呼吸、細胞骨架結構合成和保持、核巧酸 代謝、氮代謝、水的使用、水駐留和感知。
[0018] 在另一個方面，本發明提供了一種方法，用于生產商品產品，所述方法包括；(a) 鑒定出有害生物中的祀序列；(b)將所述序列引入植物細胞；（C)在適于產生植物的條件下 培養所述植物細胞；W及（d)從所述植物或其部分來生產商品產品。在另一實施方案中，所 述祀是來自馬鈴墓葉甲的基因，所述植物選自金合歡、首薦、蘋果、杏、朝鮮葫、白蠟樹、天口 冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜化eet)、禪木、山毛棒、黑霉、藍霉、挪菜、抱子甘藍、甘藍、卡 諾拉油菜（canola)、甜瓜、胡蘿K木墓、花挪菜、雪松、谷類、芹菜、栗、禮、大白菜、巧橘、克 萊口氏小枯橘、立葉草、咖啡、棉、班豆、黃瓜、柏木、茄子、偷、宦賣菜（endive)、按樹、茵香、 無花果、冷杉、老鶴草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸漿、橡膠鐵杉（gum hemlock)、山核桃、羽衣 甘藍、縣猴桃、孽藍、落葉松、窩宦、韭蔥、巧樣、來樣、洋槐、松、鐵線藤、玉米、芒果、械樹、瓜、 泰、磨茹、白芥、堅果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、枯、觀賞植物或花或樹、番木瓜、蹤擱、歐芹、歐洲 防風草、魏豆、桃、花生、梨、沼澤植物（peat)、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石惱、 馬鈴墓、西葫蘆、菊宦（radicchio)、蘿K油菜（rapeseed)、息鉤子、稻、黑麥、高梁、柳樹、 玻菜、云杉、南瓜、草霉、糖蘿K甘藏、向日葵、甘墓、甜玉米、紅枯（tangerine)、茶、煙草、番 茄、樹、黑小麥、草坪草、憲青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、墓葫、紅豆杉和夏南瓜。
[0019] 在另一實施方案中，所述碑1是來自辣根猿葉甲化cochleariae)的基因，所述植 物選自金合歡、首薦、蘋果、杏、朝鮮葫、白蠟樹、天口冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、禪木、 山毛棒、黑霉、藍霉、挪菜、抱子甘藍、甘藍、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿K木墓、花挪菜、雪松、 谷類、芹菜、栗、禮、大白菜、枯橘、克萊n氏小枯橘、H葉草、咖啡、棉、班豆、黃瓜、柏木、茄 子、偷、宦賣菜、按樹、茵香、無花果、冷杉、老鶴草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山 核桃、羽衣甘藍、縣猴桃、孽藍、落葉松、窩宦、韭蔥、巧樣、來樣、洋槐、松、鐵線藤、玉米、芒 果、械樹、瓜、泰、磨茹、白芥、堅果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、枯、觀賞植物或花或樹、番木瓜、蹤 擱、歐芹、歐洲防風草、魏豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、 石惱、馬鈴墓、西葫蘆、菊宦、蘿K油菜、息鉤子、稻、黑麥、高梁、柳樹、玻菜、云杉、南瓜、草 霉、糖蘿K甘藏、向日葵、甘墓、甜玉米、紅枯、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、憲青、蔓 生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、墓葫、紅豆杉和夏南瓜。
[0020] 在另一實施方案中，所述祀是來自墨西哥豆瓢蟲巧.varivetis)的基因，所述植 物選自金合歡、首薦、蘋果、杏、朝鮮葫、白蠟樹、天口冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、禪木、 山毛棒、黑霉、藍霉、挪菜、抱子甘藍、甘藍、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿K木墓、花挪菜、雪松、 谷類、芹菜、栗、禮、大白菜、巧橘、克萊口氏小巧橘、H葉草、咖啡、棉、班豆、黃瓜、柏木、茄 子、偷、宦賣菜、按樹、茵香、無花果、冷杉、老鶴草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山 核桃、羽衣甘藍、縣猴桃、孽藍、落葉松、窩宦、韭蔥、巧樣、來樣、洋槐、松、鐵線藤、玉米、芒 果、械樹、瓜、泰、磨茹、白芥、堅果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、枯、觀賞植物或花或樹、番木瓜、蹤 擱、歐芹、歐洲防風草、魏豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、 石惱、馬鈴墓、西葫蘆、菊宦、蘿K油菜、息鉤子、稻、黑麥、高梁、柳樹、玻菜、云杉、南瓜、草 霉、糖蘿K甘藏、向日葵、甘墓、甜玉米、紅枯、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、憲青、蔓 生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、墓葫、紅豆杉和夏南瓜。
[0021] 在另一實施方案中，所述祀是來自墨西哥棉鈴象（A.grandis)的基因，所述植物 選自金合歡、首薦、蘋果、杏、朝鮮葫、白蠟樹、天口冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、禪木、山 毛棒、黑霉、藍霉、挪菜、抱子甘藍、甘藍、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿K木墓、花挪菜、雪松、谷 類、芹菜、栗、禮、大白菜、巧橘、克萊n氏小枯橘、立葉草、咖啡、棉、班豆、黃瓜、柏木、茄子、 偷、宦賣菜、按樹、茵香、無花果、冷杉、老鶴草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核 桃、羽衣甘藍、縣猴桃、孽藍、落葉松、窩宦、韭蔥、巧樣、來樣、洋槐、松、鐵線藤、玉米、芒果、 械樹、瓜、泰、磨茹、白芥、堅果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、枯、觀賞植物或花或樹、番木瓜、蹤擱、 歐芹、歐洲防風草、魏豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石 惱、馬鈴墓、西葫蘆、菊宦、蘿K油菜、息鉤子、稻、黑麥、高梁、柳樹、玻菜、云杉、南瓜、草霉、 糖蘿K甘藏、向日葵、甘墓、甜玉米、紅枯、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、憲青、蔓生植 物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、墓葫、紅豆杉和夏南瓜。
[0022] 在另一實施方案中，所述祀是來自赤擬谷盜（T. castaneum)的基因，所述植物選 自金合歡、首薦、蘋果、杏、朝鮮葫、白蠟樹、天口冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、禪木、山 毛棒、黑霉、藍霉、挪菜、抱子甘藍、甘藍、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿K木墓、花挪菜、雪松、谷 類、芹菜、栗、禮、大白菜、冊喬、克萊n氏小枯橘、立葉草、咖啡、棉、班豆、黃瓜、柏木、茄子、 偷、宦賣菜、按樹、茵香、無花果、冷杉、老鶴草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核 桃、羽衣甘藍、縣猴桃、孽藍、落葉松、窩宦、韭蔥、巧樣、來樣、洋槐、松、鐵線藤、玉米、芒果、 械樹、瓜、泰、磨茹、白芥、堅果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、枯、觀賞植物或花或樹、番木瓜、蹤擱、 歐芹、歐洲防風草、魏豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石 惱、馬鈴墓、西葫蘆、菊宦、蘿K油菜、息鉤子、稻、黑麥、高梁、柳樹、玻菜、云杉、南瓜、草霉、 糖蘿K甘藏、向日葵、甘墓、甜玉米、紅枯、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、憲青、蔓生植 物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、墓葫、紅豆杉和夏南瓜。
[0023] 在另一實施方案中，所述祀是來自桃閩（Epersicae)的基因，所述植物選自金合 歡、首薦、蘋果、杏、朝鮮葫、白蠟樹、天n冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、禪木、山毛棒、黑 霉、藍霉、挪菜、抱子甘藍、甘藍、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿K木墓、花挪菜、雪松、谷類、芹菜、 栗、禮、大白菜、枯橘、克萊口氏小枯橘、立葉草、咖啡、棉、班豆、黃瓜、柏木、茄子、偷、宦賣 菜、按樹、茵香、無花果、冷杉、老鶴草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣 甘藍、縣猴桃、孽藍、落葉松、窩宦、韭蔥、巧樣、來樣、洋槐、松、鐵線藤、玉米、芒果、械樹、瓜、 泰、磨茹、白芥、堅果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、枯、觀賞植物或花或樹、番木瓜、蹤擱、歐芹、歐洲 防風草、魏豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石惱、馬鈴墓、 西葫蘆、菊宦、蘿K油菜、息鉤子、稻、黑麥、高梁、柳樹、玻菜、云杉、南瓜、草霉、糖蘿K甘 藏、向日葵、甘墓、甜玉米、紅枯、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、憲青、蔓生植物、核桃、 豆瓣菜、西瓜、小麥、墓葫、紅豆杉和夏南瓜。
[0024] 在另一實施方案中，所述祀是來自褐飛風（N. Iugens)的基因，所述植物選自金合 歡、首薦、蘋果、杏、朝鮮葫、白蠟樹、天n冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、禪木、山毛棒、黑 霉、藍霉、挪菜、抱子甘藍、甘藍、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿K木墓、花挪菜、雪松、谷類、芹菜、 栗、禮、大白菜、枯橘、克萊n氏小枯橘、H葉草、咖啡、棉、班豆、黃瓜、柏木、茄子、偷、宦賣 菜、按樹、茵香、無花果、冷杉、老鶴草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣 甘藍、縣猴桃、孽藍、落葉松、窩宦、韭蔥、巧樣、來樣、洋槐、松、鐵線藤、玉米、芒果、械樹、瓜、 泰、磨茹、白芥、堅果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、枯、觀賞植物或花或樹、番木瓜、蹤擱、歐芹、歐洲 防風草、魏豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石惱、馬鈴墓、 西葫蘆、菊宦、蘿K油菜、息鉤子、稻、黑麥、高梁、柳樹、玻菜、云杉、南瓜、草霉、糖蘿K甘 藏、向日葵、甘墓、甜玉米、紅枯、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、憲青、蔓生植物、核桃、 豆瓣菜、西瓜、小麥、墓葫、紅豆杉和夏南瓜。
[00巧]在另一實施方案中，所述祀是來自二化頓（C. suppressalis)的基因，所述植物選 自金合歡、首薦、蘋果、杏、朝鮮葫、白蠟樹、天口冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、禪木、山 毛棒、黑霉、藍霉、挪菜、抱子甘藍、甘藍、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿K木墓、花挪菜、雪松、谷 類、芹菜、栗、禮、大白菜、巧橘、克萊n氏小枯橘、立葉草、咖啡、棉、班豆、黃瓜、柏木、茄子、 偷、宦賣菜、按樹、茵香、無花果、冷杉、老鶴草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核 桃、羽衣甘藍、縣猴桃、孽藍、落葉松、窩宦、韭蔥、巧樣、來樣、洋槐、松、鐵線藤、玉米、芒果、 械樹、瓜、泰、磨茹、白芥、堅果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、枯、觀賞植物或花或樹、番木瓜、蹤擱、 歐芹、歐洲防風草、魏豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石 惱、馬鈴墓、西葫蘆、菊宦、蘿K油菜、息鉤子、稻、黑麥、高梁、柳樹、玻菜、云杉、南瓜、草霉、 糖蘿K甘藏、向日葵、甘墓、甜玉米、紅枯、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、憲青、蔓生植 物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、墓葫、紅豆杉和夏南瓜。
[0026] 在另一實施方案中，所述祀是來自菜蛾（P.xylostella)的基因，所述植物選自金 合歡、首薦、蘋果、杏、朝鮮葫、白蠟樹、天口冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、禪木、山毛棒、 黑霉、藍霉、挪菜、抱子甘藍、甘藍、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿K木墓、花挪菜、雪松、谷類、芹 菜、栗、禮、大白菜、巧橘、克萊n氏小枯橘、立葉草、咖啡、棉、班豆、黃瓜、柏木、茄子、偷、宦 賣菜、按樹、茵香、無花果、冷杉、老鶴草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽 衣甘藍、縣猴桃、孽藍、落葉松、窩宦、韭蔥、巧樣、來樣、洋槐、松、鐵線藤、玉米、芒果、械樹、 瓜、泰、磨茹、白芥、堅果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、枯、觀賞植物或花或樹、番木瓜、蹤擱、歐芹、 歐洲防風草、魏豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石惱、馬 鈴墓、西葫蘆、菊宦、蘿K油菜、息鉤子、稻、黑麥、高梁、柳樹、玻菜、云杉、南瓜、草霉、糖蘿 K甘藏、向日葵、甘墓、甜玉米、紅枯、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、憲青、蔓生植物、 核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、墓葫、紅豆杉和夏南瓜。
[0027] 在另一實施方案中，所述祀是來自居屋艾幡（A. domesticus)的基因，所述植物選 自金合歡、首薦、蘋果、杏、朝鮮葫、白蠟樹、天口冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、禪木、山 毛棒、黑霉、藍霉、挪菜、抱子甘藍、甘藍、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿K木墓、花挪菜、雪松、谷 類、芹菜、栗、禮、大白菜、冊喬、克萊n氏小枯橘、立葉草、咖啡、棉、班豆、黃瓜、柏木、茄子、 偷、宦賣菜、按樹、茵香、無花果、冷杉、老鶴草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核 桃、羽衣甘藍、縣猴桃、孽藍、落葉松、窩宦、韭蔥、巧樣、來樣、洋槐、松、鐵線藤、玉米、芒果、 械樹、瓜、泰、磨茹、白芥、堅果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、枯、觀賞植物或花或樹、番木瓜、蹤擱、 歐芹、歐洲防風草、魏豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石 惱、馬鈴墓、西葫蘆、菊宦、蘿K油菜、息鉤子、稻、黑麥、高梁、柳樹、玻菜、云杉、南瓜、草霉、 糖蘿K甘藏、向日葵、甘墓、甜玉米、紅枯、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、憲青、蔓生植 物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麥、墓葫、紅豆杉和夏南瓜。
[0028] 在另一實施方案中，所述祀是來自真菌的基因，所述植物選自金合歡、首薦、蘋果、 杏、朝鮮葫、白蠟樹、天口冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、禪木、山毛棒、黑霉、藍霉、挪菜、 抱子甘藍、甘藍、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿K木墓、花挪菜、雪松、谷類、芹菜、栗、禮、大白菜、 巧橘、克萊口氏小巧橘、H葉草、咖啡、棉、班豆、黃瓜、柏木、茄子、偷、宦賣菜、按樹、茵香、無 花果、冷杉、老鶴草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍、縣猴桃、孽 藍、落葉松、窩宦、韭蔥、削i、來樣、洋槐、松、鐵線藤、玉米、芒果、械樹、瓜、泰、磨茹、白芥、 堅果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、枯、觀賞植物或花或樹、番木瓜、蹤擱、歐芹、歐洲防風草、魏豆、 桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石惱、馬鈴墓、西葫蘆、菊宦、 蘿K油菜、息鉤子、稻、黑麥、高梁、柳樹、玻菜、云杉、南瓜、草霉、糖蘿K甘藏、向日葵、甘 墓、甜玉米、紅枯、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、憲青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、 小麥、墓葫、紅豆杉和夏南瓜。
[0029] 在另一實施方案中，本發明提供了經分離的核巧酸序列、雙鏈核糖核巧酸序列、細 胞、植物或產品用于處理植物的昆蟲侵襲的用途。
[0030] 在另一實施方案中，本發明提供了經分離的核巧酸序列、雙鏈核糖核巧酸序列、細 胞、植物或產品用于處理植物的線蟲侵襲的用途。
[0031] 在另一實施方案中，本發明提供了經分離的核巧酸序列、雙鏈核糖核巧酸序列、細 胞、植物或產品用于處理植物的真菌侵襲的用途。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖I-LD ;馬鈴墓葉甲在用dsRNA處理過的人工食物上的存活。向第二幼蟲期的昆 蟲喂飼用50 y 1局部應用的dsRNA (祀或奸P對照）溶液處理過的膳食。膳食在7天后被含 有局部應用dsRNA的新鮮膳食替換。在第2、5、7、8、9和13天評定存活昆蟲的數量。計算相 對于第0天（檢測開始時）的存活幼蟲百分比。祀LD006;(SEQ ID N0:178);祀LD007(SEQ ID N0:183);祀 LD010(SEQ ID N0:188);祀 LDOlUSEQ ID N0:193);祀 LD014(SEQ ID N0:198) ;gfp dsRNA(SEQ ID N0:235)。
[0033] 圖2-LD ;馬鈴墓葉甲在用dsRNA處理過的人工膳食上的存活。向第二幼蟲期的 昆蟲喂飼用50 y 1局部應用的dsRNA (祀或奸P對照）溶液處理過的膳食。膳食僅在7天 后被新鮮膳食替換。在第2、5、6、7、8、9、12和14天評定存活昆蟲的數量。計算相對于第 0天（檢測開始時）的存活幼蟲百分比。祀LD001;(SEQ ID N0:163);祀LD002(SEQ ID NO: 168) ；|ELD003(SEQ ID NO: 173) ；|ELD015(SEQ ID NO:215) ；|ELD016(SEQ ID NO:220)； gfp dsRNA(SEQ ID N0:235)。
[0034] 圖3-LD ;在用dsRNA處理過的馬鈴墓葉盤上的馬鈴墓葉甲幼蟲平均重量。向第二 幼蟲期的昆蟲喂飼用20 y 1局部應用的dsRNA (祀LD002或奸P對照）溶液（1化g/ y 1)處 理過的葉盤。2天后，每天都將昆蟲轉移到未經處理的葉上。
[003引圖4-LD ;馬鈴墓葉甲在用祀LDOHdsRNA的較短形式和多聯體dsRNA處理過的人 工膳食上的存活。向第二幼蟲期的昆蟲喂飼經50 y 1局部應用的dsRNA (g巧或祀）溶液處 理過的膳食。在第3、4、5、6和7天評定存活昆蟲的數量。計算相對于第0天（檢測開始 時）的存活幼蟲百分比。
[0036] 圖5-〇);馬鈴墓葉甲幼蟲在用不同濃度的祀0)002(3)、祀0)007化）、祀0)010似、 祀 LDOll (d)、祀 LD014 (e)、祀 LD015 (f)、LD016 (g)和祀 LD027 化）的 dsRNA 處理過的人工膳 食上的存活。向第二幼蟲期的昆蟲喂飼經50 y 1局部應用的dsRNA溶液處理過的膳食。膳 食在7天后被含有局部應用dsRNA的新鮮膳食替換。W常規間隔評定存活昆蟲的數量。計 算相對于第0天（檢測開始時）的存活幼蟲百分比。
[0037] 圖6-LD ;表達dsRNA祀LDOlO的大腸桿菌化coli)菌株對馬鈴墓甲蟲--馬鈴 墓葉甲幼蟲存活隨時間的影響。在單獨的基于人工膳食的生物測定中，對兩種細菌菌株進 行了測試；（a)AB309-105 ;針對PGBNJ003和pGN29的數據點代表了來自5個不同細菌克隆 的平均死亡率的值，化)化2UDE3);針對PGBNJ003和PGN29的數據點代表了分別來自5個 不同和1個單細菌克隆的平均死亡率的值。誤差條代表標準差。
[003引 圖7-LD ;侵襲后12天，大腸桿菌菌株的不同克隆（a)AB309-105和化）表達dsRNA 祀LDOlO的化21 (DE3)對馬鈴墓甲蟲--馬鈴墓葉甲幼蟲存活的影響。數據點是針對pGN29 和PGBNJ003而言每個克隆的平均死亡率的值。攜帶有質粒PGBNJ003的AB309-105的克隆 1在該時間點顯示出針對CPB的100%死亡率。誤差條代表標準差。
[003引 圖8-LD ;侵襲后7天，大腸桿菌菌株的不同克隆（a)AB309-105和化）表達dsRNA 祀LDOlO的化21 (DE3)對馬鈴墓甲蟲--馬鈴墓葉甲幼蟲存活者的生長和發育的影響。數 據點是基于表10的數據針對每個克隆（對于PGN29而言1個克隆，對于PGBNJ003而言5 個克隆）的％平均幼蟲重量值。僅給予膳食的處理代表100%正常的幼蟲重量。
[0040] 圖9-LD ;在侵襲后7天用產生雙鏈RNA的細菌噴霧過的馬鈴墓植物上，馬鈴墓甲 蟲一馬鈴墓葉甲幼蟲的存活。對幼蟲存活者的數量加W計數，表示為％死亡率的形式。所 用的細菌宿主菌株是RNaseIII-缺陷型菌株AB309-105。昆蟲基因祀是LD010。
[0041] 圖IO-LD ;在侵襲后11天用產生dsRNA的細菌噴霧的馬鈴墓植物上喂飼的馬鈴墓 甲蟲一馬鈴墓葉甲幼蟲存活者的生長/發育延遲。所用的細菌宿主菌株是RNaseIII-缺 陷型菌株AB309-105。數據圖表示為正常幼蟲重量的百分比；僅給予膳食的處理被視為正 常幼蟲重量的100%。昆蟲基因祀是LD010。誤差條代表標準差。
[004引圖Il-LD ;在侵襲后7天通過產生雙鏈RNA的細菌導致的、對馬鈴墓甲蟲--馬鈴 墓葉甲幼蟲引起的馬鈴墓損傷的抗性。左邊是用7個單位的含PGN29質粒的細菌AB309-105 噴霧的植物；右邊是用7個單位的含PGBNJ003質粒的細菌AB309-105噴霧的植物。一個單 位被定義為在600nm處OD值為1的Iml細菌息浮液的等同物。昆蟲基因祀是LD010。
[0043] 圖12-LD ;在用dsRNA處理過的馬鈴墓葉盤上馬鈴墓葉甲成蟲的存活。最初兩天 用雙鏈RNA處理過的葉盤來喂飼年輕的昆蟲成蟲，之后將它們放在未經處理的馬鈴墓葉子 上。常規評定存活昆蟲的數量；活著并且看起來正常移動的昆蟲被記為可移動的昆蟲；活 著但是看起來病態并且移動緩慢的昆蟲被記為瀬死的昆蟲一該些昆蟲一旦被背朝下放 置無法自己翻過身來。祀LD002(SEQ ID N0:168);祀LD010(SEQ ID N0:188);祀LD014(SEQ ID N0:198);祀 LD016(SEQ ID N0:220) ;gfp dsRNA(SEQ ID N0:235)。
[0044] 圖13-LD ;產生祀雙鏈RNA的細菌對馬鈴墓葉甲幼蟲的影響。將50 ylOD為I的 經熱處理細菌（表達dsRNA (SEQ ID NO:188))的息浮液局部應用到48孔板每個孔中的固 體人工膳食上。將L2期的(PB幼蟲放置于每個孔中。在第7天，對于含有下述物質的板中 的CPB幼蟲取圖，其中含有（a)含有表達祀10雙鏈RNA的細菌的膳食，化）具有攜帶有空 載體PGN29的細菌的膳食W及（C)僅膳食。
[0045] 圖14-LD;在昆蟲侵襲之前，局部應用到馬鈴墓葉上的不同量的滅活大腸桿菌 AB309-105菌株（攜帶質粒PGBNJ003)對于(PB幼蟲存活和生長的影響。向10只Ll幼蟲喂 飼經處理的馬鈴墓，喂飼7天。噴霧到植物上的細菌息浮液的量為；0. 2抓、0. 08U、0. 025U、 0. 008U的祀10 W及0. 25U的pGN29 (陰性對照，還包括Milli-Q水）。一個單位（U)被定 義為；與在600nm光密度值為1的Iml培養物中存在的細菌等同的量。噴霧到每株植物上 的總體積為1. 6ml。昆蟲基因祀是LD010。
[0046] 圖15-LD ;侵襲后7天，攜帶質粒PGBNJ003的滅活大腸桿菌AB309-105菌株導致 的CPB幼蟲對馬鈴墓損傷的抗性。（a)水，化)0. 2抓攜帶PGN29的大腸桿菌AB309-105， (C)O. 02抓攜帶PGBNJ003的大腸桿菌AB309-105，（d)0. 008U攜帶PGBNJ003的大腸桿菌 AB309-105。一個單位扣）被定義為；與在600nm光密度值為1的Iml培養物中存在的細菌 等同的量。噴霧到每株植物上的總體積為1.6ml。昆蟲基因祀是LD010。
[0047] 圖I-PC ;攝入的碑IdsRNA對辣根猿葉甲幼蟲存活和生長的影響。向新生（neonate) 幼蟲喂飼用25 y 1局部應用的0. 1 y g/ y 1 dsRNA (祀或奸P對照）溶液處理過油菜葉盤。 2天后，將昆蟲轉移到新鮮的用dsRNA處理過的葉盤上。第4天，針對每種處理收集來自一 份重復的幼蟲，將其放進含有新鮮的未經處理的油菜葉子的Petri培養皿中。在第2、4、7、 9和11天，對昆蟲加W評定。（a)墨西哥豆瓢蟲幼蟲在用dsRNA處理過的油菜葉盤上的存 活。計算相對于第0天（檢測開始時）的存活幼蟲百分比。化）在用dsRNA處理過的油菜 葉盤上辣根猿葉甲幼蟲的平均重量。將來自每份重復實驗的昆蟲一起稱重，確定每只幼蟲 的平均重量。誤差條代表標準差。祀1 =SEQ ID NO: 473 ;祀3 ;SEQ ID NO: 478 ;祀5 ;SEQ ID N0:483 ;祀 10 ;SEQ ID N0:488 ;祀 14 ;SEQ ID N0:493 ;祀 16 ;沈Q ID N0:498 ;祀27 ;SEQ ID NO:503 ;gfP dsRNA;SEQ ID NO:235。
[004引 圖2-PC ;在用不同濃度的（a)祀PCOlO和（b)祀PC027的dsRNA處理過的油菜葉 盤上辣根猿葉甲的存活。將新生幼蟲放到用25 y 1局部應用的dsRNA溶液處理過的葉盤上。 在第2天將昆蟲轉移到新鮮的經處理葉盤上。對祀PCOlO而言在第4天，對祀PC027而言 在第5天，將昆蟲轉移到未經處理的葉上。針對PCOlO在第2、4、7、8、9和11天，針對PC027 在第2、5、8、9和12天，評定存活昆蟲的數量。計算相對于第0天（檢測開始時）的存活幼 蟲百分比。
[0049] 圖3-PC ;表達dsRNA祀PCOlO的大腸桿菌菌株AB309-105對白芥葉甲蟲--辣根 猿葉甲幼蟲存活隨時間的影響。針對每種處理的數據點代表來自3份不同重復的平均死亡 率的值。誤差條代表標準差。祀10 =SEQ ID N0:488。
[0050] 圖I-EV ;墨西哥豆瓢蟲幼蟲在用dsR化處理過的豆葉盤上的存活。向新生幼蟲喂 飼用25 y 1局部應用的1 y g/ y 1 dsRNA (祀或奸P對照）溶液處理過的豆葉盤。2天后，將 昆蟲轉移到新鮮的用dsRNA處理過的葉盤上。第4天，收集來自一種處理的幼蟲，將其放進 含有新鮮的未經處理的豆葉的塑料盒中。在第2、4、6、8和10天，對昆蟲的死亡率加W評定。 計算相對于第0天（檢測開始時）的存活幼蟲百分比。祀5 =SEQ ID NO:576 ;祀10 =SEQ ID N0:586 ;祀 15 ;SEQ ID N0:591 ;祀 16 ;SEQ ID N0:596 ;gfp ds RNA ;SEQ ID N0:235。
[0051] 圖2-EV ;攝入的祀dsRNA對于墨西哥豆瓢蟲成蟲存活W及對食芙菜豆葉的昆蟲損 傷的抗性的影響。（a)墨西哥豆瓢蟲成蟲在用dsRNA處理過的豆葉上的存活。向成蟲喂飼 用75 ill局部應用的0. 1 y g/ ill dsRNA (祀或奸P對照）溶液處理過的豆葉盤。24小時 后，將昆蟲轉移到新鮮的用dsRNA處理過的葉盤上。再24小時后，收集來自一種處理的成 蟲，將其放進含有盆栽的新鮮未經處理整株豆植株的塑料盒里。在第4、5、6、7、8和11天 評定昆蟲的死亡率。計算相對于第0天（檢測開始時）的存活成蟲百分比。祀10 =SEQ ID N0:586 ;祀 15 ;SEQ ID N0:591 ;祀 16 ;SEQ ID N0:596 ;gfp ds RNA ;SEQ ID N0:235。化） 通過dsRNA導致的對墨西哥豆瓢蟲成蟲引起的豆葉損傷的抗性。在第9天，針對葉的損傷 對含有來自一種處理（見（a))的昆蟲的整株植物進行目視檢查。（i)祀10 ;(ii)祀15; (iii)祀 16 ; (iv)gfp dsRNA ; (V)未經處理的。
[0052] 圖I-TC ;赤擬谷盜幼蟲在用祀14的dsRNA處理過的人工膳食上的存活。向新生 幼蟲喂飼含有Img dsRNA祀14的基于面粉/奶混合物的膳食。對照是膳食中的水（沒有 dsRNA)。針對每種處理采用四份重復，每份重復為10只第一齡蟲。在第6、17、31、45和60 天，評定昆蟲的存活（作為平均百分比值）。計算相對于第0天（檢測開始時）的存活幼蟲 百分比。誤差條代表標準差。祀TC014;SEQ ID N0:878。
[005引圖I-MP ;攝入的祀27dsRNA對于桃閩蛹的存活的影響。將第一齡蟲放進喂飼室中， 其中含有50 y 1具2 y g/ y 1 dsRNA (祀27或奸P dsRNA對照）的液體膳食。對每種處理 而言，使用5個喂飼室，每個喂飼室中10只齡蟲。在生物測定開始后8天評定存活者的數 量。誤差條代表標準差。祀 MP027;SEQ ID N0:1061;gfp ds RNA;SEQ ID N0:235。
[0054] 圖I-NL ;褐飛風在用dsRNA處理過的液體人工膳食上的存活。在分別的生物測定 中，向第一至第二幼蟲期的蛹喂飼補充有2mg/ml dsRNA祀溶液的膳食；(a)化002、化003、 化005、化010 ;化）化009、化016 ;(。）化014、化018 ;(屯化013、化015、化021。將昆蟲在祀上 的存活與僅用膳食W及用含有同樣濃度的奸P dsRNA對照的膳食時的情況相比。膳食每兩 天被含有dsRNA的新鮮膳食替換。每天評定存活昆蟲的數量。
[00巧]圖2-NL;褐飛風在用不同濃度的祀dsRNA化002處理的液體人工膳食上的存活。 向第一至第二幼蟲期的蛹喂飼補充有1、〇. 2、0. 08和0. 04mg/ml (最終濃度）化002的膳食。 膳食每兩天被含有dsRNA的新鮮膳食替換。每天評定存活昆蟲的數量。
[0056] 發明詳沐
[0057] 本發明提供了控制有害生物侵襲的手段，該是通過向有害生物施用祀編碼序列來 實現的，所述序列能對有害生物中必要的生物學功能造成轉錄后阻遏或抑制。在一個方面， 本發明包括向有害生物喂飼一種或多種轉錄自祀編碼序列的全部或一部分的、雙鏈或小干 擾核糖核酸（RNA)分子，所述祀編碼序列對于有害生物的給養和存活來說是重要的。因此， 本發明涉及使用雙鏈RNA (dsRNA)，包括小干擾RNA(SiRNA)對編碼序列進行序列特異性抑 巧||，用作為有害生物控制的手段。
[0058] 直到現在，在大多數有害生物物種的膳食中提供dsRNA分子也還是不切實際的， 因為RNA分子易于被環境中的核酸酶降解，其被認為在溫和堿性或酸性環境（例如，在大多 數無脊椎有害生物消化道中發現的環境）中不穩定。因此，為了控制有害生物侵襲或引入 新的表型性狀的目的，人們需要通過阻遏、延遲或降低特定有害生物中的基因表達來調節 基因表達的改進的方法。
[0059] 發明人在此鑒定出了控制有害生物侵襲的方法，所述方法通過在所述有害生物的 膳食中提供dsRNA分子來實現。dsRNA的序列對應于重要的有害生物基因的部分或全部， 其引起了通過RNA干擾（RNAi)對有害生物祀的下調。作為對mRNA下調的結果，dsRNA防 止了祀有害生物蛋白質的表達，進而產生（包括但不限于）下述性質中的一種或多種；有害 生物進食減少；有害生物生存能力降低；有害生物死亡；對有害生物分化和發育的抑制；有 害生物的有性繁殖，肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素調節，離子調節和轉運，細胞膜電位 保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素感知，觸角形成，翅膀形 成，腿形成、發育和分化，卵形成，幼蟲成熟，消化酶形成，血淋己合成，血淋己保持，神經傳 遞，細胞分裂，能量代謝，呼吸，調亡W及真核細胞細胞骨架結構的任何組分（例如，肌動蛋 白和微管蛋白）能力的消失或降低。該些性質中的任何一種或任何組合能導致對有害生物 侵襲的有效抑制，在植物有害生物的情況下，導致對植物侵襲的抑制。
[0060] 本申請文件中使用的所有技術術語是通常用于生物化學、分子生物學和農學領 域中的，因此，它們是本發明所屬領域的技術人員所理解的。該些技術術語可在，例如 MOLECULAR 化0肌NG:A LABORATORY MANUAL 第3版，卷 I-3,編著，Sambrook和Russel, Cold Spring Harbor L油oratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,編著 Ausubel 等人，Greene Publishing Associates and 111巧-11116'3。1611。6，爬￥化'1^，1988(及定期更新）、5冊^?1?01'0〇)1^5^]\?)1^6(：化八1? BIOLOGY:A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 第 5 版，卷 1-2,編著 Ausubel 等人，John Wil巧&Sons, Inc.，2002、GENOME ANALYSIS:A LABORATORY MANUAL 卷 1-2,編著 Green 等人，Cold Spring Harbor L油oratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1997 中找到。
[0061] 本文描述了涉及植物生物學技術的方法，其還在例如下述論文中被詳細描述： MET冊DS IN PLANT MOL抓LAR BIOLOGY = A LABORATORY COURSE MANUAL 編輯 Maliga 等 人,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1995。 使 用PCR的多種技術被描述于，例如，Innis等人，PCR PR0T0C0LS:A GUIDE TO MET冊DS AND AP化ICATIONS, Academic Press,San Diego, 1990 和 Dieffenbach 和 Dveksler, PCR PRIMER:A LABORATORY MANUAL 第 2版，Cold Spring 化rbor L油oratory Press，Cold Spring Harbor, N. Y.，2003中。可通過已知技術從已知序列獲得PCR-引物對，所述 技術例如使用用于該目的的計算機程序，例如Primer,版本0. 5, 1991，Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Md 用于核酸化學合成的方法在例 如 Beaucage&Caruthers, Tetra. Letts. 22:1859-62(1981)和 Matteucci&化ruthers,J. Am. Qiem.Soc. 103:3185(1981)中討論過。
[0062] 限制性酶消化、磯酸化、連接和轉化按照Sambrook等人，MOLECULAR化0NING:A LABORATORY MANUAL 第 2 版（1989) ,Cold Spring 化 rbor L油 oratory Press 所述來 進行。如無其它指明，用于細菌細胞生長和保持的所有試劑和材料都從阿爾德里克化 學公司（Al 化ich Qiemicals) (Milwaukee, Wis. )、DIFCO 實驗室值IFCO L 油 oratories) 值etroit, Mich.)、英杰生命科學公司（Invitrogen) (Gaithersburg, Md.)或西格瑪化學公 司(Sigma Chemical Company) (St. Louis, Mo.)獲得。
[0063] 農桿甫（Agrobacterium)或細甫轉化：化本領域公知的，巧于轉化枯物細胸的 農桿菌是通常根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens)、發根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes)的卸甲（disarmed)和有毒利（virulent)衍生物，其含有載體。通常，載體 含有位于T-DNA邊界之間的想要的多核巧酸。但是，能轉化植物細胞的任何細菌都可使 用，例如H葉草根瘤菌（Miizobium trifolii)、魏豆根瘤菌（Miizobium Ieguminosarum)、 Phyllobacterium myrsinacearum、首薦中華根瘤菌（SinoMiizobium meliloti)和百脈根 中慢生根瘤菌（MesoMiizobium loti)。
[0064] 被子枯物；在子房中含有種子的維管枯物。被子植物是產生能結果的花的種子植 物。被子植物被分為雙子葉植物和單子葉植物。
[0065] 生物堂活性指蛋白質或膚的生物學行為和影響及其對有害生物的表現。例如，本 發明的RNAi可防止特定mRNA的翻譯，由此抑制所述mRNA編碼的蛋白質的生物學活性或者 有害生物的其它生物學活性。
[0066] 在本說明書中，RNAi分子可抑制有害生物中的生物學活性，產生（包括但不限于） 下述性質中的一種或多種：有害生物進食減少；有害生物生存能力降低；有害生物死亡；對 有害生物分化和發育的抑制；有害生物的有性繁殖，肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素調 節，離子調節和轉運，細胞膜電位保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合 成，信息素感知，觸角形成，翅膀形成，腿形成、發育和分化，卵形成，幼蟲成熟，消化酶形成， 血淋己合成，血淋己保持，神經傳遞，細胞分裂，能量代謝，呼吸，調亡W及真核細胞細胞骨 架結構的任何組分（例如，肌動蛋白和微管蛋白）能力的消失或降低。
[0067] 商品產品包括從植物制備或源自植物的任何產品，其包括但不限于;食品、飼料、 纖維、紙、餐食、蛋白質、淀粉、面粉、青膽飼料、咖啡、茶和油。
[0068] 互補DNA(CDNA)指從成熟的mRNA模板合成的單鏈DNA。雖然有若干種方法，但是 最通常是使用逆轉錄酶該種酶從成熟（經完全剪接的）mRNA來合成cDNA。該酶在mRNA的 單鏈上進行操作，基于RNA堿基對（A、U、G、C)與其DNA互補體（T、A、C、G)的配對產生所述 mRNA的互補DNA。兩條核酸鏈的堿基中有至少85%配對時，該兩條鏈就是充分巧補的。
[0069] 想要的《核昔酸：本發明的想要的多核昔酸是遺傳元件，例如啟動子、增強子或 終止子，或將在其基因組中包含想要的多核巧酸的經轉化細胞中轉錄和/或翻譯的基因或 多核巧酸。如果想要的多核巧酸包含編碼蛋白質產物的序列，編碼區域可與調控元件（例 女口，啟動子和終止子）有效地連接，所述調控元件能使得相關聯的信使RNA轉錄本和/或想 要的多核巧酸編碼的蛋白質產物表達。因此，"想要的多核巧酸"可包含該樣的基因：其W 5' -至3' -方向有效地連接啟動子、編碼蛋白質的基因和終止子。或者，想要的多核巧酸可 包含"正義"和/或"反義"方向的基因或其片段，其轉錄產生可能影響到植物細胞中內源基 因表達的核酸。想要的多核巧酸還可基于轉錄產生雙鏈RNA產物，在此基礎上起始對所述 想要的多核巧酸相關聯的基因的RNA干擾。本發明的想要的多核巧酸可被放置于載體中， 使得左右邊界序列側翼連接于想要的多核巧酸或在其任何一側。本發明設想將一種或多種 想要的多核巧酸穩定整合進至少一種宿主細胞的基因組。想要的多核巧酸可經突變或者是 其野生型序列的變體。應當理解，想要的多核巧酸的全部或部分可整合進宿主的基因組。還 應當理解，術語"想要的多核巧酸"包括一種或多種此類多核巧酸。因此，本發明的載體可 包含一種、兩種、H種、四種、五種、六種、走種、八種、九種、十種或更多種想要的多核巧酸。
[0070] 雙子葉枯物（dicotyledonous plant,英文中也稱dicot)是開花植物，其胚具有 兩個種子半邊部分或者兩片子葉，分支葉脈，花的各部分為4或5的倍數。雙子葉植物的 實例包括但不限于；按屬巧ucalyp化S)、楊屬（Populus)、楓香屬（Liquidamber)、金合歡屬 (Acacia)、抽木、桃花也木、棉花、煙草、擬南芥屬（Ar油idopsis)、番茄、馬鈴墓、糖蘿h、挪 菜、木墓、甘墓、胡椒、猩猩木、菜豆、首薦、大豆、胡蘿K草霉、窩宦、橡樹、械樹、核桃、醫薇、 薄荷、南瓜、維菊、老鶴草、鱷梨和仙人掌。
[0071] 在提到核酸時，外源表示核酸源自非宿主生物。根據本發明，外源DNA或RNA表示 天然存在于真菌、細菌、病毒、哺乳動物、魚或鳥的遺傳構成中但是在待轉化的宿主中并非 天然存在的核酸。因此，外源核酸是該樣的核酸，其編碼例如經轉化宿主并不天然產生的多 膚。外源核酸不一定編碼蛋白質產物。
[0072] 本文中使用的直菌或真菌細胞指屬于真菌界的生物中存在的或源自所述生物的 任何細胞。本發明的方法可應用于下述所有真菌和真菌細胞，它們對于RNA干擾導致的基 因沉默來說是易感（SUSC邱t化Ie)的，并且能使得雙鏈RNA從它們的直接環境被內在化。
[0073] 在本發明的一種實施方案中，真菌可W是霉菌，或者更特別地，絲狀真菌。在本發 明的其它一些實施方案中，真菌可W是酵母。
[0074] 在一種實施方案中，真菌可W是子囊菌真菌，gp，屬于子囊菌（Ascomycota) 口的 真菌。
[007引在本發明的優選但非限制性的實施方案和方法中，真菌細胞選自：
[0076]植物病原性真菌的真菌細胞或源自植物病原性真菌的細胞，其例如但不限于：小 枝頂抱屬物種（Acremoniella spp.)、異水霉屬物種（Allomyces spp.)、鏈格抱屬物種 (Alternaria spp.)(例如蕓苔生鏈格抱（Alternaria brassicola)或索蘭尼（氏）鏈格 抱（Alternaria solani))、暗膜菌屬物種（Amoi^pho化ec spp.)、殼二抱屬物種（Ascochyta spp.)(例如魏豆殼二抱（Ascochyta pisi))、曲霉屬物種（Aspergillius spp.)、短梗霉 屬物種（Aureobasidium spp.)、小芽枝霉屬物種化Iastocladiella spp.)、葡萄抱屬物 種化Otiytis spp.)(例如灰葡萄抱化Otiytis cinerea)或富克葡萄抱化otiyotinia fuckeliana))、假絲酵母屬物種（Candida spp.)、枝抱屬物種（Cladosporium spp.)、尾 抱屬物種（Cercospora spp.)(例如菊池尾抱（Cercospora kikuchii)或 Cercospora zaea-maydis)、毛殼屬物種（Qiaetomium spp.)、枝抱屬物種（Cladosporium spp.)(例 如黃枝抱（Cladosporium fulvum))、刺盤抱屬物種（Colletotrichum spp.)(例如豆刺 盤抱（Colletotrichum Iindemu化ianum))、球抱子菌屬物種（Coccidioides spp.)、耳霉 屬物種（Conidiobolus spp.)、鬼傘菌屬物種（Coprinopsis spp.)、Coiynascus spp.、 栗疫屬物種（化yphonectria spp.)、隱球酵母屬物種（Cryptococcus spp.)、小克銀漢 霉屬物種（Cunnin組amelia spp.)、彎抱屬物種（Curvularia spp.)、德己利酵母屬物 種化ebarymyces spp.)、色二抱屬物種化iplo化a spp.)(例如玉米色二抱化iplo化a maydis))、裸胞殼屬物種（Emericella ssp.)、腦炎微抱子蟲屬瓜IC邱halitozoon spp.)、 假囊酵母屬物種巧1'61110化6(3；[111113口口.）、白粉菌屬物種巧巧31口116 3口口.）（例如目巧31口116 graminis f. sp. grami打is、大麥白粉菌（Erysiphe graminis f. sp. hordei)或良宛丑白粉 菌巧 iysiphe pisi))、Erwinia armylovora、鑲抱屬物種（F'usarium spp.)(例如雪腐鑲 抱（Fusarium nivale)、擬分支抱鑲抱（Fusarium sporotrichioides)、尖鑲抱（Fusarium oxysporum)、禾本科窄廉抱（Fusarium graminearum)、Fusarium germinearum、大刀窄廉抱 (Fusarium culmorum)、腐皮鑲抱（Fusarium solani)、串珠鑲抱（Fusarium moniIiforme) 或粉紅鑲抱（F'usarium roseum))、頂囊殼屬物種（Gaeumanomyces spp.)(例如小麥禾頂囊 殼（Gaeumanomyces graminis f. sp. tritici))、Geomyces spp.、赤霉屬物種（Gibberella spp.)(例如玉蜀泰赤霉（GiLbberella zeae))、粘禪菌屬物種（Gloeoph^dlum spp.)、球囊霉 屬物種（Glomus spp.)、長蠕抱屬物種（Helminthosporium spp.)(例如 Helmin^osporium turcicum、炭色長蠕抱（Helminthosporium carbonum)、玉蜀泰長蠕抱（Helminthosporium mavdis)或水稻小球菌棱病菌（Helmin化osporium sigmoideum))、肉座菌屬物種（Hypocrea spp.)、克魯維酵母屬物種OUuyveromyces spp.)、香茹屬物種（Xentinula spp.)、稻小球 腔菌化邱tosphaeria salvinii)、白冬抱酵母屬物種（Xeucosporidium spp.)、殼球抱屬 物種（Macrophomina spp.)(例如萊丑殼球抱（Macrophomina phaseolina))、Magnapo:rtha spp.(例如稻磕病菌（Magnaporthe OTyzae))、Me化arhizium spp.、毛霉屬物種（Mucor spp.)、球腔菌屬物種（Mycosphaerella spp.)、脈抱菌屬物種（Neurospora spp.)、從赤殼 屬物種（Nectria spp.)(例如 Nectria heamatococca)、長嗦殼屬物種（Ophiostoma spp.)、 Paracocidioides spp、霜霉屬物種巧 eronospora spp.)(例如東北霜霉巧 eronospora manshurica)或煙草霜霉巧eronospora tabacina))、莖點霉屬物種巧homa spp.)(例如 泰萊莖點霉（J^homa betae))、Phaeopsheria spp?、平革菌屬物種卿ianerochaete spp.)、 層誘菌屬物種腳iakopsora spp.)(例如豆墓層誘菌腳iakopsora pachyrhizi))、瘤梗 抱屬物種腳iymatotrichum spp.)(例如多主瘤梗抱腳iymatotrichum omnivorum))、 疫霉屬物種腳iytoph化ora spp.)(例如棒疫霉腳iytoph化ora cinnamomi)、惡疫霉 (Phytophthora cactorum) (Phytophthora phaseoli) ^(Phytophthora parasitica)、巧枯褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora)、Phytophthora megasperma f. sp. soiae 或致病疫霉卿iytoph化ora infestans))、單軸霉屬物種巧Iasmopara spp.) (例如葡萄生單軸霉巧Iasmopara viticola))、肺抱子屬物種巧neumocystis spp.)、叉絲 單囊殼屬物種巧odosphaera spp.)(例如白叉絲單囊殼巧odosphaera leucotricha))、 柄誘菌屬物種（；Puccinia spp.)(例如高梁柄誘菌（；Puccinia sor組i)、條形柄誘菌 (Puccinia striiformis)、小麥禾柄誘菌（Puccinia graminis f. sp. tritici)、天 口 冬屬柄誘菌巧uccinia asparagi)、隱匿柄誘菌巧uccinia recondita)或落花生柄 誘菌巧uccinia arachidis))、腐霉屬物種巧ythium spp.)(例如瓜果腐霉巧ythium aphanidermatum))、火絲菌屬物種巧yronema spp.)、棱腔菌屬物種巧yrenophora spp.) (例如偃麥草棱腔菌巧yrenophora tritici-r邱entens)或圓棱腔菌巧yrenophora teres))、梨抱屬物種巧 yricularia spp.)(例如稻梨抱巧 yricularia oryzae))、腐霉 屬物種巧^hium spp.)(例如終極腐霉巧^hium ultimum))、Rhincosporium secalis、 絲棱菌屬物種（Rhizoctoniaspp?)(例如立枯絲棱菌（Rhizoctoniasolani)、稻枯斑 絲棱菌（Rhizoctonia OTyzae)或禾谷絲棱菌（Rhizoctonia cerealis))、根霉屬物種 (Rhizopus spp.)(例如華根霉（Rhizopus chinensid))、酵母屬物種（Saccharomyces spp. )、Scerotium spp.(例如 Scerotium rolfsii)、棱盤菌屬物種（Sclerotinia spp.) (例如棱盤菌（Sclerotinia sclerotiorum))、殼針抱屬物種（S邱toria spp.)(例如 番茄殼針抱（Septoria lycopersici)、大豆殼針抱（Septoria glycines)、穎枯殼針抱 (Septoria nodorum)或小麥殼針抱（Septoria tritici))、Spizellomyces spp.、嗜熱真 菌屬物種（Thermomyces spp.)、根串珠霉屬物種（Thielaviopsis spp.)(例如根串珠霉 (Tliielaviopsis basicola))、腥黑粉菌屬物種（Tilletia spp.)、栓菌屬物種 ^rametes spp.)、木霉屬物種（T'richoderma spp.)(例如綠色木霉（Trichoderma virde))、發癖 菌屬物種（Trichophyton spp.)、鉤絲殼屬物種（Uncinula spp.)(例如葡萄鉤絲殼 (Uncinula necator))、玉蜀泰黑粉菌（Ustilago maydis)(例如玉蜀泰黑粉病）、黑星菌屬 物種（Ven化ria spp.)(例如蘋果黑星菌（Ven化ria inaequalis)或梨黑星菌（Ven化ria pirina))、Yarrwia spp?或輪枝抱屬物種（Verticillium spp.)(例如大麗花輪枝抱 (Verticillium dahliae)或黃萎輪枝抱（Verticillium a化o-atrum))。
[0077] 基廈指這樣的多棱昔酸序列，其包含對于多獻或前體的生產來說必要的控制和編 碼序列。多膚可由全長編碼序列或編碼序列的任何部分所編碼。基因可組成連續的編碼序 列，或者其可包括通過合適的剪接點結合的一個或多個內含子。此外，基因可在編碼或非翻 譯區域含有一種或多種修飾，該可能會影響到表達產物的生物學活性或化學結構、表達速 率或表達控制方式。此類修飾包括但不限于；一個或多個核巧酸的突變、插入、缺失和取代。 在該方面，此類經修飾的基因可被稱為"天然"基因的"變體"。
[0078] 遺傳元件是任何重要的(discreet)核巧酸序列，其例如但不限于，啟動子、基因、 終止子、內含子、增強子、間隔區、5' -非翻譯區域、3' -非翻譯區域或重組酶識別位點。
[0079] 遺傳修飾指;通過應用分子生物學和細胞生物學的方法，將DNA穩定引入某些生 物的基因組。
[0080] "基因遏巧r或"對基因表達的下調"或"對基因表達的抑巧r可互換使化其指廟 來自祀基因的蛋白質產物和/或mRNA產物的水平上可測量的或可觀察到的基因表達的降 低，或可探測到的基因表達的完全消失。當祀基因的下調或抑制發生但對有害生物的其它 基因沒有明顯影響的時候，對基因表達的下調或抑制是"特異性的"。
[0081] 根據祀基因的性質，可通過使用分子技術，例如，RNA溶液雜交、核酸酶保護、 Nodhern雜交、逆轉錄、微陣列基因表達監測、抗體結合、酶聯免疫吸附測定巧LISA)、 Western印跡、放射性免疫測定巧IA)、其它免疫測定或英光活化細胞分析（FAC巧測量mRNA 或蛋白質表達，或通過對細胞或整個有害生物進行表型分析，來驗證對有害生物細胞中基 因表達的下調或抑制。
[0082] 在本文中使用時，裸子植物指產生種子但沒有子房的種子植物。裸子植物的實例 包括針葉樹、蘇鐵、銀杏和麻黃。
[0083] 在本文中使用時，同源性涉及序列；如果蛋白質或核巧酸序列顯示出"顯著"水平 的序列相似性或更優選地序列同一性，那么所述蛋白或核酸序列就可能是同源的。真正同 源的序列通過來自共同祖先基因的趨異相關聯。序列同源物可W是兩種類型的；（i)同源 物存在于不同物種中時，它們被認為是直向同源物，例如，在小鼠和人中的a-珠蛋白基因 是直向同源物；（ii)旁系同源物（paralogue)是在單種物種中的同源基因，例如，小鼠中的 a-珠蛋白和目-珠蛋白基因是旁系同源物。
[0084] 宿主細胞指該樣的微生物、原核細胞、真核細胞或作為單細胞實體培養的細胞系， 其可W或已經用作為重組載體或其它多核巧酸傳遞的受體，包括已被轉染的原始細胞的子 代。由于天然的、偶然的或刻意的突變，單個細胞的子代在形態，或基因組DNA或總DNA互 補的方面并不一定與原始親本完全相同。
[0085] 在本文中使用時，昆蟲可W是任何昆蟲，該表示屬于動物界的任何生物，更具 體地，屬于節肢動物口（Arthropoda)任何生物、W及屬于昆蟲綱（Insecta)或蛛形綱 (Arachnida)的任何生物。本發明的方法可應用于所有昆蟲，所述昆蟲對于RNA干擾導致的 基因沉默來說是易感的，并且能使得雙鏈RNA從它們的直接環境被內在化。
[0086] 在本發明的一種實施方案中，昆蟲可W屬于下述的目：峨目（Acari)、蜘蛛 目（Araneae)、風目（Anoplura)、銷翅目（Coleoptera)、彈尾目（Collembola)、革翅目 (Dermaptera)、網翅目值ictyoptera)、雙尾目值iplura)、雙翅目值iptera)、紡足目 (Embioptera)、蜂雌目巧地emeroptera)、型噓目（G巧Iloblatodea)、半翅目化emiptera)、 同翅目化omoptera)、膜翅目（Hymenoptera)、等翅目（Isoptera)、鱗翅目（Lepidoptera)、 食毛目（Mallophaga)、長翅目（Mecoptera)、脈翅目（Neuroptera)、蛹艇目（Odonata)、直翅 目（Orthoptera)、竹節蟲目（F*hasmida)、橫翅目（Plecoptera)、原尾目（Pro1:ura)、曬蟲目 (Psocoptera)、圣目（Si地onaptera)、風目（Si地unculata)、t嬰尾目（Hiysanura)、搶翅目 (Strepsiptera)、製翅目（Hiysanoptera)、毛翅目（Trichoptera)和缺翅目狂oraptera)。 [0087] 在本發明的優選但非限制性的實施方案和方法中，昆蟲選自是植物有害生物 的昆蟲，其例如但不限于；褐飛Il屬物種（Nilaparvata spp.)(例如褐飛風（N. Lugens) (褐稻風））；灰飛風屬物種（Laodelphax spp.)(例如灰飛風（L. Striatellus)(灰飛 風））；黑尾葉蠟屬物種（Nephotettix spp.)(例如二點黑尾葉蠟（N. Virescens)或黑 尾葉蠟（N. Cincticeps)(青葉蠟）或二條黑尾葉蠟（N. nigropicUis)(稻葉蠟））；白背 飛風屬物種（Sogatella spp.)(例如白背飛風（^SJurcifera)(白背飛風））；桿長賠屬 物種炬Iissus spp.)(例如美洲谷桿長賠炬.Ieucopterus Ieucopterus)(美洲谷桿 長賠））；黑賠屬物種（Scotino地ora spp.)(例如S. vermidulate (稻黑賠））；綠賠屬 物種（Acrosternum spp.)(例如擬綠賠A. hi Iare (擬綠賠））；稻弄蝶屬物種（Parnara spp.)(例如直紋稻弄蝶化Guttata)(直紋稻弄蝶））；禾草頓屬物種（化ilo spp.) (例如二化頓（C. Suppressalis)(稻二化頓（rice striped stem borer))、臺灣稻 頓（C. Aurici I ius)(金線二化頓（gold-fringed stem borer))或 C.polychiTsus (黑 頭二化頓（dark-headed stem bored))) ;Qiilotraea spp.(例如 C.polyc虹ysa(水 稻蛙也蟲（rice Sta化borer)));蛙莖夜蛾屬物種（Sesamia spp.)(例如稻蛙莖夜 蛾（S. Inferens)(大頓））；蛙禾頓屬物種（TiTpoiTza spp.)(例如 T. innotata (白稻 H化頓（white rice borer))或H化頓（T. IncertulasH H化頓））；縱卷葉野頓屬 物種（Giaphalocrocis spp.)(例如稻縱卷葉野頓（C. MedinalisH稻縱卷葉野頓））； 潛蟲電屬物種（Agromyza spp.)(例如日本稻潛禍（A. Oryzae)(日本稻潛禍）或美洲泰 潛葉禍（A. Parvicornis)(潛葉禍））；桿草頓屬物種值iatraea spp.)(例如小藏頓 值.Saccharalis)(小藏頓）或西南玉米桿草頓化Grandiosella)(玉米桿草頓））；頓嶺 夜蛾屬物種（Narnaga spp.)(例如N. aenescens(稻頓嶺））；黃夜蛾屬物種狂anthodes spp.)(例如舉紋黃夜蛾化Transversa)(舉紋黃夜蛾））；灰翅夜蛾屬物種（Spodoptera spp.)(例如草地貪夜蛾化化Ugiperda)(秋天行軍蟲）、甜菜夜蛾（S. Exigua)(甜菜夜 蛾）、灰翅夜蛾僅Littoralis)(月斑虎甲（climbing州tworm))或S.praefica(西部黃 條行軍蟲（western yellowstriped armyworm)));秘夜蛾屬物種（Mythi皿a spp.)(例如 粘蟲（Mythmna(Pseudaletia) seperata(行軍蟲））；鈴夜蛾屬物種化elicove巧a spp.) (例如谷實夜蛾化.Zea)(棉鈴蟲（corn earworm)));肖葉甲屬物種（Colaspis spp.) (例如C. brunnea(葡萄肖葉甲））；稻水象屬物種（Lissorhoptrus spp.)(例如稻水象甲 (L. Oryzophilus)(稻水象甲））；稻象屬物種巧chinocnemus spp.)(例如稻象巧.Squamos) (稻象））；Diclodispa spp.(例如D. armigera(稻鐵甲））；禾谷負泥蟲屬物種（Oulema spp.)(例如水稻負泥蟲化化yzae)(葉甲）；米象屬物種（Sitophilus spp.)(例如米象 (S. Oryzae)(稻象蟲））；瘦蚊屬物種（Pachydiplosis spp.)(例如稻瘦蚊（？. Oryzae)(稻 瘦蚊））；水禍屬物種（Hy化ellia spp.)(例如麥葉毛眼水禍化Griseola)(大麥水禍）或 日稻毛眼水禍化.Sasakii)(稻桿潛禍（rice stem maggot)));黃潛禍屬物種（Chlorops spp.)(例如稻黃潛禍（C.化yzae)(桿禍））；桿野頓屬物種（Ostrinia spp.)(例如玉米頓 (0. Nubilalis)(歐洲玉米鉆也蟲））；地虎屬（Agrotis spp.)(例如小地老虎（A. ipsilon) (小地老虎））；Elasmopalpus spp.(例如南美玉米苗斑頓化Lignosellus)(小玉米莖蛙 蟲（lesser cornstalk borer)));梳爪叩頭蟲屬物種（Melanotus spp.)(金針蟲）；圓頭犀 金龜屬物種（切cloce地ala spp.)(例如C. borealis (北方假面金龜子（northern masked chafer)),或 C.immaculata(南方假面金龜子（^southern masked chafer)));弧咖金龜 屬物種（Popillia spp.)(例如日本弧麗金龜（P. Japonica)(日本弧麗金龜））；跳甲屬物 種（化aetocnema spp.)(例如玉米銅色跳甲（C. PulicariaH玉米銅色跳甲））；龍頸象屬 物種（S地enophorus spp.)(例如玉米長瞭象化Maidis)(玉米長瞭象））；溢管閩屬物種 (Miopalosiphum spp.)(例如玉米閩化Maidis)(玉米閩））；圓尾閩屬物種（Anuraphis spp.)(例如 A.maidiradicis(玉米根閩（corn root aphid)));黑幢屬物種（Melanoplus spp.)(例如紅足黑幢（M.化murrubrum)(紅足黑幢）、特異黑幢（M. Differentialis)(特 異黑幢）或遷飛黑幢（M. Sanguinipes)(遷飛黑幢））；種禍屬物種（Hylemya spp.)(例如 灰地種禍化.Pla化ra)(灰地種禍））；呆葫馬屬物種（Anaphot虹ips spp.)(例如黃呆葫 馬（A. Obscrurus)(黃呆葫馬））；火蟻屬物種（Solenopsis spp.)(例如竊蟻化Milesta) (盜竊蟻））；或葉峨屬物種（Tetranychus spp.)(例如二點葉峨化化ticae)(二點葉 峨）、朱砂葉峨化Cinn油arinus)(朱砂葉峨））；鈴夜蛾屬物種化elicove巧a spp.)(例 如谷實夜蛾化Zea)(棉鈴蟲（cotton bollworm)),或棉鈴蟲化Armigera)(美洲棉鈴 蟲））；Pectino地ora spp.(例如紅鈴麥蛾（P. Gossypiella)(棉花紅鈴蟲））；金剛鉆 屬物種巧arias spp.)(例如翠紋金剛鉆巧.Vittella)(翠紋金剛鉆））；實夜蛾屬物種 化eliothis spp.)(例如煙芽夜蛾化.VirescensH煙青蟲））；花象屬物種（Anthonomus spp.)(例如墨西哥棉鈴象（A. Grandis)(棉子象鼻蟲））；Pseudatomoscelis spp.(例如棉 偽斑腿盲賠（P. Seria化s)(棉偽斑腿盲賠））；結翅粉風屬物種（Trialeurodes spp.)(例 如結翅粉風化Abutiloneus)(結翅粉風）、溫室粉風（T. Vaporariorum)(溫室粉風））； 小粉Il屬物種炬emisia spp.)(例如銀葉粉風化Argentifolii)(銀葉粉風））；閩屬物 種（Aphis spp.)(例如棉閩（A. Gossypii)(棉閩）、A. mellifera);草盲賠屬物種（Lygus spp.)(例如美國牧草盲賠（L. Lineolaris)(美國牧草盲賠）或豆芙草盲賠（L. Hesperus) (西牧草盲賠（western tarnished plant bug)));美洲賠屬物種巧uschis1:us spp.) (例如斑點美洲賠巧.conspersus)(斑點美洲賠））；Chloroc虹oa spp.(例如賽氏賠 (C-Sayi)(賽氏賠））；綠賠屬物種（Nezara spp.)(例如稻綠賠（N. Viridula)(稻綠賠））； 葫馬屬物種訂虹ips spp.)(例如蔥葫馬（T. T油aci)(蔥葫馬（onion trips)));花葫馬 屬物種（Prankliniella spp.)(例如煙褐葫馬化化sea)(煙褐葫馬），或西方花葫馬 (F. OccidentaliS)(西方花葫馬））；馬鈴墓葉甲屬物種（Leptinotarsa spp.)(例如馬 鈴墓葉甲（LDecemlineata)(馬鈴墓葉甲）、偽馬鈴墓葉甲（L.化ncta)(偽馬鈴墓葉甲） 或L texana(泰克斯偽馬鈴墓葉甲（Texan false potato beetle)));合爪負泥蟲屬物 種（Lema spp.)(例如H條負泥蟲（L. Trilineata) ( H條負泥蟲））；跳甲屬物種巧pitrix spp.)(例如馬鈴墓跳甲化化州meris)(馬鈴墓跳甲）、煙草跳甲巧.Hirtipennis)(跳 甲）或塊莖跳甲巧.Tuberis)(塊莖跳甲））；豆完菁屬物種巧Picauta spp.)(例如北 美豆完菁巧.Vittata)(北美豆完菁））；綠小葉蠟屬物種（Empoasca spp.)(例如蠶豆 小綠葉蠟巧.F油ae)(黑豆閩））；瘤閩屬物種（Myzus spp.)(例如桃閩（M. Persicae) (桃財））；墓個木動屬物種（^aratrioza spp.)(例如馬鈴墓木動巧.Cockerelli)(木 動））；單葉叩甲屬物種（Conoderus spp.)(例如C.falli (南方馬鈴墓鐵線蟲（soui'thern potato wireworm))或叩頭甲（C.Vespe:rtinus)(煙草鐵線蟲（tobacco wireworm))); Phthorimaea spp?(例如馬鈴墓麥蛾（P.Operculella)(馬鈴墓麥蛾））；長管財屬物種 (Macrosiphum spp.)(例如大戟長管財（M. Euphorbiae)(馬鈴墓財））；Thyanta spp. (例女口 T. pallidovirens (redshouldered stinkbug)) ；Phthorimaea spp.(例女口馬鈴 墓麥蛾（P. Operculel la((馬鈴墓麥蛾））；鈴夜蛾屬物種（Helicoverpa spp.)(例如 谷實夜蛾化Zea)(美洲柿鈴蟲（tomato fruitworm)) ;Keiferia spp.(例如番茄蠢 蛾 K. Iycopersicella(番茄蠢蛾））；Limonius spp.(鐵線蟲（wireworm));天蛾屬物種 (Manduca spp.)(例如煙草天蛾（M. Sexta)(煙草天蛾），或番茄天蛾（M. Quinquemaculata) (番茄天蛾））；斑潛M屬物種（Xiriomyza spp.)(例如蔬萊斑潛M (X. Sativae)、蘭 葉草斑潛M (X. Trifolli)或南美斑潛M (L Huidobrensis)(斑潛M ));果M屬物種 G)rosophiIla spp.)(例如黑尾果蟲畢 〇)? Melanogaster)、D. yakuba、D. pseudoobscura 或D.simulans);步甲屬物種（Carabus spp.)(例如粒步甲（C.granulatus));搖蚊屬物 種（Qiironomus spp.)(例如 C. tentanus);柿頭圣屬物種（Ctenoc邱halides spp.)(例 如貓柿頭圣把Felis)(貓圣））；非耳嗦象屬物種Oiapr邱es spp.)(例如甘藏根頓蟲 (D-Abbreviatus)(根象鼻蟲））；齒小蠢屬物種（Ips spp.)(例如美松齒小蠢（I. Pini)(美 松齒小蠢））；擬谷盜屬物種（Tribolium spp.)(例如赤擬谷盜（T. CastaneumH赤擬谷 盜））；舌M屬物種（Glossina spp.)(例如刺舌M (G. Morsitans)(采采M));按蚊屬物種 (Anopheles spp.)(例如岡比亞按蚊（A. Gambiae)(追蚊））；鈴夜蛾屬物種Glelicoverpa spp.)(例如棉鈴蟲化Armigera)(非洲棉鈴蟲））；無網長管財屬物種（Acyi'thosiphon spp.)(例如豆無網長管財（A. pisum) ( 5宛豆財））；蜜蜂屬物種（Apis spp.)(例如意大利 蜂（A. Melifera)(蜜蜂））；Homalodisca spp.(例如玻璃葉婢巧.coagulate)(玻璃翅 葉蟲單））；伊蚊屬物種（Aedes spp.)(例如埃及伊蚊（Ae. Aegypti)(埃及伊蚊））；蠶蛾屬 物種化ombyx spp.)(例如家蠶化Mori)(家蠶）、野桑蠶化Mandarina));飛幢屬物種 (Locusta spp.)(例如飛幢（L Migratoria)(飛幢））；牛婢屬物種化oophilus spp.)(例 如微小牛婢化.Microplus)(具環牛婢））；Acan化oscurria spp.(例如A.gomesiana (紅毛 褐鳥蟲（red-haired chololate bird eater))) ;Diploptera spp.(例如 D. Punctata(太 平洋甲蟲蜂鄉（pacific beetle cockroach)));毒蝶屬物種（}feliconius spp.)(例 如瓦氏袖蝶化Erato)(紅型花蝶（red passion flower buttei^fly))或墨爾波蝶 (比 MelpomeneH 郵差蝶（postman buttei^fly)));象蟲屬物種（Curculio spp.)(例如歐洲 棟象（C.glandium)(橡實象甲（acorn weevil)));萊蛾屬物種（[Plutella spp.)(例如萊 蛾（P. X^dostella)(萊蛾（diamon 化 ack moth)));純眼婢屬物種（Amblyomma spp.)(例如 彩飾純眼婢（A. Variegatum)(具環牛婢））；巧蠶屬物種（Anteraea spp.)(例如半目大蠶 蛾（A. Yamamai)(蠶蛾（silkmo化)））；Belgica spp.(例如南極百吉卡蚊化 Antartica))、 Bemisa spp.(例如 B. Tabaci)、Bicyclus spp.、Biphillus spp?、瘤背豆象屬物種 (Callosobruchus spp.)、色卷蛾屬物種（Qioristoneura spp.)、虎甲屬物種（Cicindela spp.)、庫蚊屬物種（Culex spp.)，庫朦屬（Culicoides spp.)、枯木動屬物種 Oiaphorina spp.)、非耳嗦象屬物種 Oiapr邱es spp.)、Euclidia spp.、舌蟲畢屬物種（Glossina spp.)、 幡蜂屬物種（Girllus spp.)、紋石蛾屬物種（Hy化opsyche spp. )、±吉了屬物種Qulodis spp. )、Lonomia spp.、羅嶺屬物種（Lutzomyia spp. )、Lysiphebus spp、Meladema spp、覃 甲屬物種（Mycetophagus spp.)、金小蜂屬物種 O^Jasonia spp.)、Oncometopia S卵.、鳳 蝶屬物種（Papilio spp.)、風屬物種（Pedi州Ius spp.)、谷斑頓屬物種（Plodia spp.)、 Rhynchosciara spp.、Sphaerius spp.、聲蟲牙屬物種（Toxoptera spp. )、Trichoplusa spp.、 和阿蚊屬物種（Armigeres spp.)(例如騷擾阿蚊（A. Suba化aUis))。
[0088] "有害生物控制劑"或"基因遏制劑"指包含第一 RNA片斷和第二RNA片斷的特定 RNA分子，其中，第一和第二RNA片斷之間的互補性導致兩條片斷能在體內和體外雜交，形 成雙鏈分子。通常，其優選可W包括連接和穩定第一和第二序列的第H RNA片斷，從而可 形成莖，其中通過第H片段將第一和第二片段的各一端連接在一起W形成環，從而整個結 構形成莖環結構，甚至更緊密地雜交結構可形成莖環有結（stem-loop knotted)結構。或 者，可在沒有第H片斷的情況下形成對稱發夾，其中，沒有設計的環，但是就立體理由來說， 當莖足夠長到能穩定自身的時候，發夾將產生其自身的環。通常，第一和第二RNA片斷將處 于RNA分子的長度內，是各自的充分倒置重復序列，并通過第H RNA片斷連到一起。對于在 被dsRNA分子的攝入所遏制的祀昆蟲有害生物中從祀基因轉錄來的祀RNA而言，第一和第 二片斷總是（并非分別）對應于所述祀RNA的正義和反義序列。
[0089] 有害生物控制劑還可W是經充分純化（或分離）的核酸分子，更具體地，來自基因 組DNA (曲NA)或CDNA文庫的核酸分子或其核酸片段分子。或者，片段可包含具有大約15 至大約250個核巧酸殘基（更優選地，大約15至大約30個核巧酸殘基）的更小的寡核巧 酸。
[0090] 在本文中使用時，引入指核酸序列插入細胞，該通過包括感染、轉染、轉化或轉導 的方法來實現。
[0091] 單子葉植物（monocotyledonous plant,英文也作monocot)是開花植物，其具有 含一片子葉的胚，平行葉脈，花的各部分為3的倍數。單子葉植物的實例包括但不限于：草 坪草、玉米、稻、燕麥、小麥、大麥、高梁、紅口蘭、鸞尾、百合、蔥和蹤擱。
[0092] 線蟲或蝴蟲是最常見的動物口之一，其具有超過20, 000種不同的已知物種（超過 15, 000種是寄生的）。它們在淡水、海洋和陸地環境中普遍存在，在該些環境中，它們在個 體數量和物種數量上通常都超過其它動物，在遠至南極和海溝的地方都能發現它們。此外， 有大量的寄生形式，包括大多數植物和動物中的病原體。
[0093] 本發明的方法可應用于所有線蟲，其對于RNA干擾導致的基因沉默來說是易感 的，并且能使得雙鏈RNA從它們的直接環境被內在化。
[0094] 在本發明的一種實施方案中，線蟲可W屬于異皮科化eteroderidae)，包括胞囊線 蟲屬化eterodera)和球胞囊線蟲屬（Globodera)。
[0095] 在本發明的優選但非限制性的實施方案和方法中，昆蟲選自下述組，該組包括但 不限于：根結線蟲屬物種（Meloidogyne spp.)(例如南方根結線蟲（M. Incognita)、爪哇 根結線蟲（M. Javanica)、禾草根結線蟲（M. Graminicola)、花生根結線蟲（M. Arenaria)、 奇氏根結線蟲（M. Chitwoodi)、北方根結線蟲（M.化pla)或M.paranaensis);胞囊線蟲屬 物種化eterodera spp.)(例如水稻胞囊線蟲化oryzae)、大豆胞囊線蟲化Glycines)、 玉米胞囊線蟲化.Zeae)或甜菜胞囊線蟲化Schachtii));球胞囊線蟲屬物種（Globodera spp.)(例如馬鈴墓白線蟲（G.化llida)或馬鈴墓金線蟲（G. Rostochiensis));腎形 線蟲屬物種（Rotylenchulus spp.)(例如腎形線蟲化Reniformis));短體線蟲屬物 種（Pratylenchus spp.)(例如咖啡短體線蟲（P. coffeae)、玉米短體線蟲（P. Zeae) 或古迪短體線蟲（P. good巧i));穿孔線蟲屬物種（Rado地Olus spp.)(例如香蕉穿 孔線蟲化Similis));潛根線蟲屬物種化irschmaniella spp.)(例如稻潛根線蟲 化.Oryzae));鉤 口線蟲屬物種（Ancylostoma spp.)(例如犬鉤 口線蟲（A. caninum)、 錫蘭鉤口線蟲（A. C巧Ianicum)、十二指腸鉤口線蟲（A. Duodenale)或管形鉤口線蟲 (A. Tubaeforme)) ;Anisakid ;滑刃線蟲屬物種（Aphelenchoides spp.)(例如水稻干 尖線蟲（A. BesseyU);蝴蟲（Ascarids);蝴蟲屬物種（Ascaris spp.)(例如豬蝴蟲 (A. Simm)或A. Iumbridoides);刺線蟲屬物種炬elonolaimus spp.);布魯絲蟲屬物種 炬rugia spp.)(例如馬來絲蟲化Mala^)或彭亨絲蟲炬.P址angi));傘滑刃線蟲屬物 種炬ursaphelenchus spp.);新桿狀線蟲屬物種（Caenorh油ditis spp.)(例如漂亮新小 桿線蟲（C. elegans)、C. briggsae 或 C. remanei);梭菌屬物種（Clostridium spp.)(例如 丙麗了醇梭菌（C. Acetobut^ixum));古柏線蟲屬物種（Cooperia spp.)(例如腫孔古柏 線蟲（C. Onco地ora));輪線蟲屬物種（Criconemoides spp.);杯口屬物種（切athostomum spp.)(例如碗狀杯 口線蟲（C. Catinatum)、冠狀杯 口線蟲（C. Corona1:um)或C. patera1:um); 杯環屬物種（切Iicocyclus spp.)(例如鮮明杯環線蟲（C. Insigne)、細頸杯環線蟲 (C. ^ssatus)或C. radiatus);杯冠屬物種（切Iicoste地anus spp.)(例如高氏杯冠線 蟲（C. Goldi)或長傘杯冠線蟲（C. Longibursa1:us));裂頭屬（Di地}dlobot虹ium);惡絲 蟲屬物種值irofilaria spp.)(例如犬惡絲蟲值.Immitis));莖線蟲屬物種值it^enchus spp.)(例如續斷雙墊刃線蟲值.Dipsaci)、馬鈴墓腐爛線蟲值.Destructor)或水稻莖線蟲 (D. Angustus));燒蟲屬物種巧nterobius spp.)(例如蠕形住腸燒蟲化Vermi州laris)); 血矛線蟲屬物種（化emonchus spp.)(例如搶轉血矛線蟲化Contortus));螺旋線蟲屬 物種化elicot}denchus spp.);紐帶線蟲屬物種化oplolaimus spp.);光絲蟲屬物種 (Litomosoides spp.)(例如棉鼠絲蟲（LSigmodontis));長針線蟲屬物種（Longidorus spp.)(例如大體長針線蟲（L. Macrosoma));板口線蟲屬物種（Necator spp.)(例如 美洲板口線蟲（N. Americanus));日本圓線蟲屬物種（Nippostrong5dus spp.)(例如 己西鉤蟲（N.化asiliensis));盤尾絲蟲屬物種的nchocerca spp.)(例如旋盤尾絲蟲 (0. Volvulus));胃線蟲屬物種（Ostertagia spp.)(例如奧斯特線蟲（0. Ostertagi)); Parastrongyloides spp.(例如 P.trichosuri);類毛刺線蟲屬物種（Paratrichodorus spp.)(例如較小類毛刺線蟲化Minor)或圓形類毛刺線蟲（P. Teres));擬馬鹿圓線蟲 屬物種（Parelaphostrong5dus spp.)(例如薄副鹿圓線蟲（P. Tenuis)) ;Rado地ulus spp.;盾線蟲屬物種（S 州 tel lonerna. spp.);類圓線蟲屬物種（Strongyloides spp.) (例如鼠類圓線蟲化Ratti)或糞類圓線蟲僅Stercoralis));背帶線蟲屬物種 (Teladorsagia spp.)(例如 T.cir 州 mcincta);弓蟲回線蟲屬物種（Toxascaris spp.)(例 如獅弓蝴線蟲（T. Ieonina));弓蝴蟲屬物種（Toxocara spp.)(例如犬弓蝴蟲（T. Canis) 或貓弓蝴蟲（T. Cati);毛線蟲屬物種（Trichinella spp.)(例如T.britovi、旋毛線 蟲（T. Spiralis)或T.spirae);毛刺線蟲屬物種（Trichodorus spp.)(例如相似毛刺 線蟲（T. Similis));鞭蟲屬物種（Trichuris spp.)(例如鼠鞭蟲化Muris)、狐毛首線 蟲化化1口13)或鞭形鞭蟲化Trichiura));小墊刃線蟲屬物種（T}denchulus spp.); 矮化線蟲屬物種（Tylenchorhynchus spp.);鉤蟲屬物種（Uncinaria spp.)(例如小頭 鉤蟲屬扣.Stenoce地ala));吳策線蟲屬物種（Wuchereria spp.)(例如班氏吳策線蟲 (W-Bancrofti));劍線蟲屬物種狂iphinema spp.)(例如標準劍線蟲（Xlndex)或美洲劍 線蟲狂.Americanum))。
[0096] 植物寄生線蟲導致嚴重作物損失。最常見的屬是滑刃線蟲屬（Aphelenchoides) (葉線蟲）、根結線蟲屬（Meloidogyne)(根結線蟲）、胞囊線蟲屬、球胞囊線蟲屬（胞囊線 蟲）（例如，馬鈴墓根線蟲）、珍珠線蟲屬（NaccAbus)、短體線蟲屬（腐線蟲）、莖線蟲屬、劍 線蟲屬、長針線蟲屬、毛刺線蟲屬。其它線蟲攻擊樹皮和林木。該組中最重要的代表是松材 線蟲炬ursaphelenchus巧Io地ilus)，該是松木線蟲，其存在于亞洲和美洲，近來也被發現 于歐洲。
[0097] 正常細胞是指未轉化表型的細胞或表現出待檢測組織類型的未轉化細胞形態的 細胞。
[0098] 有效地連接表示將兩個或多個分子W下述方式組合起來，所述方式使得在組合中 它們可W在植物細胞中正確發揮功能。例如，當啟動子能控制結構基因的轉錄時，啟動子就 是與結構基因有效地連接的。
[0099] 直向同源物是通過來自共同祖先的垂直演化相關的基因，它們編碼在不同物種中 具有相同功能的蛋白質。由于它們在物種形成事件后分離，因此，直向同源物可能有所差 異，但是通常具有序列和結構水平上的相似性。源自共同祖先并且編碼具有相似功能的蛋 白質的兩個基因被稱為直向同源物。對直向同源物的鑒定對于可靠預測新測序基因組中基 因的功能來說是關鍵的。
[0100] 有害生物或祀有害生物包括但不限于；昆蟲、蜘蛛類、甲殼類、真菌、細菌、病毒、線 蟲、扁形動物、蝴蟲、燒蟲、鉤蟲、緣蟲、錐蟲、血吸蟲、狂禍、固陸、壁風、峨和風，它們是人類 環境中遍布的，并且會對植物造成損傷。有害生物可攝入或接觸用雙鏈基因遏制劑轉化的 植物產生的一種或多種細胞、組織或產物。
[0101] 殺蟲劑指意欲用來防止、破壞、擊退或減輕任何有害生物的任何物質或物質的混 合物。殺蟲劑可W是化學物質或生物劑，例如，轉基因植物，其用于抵抗與人類競爭食物、破 壞財產、傳播疾病或令人討厭的有害生物，包括昆蟲、植物病原體、雜草、線蟲和微生物。
[0102] 表型是植物的區別特性或特征，可根據本發明通過將一種或多種"想要的多核巧 酸"和/或可篩選/選擇標記整合進經轉化植物的至少一個植物細胞的基因組中來對其 加W改變。"想要的多核巧酸"和/或標記可通過對經轉化植物細胞或整株植物的大量遺 傳、分子、生物化學、生理、形態或農藝學特征或屬性中的任何一種加W修飾，向經轉化的植 物表型賦予變化。因此，一種或多種穩定整合進植物基因組中的想要的多核巧酸地表達可 能產生選自（但不限于）下述的表型：增加的疾病耐受性、增加的昆蟲耐受性、增加的干旱 耐受性、增強的寒冷和霜凍耐受性、改善的活力（vigor)、增強的顏色、增強的健康和營養特 征、改善的膽藏性、增強的產量、增強的鹽耐受性、增強的重金屬耐受性、增加的水脅迫耐受 性、增強的甜度、改善的活力、改善的味道、改善的質地、減少的磯酸鹽含量、增加的萌發、增 加的微量營養素攝取、改善的淀粉組成W及改善的花壽命。
[0103] 植物組織；"植物"是植物界的多種光合、真核、多細胞生物中的任何生物，其特征 性地產生胚，含有葉綠體并且具有纖維素細胞壁。可根據本發明的方法，對植物的一部分， 目r植物組織"加W處理，W產生轉基因植物。可根據本發明，來轉化很多合適的植物組織， 其包括但不限于：體細胞胚、花粉、葉、莖、愈傷組織、甸旬莖、微塊莖（micro化bers)和枝 條。因此，本發明預想對被子植物和裸子植物的轉化，所述植物例如，金合歡、首薦、蘋果、 杏、朝鮮葫、白蠟樹、天口冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、禪木、山毛棒、黑霉、藍霉、挪菜、 抱子甘藍、甘藍、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿K木墓、花挪菜、雪松、谷類、芹菜、栗、禮、大白菜、 巧橘、克萊口氏小巧橘、H葉草、咖啡、谷物、棉、班豆、黃瓜、柏木、茄子、偷、宦賣菜、按樹、茵 香、無花果、冷杉、老鶴草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍、縣猴 桃、孽藍、落葉松、窩宦、韭蔥、削i、來樣、洋槐、松、鐵線藤、玉米、芒果、械樹、瓜、泰、磨茹、 白芥、堅果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、枯、觀賞植物或花或樹、番木瓜、蹤擱、歐芹、歐洲防風草、 魏豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石惱、馬鈴墓、西葫蘆、 菊宦、蘿K油菜、息鉤子、稻、黑麥、高梁、柳樹、大豆、玻菜、云杉、南瓜、草霉、糖蘿K甘藏、 向日葵、甘墓、甜玉米、紅枯、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、憲青、蔓生植物、核桃、豆瓣 菜、西瓜、小麥、墓葫、紅豆杉和夏南瓜。
[0104] 根據本發明，"植物組織"還包括植物細胞。植物細胞包括息浮培養物、脫腑體、胚、 分生組織區域、愈傷組織、葉、根、枝條、配子體、抱子體、花粉、種子和小抱子。植物組織可W 是多種成熟期的，其可生長于液體或固體培養物中，或者生長于罐、溫室或田間的±壤或適 當的培養基中。植物組織還可指此類植物、種子、子代、繁殖體（無論有性還是無性產生的） W及任何該些的后續傳代物（descendent)(例如插條或種子）的任何克隆。
[0105] 植物轉化和細胞培養；泛指下述工藝，通過所述工藝，對植物細胞進行遺傳修飾， 并將其轉移到合適的植物培養基中用于保持、進一步生長和/或進一步發育。此類方法是 技術人員公知的。
[0106] 子代（progeny);本發明的"子代"，例如，轉基因植物的子代，是由植物或轉基因 植物作為母本或父本產生的或源自其的子代。因此，"子代"植物，即"Fl"代植物是本發明 的方法產生的轉基因植物的后裔或后代。轉基因植物的子代可在其至少一個、一些或全部 的細胞基因組中含有通過本文所述的方法整合進親本轉基因植物細胞的想要的多核巧酸。 因此，想要的多核巧酸被子代植物"傳遞"或"遺傳"。由此在子代植物中遺傳的想要的多核 巧酸可處于T-DNA構建體中，所述構建體也從其親本通過子代植物遺傳。本文中使用的術 語"子代"還可被認為是一組植物的后裔或后代。
[0107] 啟動子：啟動子意欲表示與RNA聚合酶和/或其它轉錄調控元件結合的核酸，優選 地，DNA。和任何啟動子一樣，本發明的啟動子將協助或控制DNA或RNA的轉錄，W從與所述 啟動子有效地連接的核酸分子產生mRNA分子。如前文所述，產生的RNA可編碼蛋白質或多 膚，或者編碼RNA干擾或反義分子。
[0108] 植物啟動子是能起始植物細胞中的轉錄的啟動子，而無論其來源是否是植物細 胞。示例性的植物啟動子包括但不限于；從植物、植物病毒和細菌（例如農桿菌屬或根瘤 菌屬巧hizobium))(其包含在植物細胞中表達的基因）獲得的啟動子。處于發育控制下的 啟動子的例子包括；優先在某些組織（例如，木質部、葉、根和種子）中起始轉錄的啟動子。 此類啟動子被稱為組織優先型啟動子。能僅在某些組織中起始轉錄的啟動子被稱為組織特 異性啟動子。細胞類型特異性啟動子主要驅動一種或多種器官中某些細胞類型（例如，根 或葉中的維管細胞）中的表達，例如根特異性啟動子。誘導型或阻抑型啟動子是處于環境 控制下的啟動子。可通過誘導型啟動子影響轉錄的環境條件的實例包括厭氧條件或光的存 在。組織特異性、組織優先型、細胞類型特異性和誘導型啟動子構成了非組成型啟動子的 組。組成型啟動子是在大多數環境條件下W及在大多數植物部分中具有活性的啟動子。
[0109] 多核巧酸是該樣的核巧酸序列，其包含基因編碼序列或其片段、啟動子、內含子、 增強子區域、聚腺巧酸化位點、翻譯起始位點、5'或3'非翻譯區域、報道基因、可選擇標記 等。多核巧酸可包含單鏈或雙鏈DNA或RNA。多核巧酸可包含經修飾的堿基或經修飾的主 鏈。多核巧酸可W是基因組、RNA轉錄本（例如mRNA)或經加工的核巧酸序列（例如cDNA)。 多核巧酸可包含正義或反義方向的序列。
[0110] 經分離的多核巧酸是并非處于其天然狀態的多核巧酸序列，例如，所述多核巧酸 包含并非在自然界中發現的核巧酸序列，或者所述多核巧酸與其通常接近的核巧酸序列分 開，或者所述多核巧酸與其通常不接近的核巧酸序列相鄰。
[0111] 重組核巧酸序列指該樣的核酸分子，其含有通過誘變、限制性酶等進行的操作產 生的遺傳工程修飾。
[0112] RNA干擾（RNAi)指通過短干擾RNA(SiRNA)介導的、對基因表達（蛋白質合成）的 序列特異性或基因特異性遏制。
[0113] 種子；"種子"可被認為是成熟的植物胚珠（含胚）W及植物的繁殖部分，例如塊 莖或抱子。可在微生物介導的轉化之前，在黑暗中對種子進行賠育，例如W促進萌發。還可 在賠育之前對種子滅菌，例如通過用漂白劑簡單處理。然后可將得到的幼苗暴露給想要的 細菌，W進行轉化。
[0114] 可選擇/可篩選標記；在植物或植物組織中表達時，使得可W將所述植物或植物 組織與不表達該基因的其它植物或植物組織區別開的基因。篩選流程可能需要針對可篩選 標記基因編碼的蛋白質的表達的檢測。可選擇標記的例子包括新霉素磯酸轉移酶（NPTII) 基因（編碼卡那霉素和遺傳霉素（geneticin)抗性）、潮霉素磯酸轉移酶（HPT或APHIV)基 因（編碼對潮霉素的抗性）或本領域已知的其它類似基因。
[0115] 序列同一性；在本文中使用時，在提到兩條核酸序列的上下文中，"序列同一性"或 "同一性"包括指：當在特定區域上為最大程度對應而比對時兩條序列中相同的殘基。當序 列因為保守取代有所不同時，可對百分比序列同一性加W調整，W針對取代的保守性質加 W校正。由于此類保守取代而有所不同的序列被認為具有"序列相似性"或"相似性"。用 于進行該調整的手段是本領域技術人員公知的。
[0116] 在本文中使用時，序列同一性百分比表示；通過在比較窗口上比較兩條最優比對 的序列所確定的值，其中，為了對兩條序列進行最優比對，比較窗口中多核巧酸序列的部分 較之對照序列（不包含添加或缺失）而言可包含添加或缺失（即，空位）。通過下述方法來 計算百分比：測定在兩條序列中出現相同核酸堿基的位置數量，W產生匹配的位置，用所述 匹配位置數除W比較窗口中的位置總數，并將結果乘W 100,產生序列同一性百分比。
[0117] "序列同一性"具有本領域認可的含義，可使用公開的技術來計算。見 COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk,編著（Oxford 化iversity Press, 1988)、 BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PRCUECTS, Smith,編著（Academic Press, 1993)、 COMPUT邸 ANALYSIS OF SEQ肥NCE DATA,部分 I，Griffin&Griffin,編著，（Humana Press, 1994)、沈卵ENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, Von Heinje 編著，Academic Press (1987)、沈卵 ENCE ANALYSIS PRIMER, Gr 化 skov&Devereux,編著.（Macmillan Stockton Press,1991)和 Carillo&Lipton, SIAM J.Applied Math. 48:1073(1988)。 通常用來測定兩條序列間同一性或相似性的方法包括但不限于GUIDE TO HUGE COMPUT邸S, Bishop,編著，（Academic Press, 1994)和上文 Carillo化ipton 中公開的。 用于測定同一性和相似性的方法被編碼為計算機程序。用于測定兩條序列間同一性和相 似性的優選計算機程序方法包括但不限于GCG程序包值evereux等人，Nucleic Acids Research 12:387 (1984))、BLASTN、FASTA (Atschul 等人，J. Mol. Biol. 215:403 (1990))和 FASTDB 炬rutlag 等人，Comp. App. Biosci. 6:237 (1990))。
[0118] 短發夾RNA(ShRNA)是該樣的短單鏈RNA，其具有高度二級結構，使得RNA鏈的一部 分可形成發夾環。
[0119] 短干擾RNA (SiRNA)指大約10至大約30個核巧酸長的雙鏈RNA分子，其具有特異 性干擾基因蛋白質表達的能力并由此得名。
[0120] 祀序列指有害生物中被選來通過雙鏈RNA技術遏制或抑制的核巧酸序列。祀序列 編碼有害生物中重要的特性或生物學活性。
[0121] 轉錄終止子；通常，本發明的表達DNA構建體具有轉錄終止區域，其位于轉錄起始 調控區域的反向端。可就mRNA的穩定性（W增強表達）和/或就加到基因轉錄產物上的 聚腺巧酸化尾的添加，來選擇轉錄終止區域。當H鏈終止密碼子中的任何一個進入核糖體 上的A位點時，剛產生的多膚的翻譯就終止了。翻譯終止密碼子是UAA、UAG和UGA。
[0122] 轉化DNA(T-DNA);細菌T-DNA是公知的遺傳元件，其是能將其邊界內含有的核巧 酸序列整合進另一基因組的元件。在該方面，通常，T-DNA側翼有兩條"邊界"序列。本發明的 想要的多核巧酸和可選擇標記可位于T-DNA的左邊界樣序列和右邊界樣序列之間。T-DNA 中含有的想要的多核巧酸和可選擇標記可與多種不同的、植物特異性的（即，天然的）或外 源的核酸（例如啟動子和終止子調控元件）有效地連接，所述核酸協助其表達（即，想要的 多核巧酸或可選擇標記編碼的DNA序列的轉錄和/或翻譯）。
[0123] 對植物細胞的轉化；通過其將核酸穩定插入進植物細胞基因組的方法。可使用本 領域公知的多種方法，在天然或人工條件下進行轉化。轉化可依賴于用于將核酸序列插入 原核或真核宿主細胞的任何已知方法，其包括：農桿菌介導的轉化方案（例如，"精細轉化" 或"精準育種"）、病毒感染、Whiskers、電穿孔、顯微注射、聚己二醇處理、熱激、脂質體轉染 和粒子轟擊。
[0124] 轉基因植物；本發明的轉基因植物包含至少一個其中已穩定整合了外源核酸的細 胞基因組。根據本發明，轉基因植物是包含僅一個經遺傳修飾的細胞和細胞基因組的植物， 或者是包含一些經遺傳修飾的細胞的植物，或者是其中全部細胞被遺傳修飾的植物。本發 明的轉基因植物可W是僅在植物的某些部分包含想要的多核巧酸（即外源核酸）的表達的 植物。因此，轉基因植物可僅在其結構的某些部分含有經遺傳修飾的細胞。
[0125] 變體；在本文中使用時，"變體"應當被理解為表示與特定基因的標準或給定核巧 酸序列有所不同的核巧酸序列。術語"同等型（iso化rm)"、"同種型（isotype)"和"類似 物"也表示核巧酸序列的"變體"形式。通過一個或多個核巧酸的添加、移除或取代改變的 核巧酸序列可被認為是"變體"序列。"變體"還可指"經改組的基因"，例如Maxygen名下的 專利中描述的。
[0126] 應當理解，本發明并不限于本文描述的特定方法、方案、載體和試劑等，該些都可 W變化。還應當理解，本文所用的術語僅用于描述特定實施方案的目的，而非意欲限制本發 明的范圍。應當注意，除非上下文明確另外指示，在本文和所附權利要求中使用時，單數形 式"一個/ 一種"和"該個/該種"（"a"、"an"和"the")包括復數。因此，例如，提到"一 種基因/基因"時也表示一種或多種基因，并且包括本領域技術人員已知的其等同物等。
[0127] I.祀有害生物
[012引本發明提供了控制有害生物侵襲的方法和構建體，該是通過向有害生物施用祀編 碼序列來實現的，所述序列能對有害生物中必要的生物學功能加W轉錄后阻遏或抑制。在 本文中使用時，術語"有害生物"指昆蟲、蜘蛛類、甲殼類、真菌、細菌、病毒、線蟲、扁形動物、 蝴蟲、燒蟲、鉤蟲、緣蟲、錐蟲、血吸蟲、狂禍、跳圣、壁風、峨和風等，其是人、動物和植物中普 遍存在的。有害生物可攝入或接觸用雙鏈基因遏制劑轉化的植物產生的一種或多種細胞、 組織或產物。
[0129] "有害生物抗性"性狀是使得植物對有害生物攻擊（通常，能造成植物的損傷或損 失）有抗性的轉基因植物宿主的特征。此類有害生物抗性可W是天然突變導致的，或者， 更通常是賦予有害生物抗性的重組DNA的慘入導致的。為向轉基因植物給予昆蟲抗性，可 W例如將重組DNA轉錄為RNA分子，其在重組植物的組織或液體中形成dsRNA分子。所述 dsRNA分子部分地由RNA片段組成，所述RNA片段與喜好在重組植物上進食的昆蟲有害生物 中DNA序列編碼的相應RNA片斷相同。祀昆蟲有害生物中的基因表達被所述dsRNA遏制， 并且對祀昆蟲有害生物中基因表達的遏制導致植物對昆蟲具有抗性。
[0130] 合適的有害生物包括導致對植物或其部分的損傷的任何食植動物。本發明特別包 括昆蟲、線蟲和真菌有害生物。
[0131] 昆蟲有害生物是特別感興趣的，其包括但不限于；來自鱗翅目的，例如，長 翅卷蛾屬物種（Acleris spp.)、褐帶卷蛾屬物種（Adoxo地yes spp.)、透翅蛾屬物種 (Aegeria spp.)、地虎屬物種（Agrotis spp.)、棉葉蟲（Al油ama argillaceae)、Amylois spp.、梨豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis)、黃卷蛾屬物種（Archips spp)、卷蛾屬物種 (Argyrotaenia spp.)、銀紋夜蛾屬物種（Autographa spp.)、Busseola fusca、干果斑頓 (化化a cautella)、桃蛙果蛾（Ca巧osina nipponensis)、禾草頓屬物種（Qiilo spp.)、色 卷蛾屬物種（Qioristoneura spp.)、葡萄果蠢蛾（Clysia ambiguella)、縱卷葉野頓屬物 種（Qiaphalocrocis spp.)、云卷蛾屬物種（Qiephasia spp.)、Coch}dis S卵.、銷蛾屬物種 (Coleo地ora spp.)、大菜頓（Crocidolomia binotalis)、蘋果異形小卷蛾（Crypto地Iebia Ieucotreta)、小卷蛾屬物種（切dia spp.)、桿草頓屬物種值iahaea spp.)、蘇丹棉鈴 蟲值iparopsis castanea)、金剛鉆屬物種巧arias spp.)、粉斑頓屬物種巧地estia spp.)、花小卷蛾屬物種巧ucosma spp.)、女貞細卷蛾巧upoecilia ambiguell)、黃毒蛾 屬物種巧uproctis spp.)、切夜蛾屬物種巧Uxoa spp.)、小食也蟲屬物種（Grapholita spp. )、Hedya nubiferana、實夜蛾屬物種化eliothis spp.)、菜也野頓化ellula undalis)、美國白蛾化yphantria cunea)、番茄蠢蛾化eiferia Iycopersicella)、方度紋 潛蛾（Leucoptera scitella)、柯扁閩屬物種（Lithocollethis spp.)、葡萄花翅小卷蛾 (Lobesia botrana)、毒蛾屬物種（Lymantria spp.)、潛蛾屬物種（Lyonetia spp.)、天幕 毛蟲屬物種（Malacosoma spp.)、甘藍夜蛾（Mamestra brassicae)、煙草天蛾（Manduca sexta)、秋尺蛾屬物種（Operophtera spp.)、玉米頓（Ostrinia Nubilalis)、超小卷蛾屬 物種巧ammene spp.)、褐卷蛾屬物種巧andemis spp.)、小眼夜蛾巧anolis flammea)、紅 鈴麥蛾巧ectinophora gossypiella)、馬鈴墓麥蛾腳Ithorimaea operculella)、萊粉蝶 巧ieris rapae)、粉蝶屬物種巧ieris spp.)、萊蛾巧Iutella ；Kylostella)、Rrays spp.、 白禾頓屬物種（Scii^pophaga spp.)、蛙莖野蛾屬物種（Sesamia spp.)、長須卷蛾屬物種 (Sparganothis spp.)、灰翅夜蛾屬物種（Spodoptera spp.)、Synan化edon spp?、異舟蛾屬 物種（Thaumetopoea spp.)、卷蛾屬物種（Tortrix spp.)、粉斑夜蛾（Trichoplusia ni)和 巢蛾屬物種燈ponomeuta spp.);
[013引來自稍翅目的，例如，叩頭蟲屬物種（Agriotes spp.)、花象屬物種（Anthonomus spp.)、甜萊隱食甲（Atomaria linearis)、甜萊腔跳甲（Qiaetocnema tibialis)、根頭象 甲屬物種（Cosmopolites spp.)、象蟲屬物種（Curculio spp.)、皮蠢屬物種 Oermestes spp.)、食植瓢蟲屬物種巧pilachna spp.)、Eremnus spp.、馬鈴墓葉甲（L 邱 tinotarsa decemlineata)、稻水象屬物種(Xissorhoptrus spp.)、觸金龜屬物種（Melolon化a spp.)、 Oryca 邱 hilus spp.、耳嗦象屬物種（Otiorhynchus spp.)、Phlyctinus spp.、弧麗金龜屬 物種巧opillia spp.)、十節跳甲屬物種巧sylliodes spp.)、蛙長蠢屬物種（Rhizopertha spp.)、金龜甲科（Scarabeidae)、米象屬物種（Sitophilus spp. )、Sitotroga spp.、粉蟲 屬物種（Tenebrio spp.)、擬谷盜屬物種（Tribolium spp.)和斑皮蠢屬物種（Trogoderma S卵?）；
[0133] 來自直翅目的，例如娜屬物種化Iatta spp.)、小娜屬物種化Iattella spp.)、蟲類 帖屬物種（Giyllotalpa spp.)、馬德拉斐娜（Xeucophaea maderae)、飛幢屬物種（Xocusta spp.)、大娜屬物種（[Periplaneta ssp.)和沙鎮幢屬物種（Schistocerca spp.);
[0134] 來自等翅目的，例如散白蟻屬物種Gteticulitemes ssp);
[0135] 來自曬蟲目的，例如動曬屬物種化iposcelis spp.);
[0136] 來自動目（Anoplura)的，例如血動屬物種（Haematopinus spp.)、毛動屬物種 (Linognathus spp.)、動屬物種（[Pediculus spp.)、瘦綿財屬物種（[Pemphigus spp.)和倭 財屬物種腳lylloxera spp.);
[0137] 來自食毛目的，例如Damalinea spp?和曬毛動屬物種（Trichodectes spp.);
[0138] 來自縷翅目的，例如花萄馬屬物種^ranklinella spp.)、籬萄馬屬物種 Glercino化rips spp.)、帶萄馬屬物種（Taeniothrips spp.)、節瓜萄馬（Thrips palmi)、 煙萄馬（Thrips tabaci)和南非黃硬萄馬（Sci:rtothrips aurantii);
[0139] 來自異翅目版teroptera)的，例如，奧蟲屬物種（Cimex spp.)、狄盲曝 (Distantiella theobroma)、棉紅曝屬物種 〇)ysdercus spp.)、Euchis 化 S spp?、扁盾曝屬 物種（Eurygaster spp.)、稻緣曝屬物種（Xeptocorisa spp.)、綠曝屬物種（Nezara spp.)、 皮曝屬物種巧iesma spp.)、紅獵曝屬物種（Rhodnius spp.)、可可褐盲曝（Satdbergella singularis)、黑曝屬物種（Scotinophara spp.)、錐獵曝屬物種（Triatoma spp.)、盲曝 科物種（Miridae family spp.)，例如豆芙草盲曝（Lygus hesperus)和美洲牧草盲曝 (Lygus Iineoloris)、長曝科物種（Xygaeidae family spp.)例如美洲谷桿長曝化 Iissus Ieucopterus)和曝科物種巧entatomidae family spp.);
[0140] 來自同翅目的，例如，棉粉動（Aleurothrixus floccosus)、萊粉動（Aleyrodes brassicae)、腎圓盾階屬物種（Aonidiella spp.)、財科（Aphididae)、財屬物種（Aphis spp.)、圓盾階屬物種（AspidioUis spp.)、甘墓粉動化emisia tabaci)、蠟階屬物 種（Ceroplaster spp.)、Qi:rysomphalus aonidium、網巧草葉圓階（Qiiysomphalus dictyosperm;L)、褐軟蠟階（Coccus hesperidum)、綠小葉婢屬物種（Empoasca spp.)、 Eriosoma larigerum、斑葉蟲單屬物種（Erythroneura spp. )、Gascardia spp.、灰飛動 屬物種（Xaodelphax spp. )、Lacanium corni、蟲厲盾階屬物種（X邱idosaphes spp.)、 Macrosiphus spp.、瘤財屬物種、Nehotettix spp.、褐飛動屬物種（Nilaparvata spp.)、 Paratoria spp.、瘦綿財屬物種、臀紋粉階屬物種（Planococcus spp.)、白盾階屬物 種巧seudaulacaspis spp.)、粉階屬物種巧seudococcus spp.)、木動屬物種巧sylla ssp.)、Pulvinaria aethiopica、笠圓盾階屬物種（Quadraspidiotus spp.)、鑑管財屬物 種（Rhopalosiphum spp.)、珠蠟階屬物種（Saissetia spp.)、帶葉蟲單屬物種（Scaphoideus spp.)、二叉財屬物種（Schizaphis spp.)、谷網財屬物種（Sitobion spp.)、溫室粉 動（Trialeurodes vaporariorum)、非洲木動（Trioza erytreae)和矢尖階（Unaspis citri)；
[0141] 來自膜翅目的，例如Acromyrmex、美切葉蟻屬物種（Atta spp.)、麥莖蜂屬物 種（Cephus spp.)、松葉蜂屬物種 〇)iprion spp.)、松葉蜂科 〇)iprionidae)、Gilpinia polytoma、李實蜂屬物種（Hoplocampa spp.)、毛蟻屬物種（Xasius sppp.)、小家蟻 (Monomorium pharaonis)、新松葉蜂屬物種（Neodiprion spp)、火蟻屬物種（Solenopsis spp.)和胡蜂屬物種（Vespa ssp.);
[0142] 來自雙翅目的，例如，伊蚊屬物種（Aedes spp.)、An化erigona soccata、全北毛蟻 化；Lbio hoi'tulanus)、紅頭麗M (Calliphora eiythroc邱hala)、蠟實M屬物種（Ceratitis spp.)、金蟲畢屬物種（OiiTsomyia spp.)、庫蚊屬物種（Culex spp.)、黃蟲畢屬物種（Cuterebra spp.)、寡鬚實蟲畢屬物種Oacus spp.)、黑尾果蟲畢、廁蟲畢屬物種（；Fannia spp.)、胃蟲畢屬物 種（Gastrophilus spp.)、舌蟲畢屬物種（Glossina spp.)、牛蟲畢屬物種（Hypoderma spp.)、 Hyppobosca spp?、斑潛蟲畢屬物種（Xiriomysa spp.)、綠蟲畢屬物種（Lucilia spp.)、黑潛蟲畢 屬物種（Melanagromyza spp.)、家蟲畢屬物種（Musca ssp.)、狂蟲畢屬物種（Oestrus spp.)、 Orseolia spp?、歐洲麥軒M (Oscinella frit)、天仙子泉M 巧egomyia hyoscyami)、草 種蟲畢屬物種腳iorbia spp.)、蘋繞實M (Rhagoletis pomonella)、覃蚊屬物種（Sciara spp.)、廢蟲畢屬物種（Stomoxys spp.)、配蟲屬物種（Tabanus spp.)、Tannia spp?和大蚊屬 物種（Tipula spp.);
[0143] 來自圣目的，例如角葉圣屬物種（Ceratophyllus spp.)和鼠疫圣（Xenopsylla cheopis) 及
[0144] 來自縷尾目的，例如衣魚（X邱isma saccharina)。
[0145] 特別感興趣的線蟲有害生物包括，例如犬鉤口線蟲（A. caninum)、錫蘭鉤口 線蟲（A. Ce^dancium)、捻轉血矛線蟲（比Contoi'tus)、奧斯特線蟲（0? Ostertagi)、漂 亮新小桿線蟲、C. briggsae、P. pacificus、糞類圓線蟲僅Stercoralis)、鼠類圓線蟲 僅 Ratti)、P. trichosuri、花生根結線蟲（M. Arenaria)、奇氏根結線蟲（M. Qiitwoodi)、 北方根結線蟲（M. Hapla)、南方根結線蟲（M. Incognita)、爪哇根結線蟲（M. Javanica)、 M.paraensis、馬鈴墓金線蟲（G.Rostochiensis)、馬鈴墓白線蟲（G. Pallida)、大豆胞囊 線蟲化Glycines)、甜萊胞囊線蟲GLSchattii)、穿刺短體線蟲（P. Penetrans)、傷殘短 體線蟲（P. Vulnus)、香蕉穿化線蟲化Similis)、Z. punctata、豬蝴蟲（A. Suum)、犬弓蝴蟲 (T. Canis)、馬來絲蟲化Malayi)、犬惡絲蟲〇? Immitis)、旋盤尾絲蟲（0? Volvulus)、狐毛 首線蟲（T. Vulpis)、旋毛線蟲（T. Spiralis)、標準劍線蟲（X. Index)、十二指腸鉤口線蟲 (A. Duodenale)、人蝴蟲（A. Lumbricoides) W及來自下述屬的物種：滑刃線蟲屬、珍珠線蟲 屬、莖線蟲屬、長針線蟲屬、毛刺線蟲屬和傘滑刃線蟲屬。
[0146] 特別感興趣的真菌有害生物包括但不限于：小枝頂抱屬物種（Acremoniella spp.)、鏈格抱屬物種（Alternaria spp.)(例如蕓苔生鏈格抱（Alternaria brassicola) 或索蘭尼（氏）鏈格抱（Alternaria solani))、殼二抱屬物種（Ascochyta spp.)(例如邑宛 豆殼二抱（Ascochyta pisi))、葡萄抱屬物種（[BotITtis spp.)(例如灰葡萄抱化Otiytis cinerea)或富克葡萄抱化otiyotinia fuckeliana))、枝抱屬物種（Cladosporium spp.)、尾抱屬物種（Cercospora spp.)(例如菊池尾抱（Cercospora kikuchii)或 Cercospora zaea-maydis)、枝抱屬物種（Cladosporium spp.)(例如黃枝抱（Cladosporium fulvum))、刺盤抱屬物種（Colletotrichum spp.)(例如豆刺盤抱（Colletotrichum Iindemu 化 ianum))、彎抱屬物種（Curvularia spp.)、色二抱屬物種 Oiplodia spp.) (例如玉米色二抱Oiplodia maydis))、白粉菌屬物種巧iysiphe spp.)(例如Erysiphe graminis f. sp.graminis、 大麥白粉菌（Erysiphe graminis f. sp. hordei)或邑宛豆白粉 菌巧 iysiphe pisi))、Erwinia armylovora、鑲抱屬物種（F'usarium spp.)(例如雪腐鑲 抱（Fusarium nivale)、擬分支抱鑲抱（Fusarium sporotrichioides)、尖鑲抱（Fusarium oxysporum)、禾本科窄廉抱（Fusarium graminearum)、Fusarium germinearum、大刀窄廉抱 (Fusarium culmorum)、腐皮鑲抱（Fusarium solani)、串珠鑲抱（Fusarium moniIiforme) 或粉紅鑲抱（F'usarium roseum))、頂囊殼屬物種（Gaeumanomyces spp.)(例如小麥禾 頂囊殼（Gaeumanomyces graminis f. sp. tritici))、赤霉屬物種(Gibberella spp.) (例如玉蜀泰赤霉（GiLbberella zeae))、長蠕抱屬物種（Helmin化osporium spp.) (例女口 Helminthosporium turcicum、炭色長蠕抱（Helminthosporium carbonum)、玉 蜀泰長蠕抱（Helmin化osporium mavdis)或水稻小球菌棱病菌（Helmin^osporium sigmoideum))、稻小球腔菌（X邱tosphaeria salvinii)、殼球抱屬物種（Macrophomina spp.)(例如萊豆殼球抱（Macrophomina phaseoIina))、Magnaportha spp?(例如稻磕 病菌（Magnaporthe oryzae))、球腔菌屬物種（Mycosphaerella spp.)、從赤殼屬物種 (Nectria spp.)(例如 Nectria heamatococca)、霜霉屬物種巧eronospora spp.)(例如 東北霜霉（Peronospora manshurica)或煙草霜霉（Peronospora tabacina))、莖點霉屬 物種卿ioma spp.)(例如泰萊莖點霉（；Phoma betae))、層誘菌屬物種（[Phakopsora spp.) (例如豆墓層誘菌腳iakopsora pachyrhizi))、瘤梗抱屬物種腳iymatotrichum spp.) (例如多主瘤梗抱腳iymatotrichum omnivorum))、疫霉屬物種腳iytoph化ora spp.) (例如棒疫霉卿iytoph化ora cinnamomi)、惡疫霉卿iytoph化ora cactorum)、萊豆 疫霉腳iytoph化ora phaseoli)、寄生疫霉腳iytoph化ora parasitica)、巧枯褐腐疫 霉(Phytophthora citrophthora)、Phytophthora megasperma f. sp. soiae 或重文病疫 霉腳iytoph化ora infestans))、單軸霉屬物種巧Iasmopara spp.)(例如葡萄生單軸 霉（Plasmopara viticola))、叉絲單囊殼屬物種（Podos地aera spp.)(例如白叉絲單 囊殼（Podos地aera Ieucotricha))、柄鎊菌屬物種（Puccinia spp.)(例如高梁柄鎊 菌（Puccinia sorghi)、條形柄鎊菌（Puccinia striiformis)、小麥禾柄鎊菌（Puccinia graminis f.sp.tritici)、天口冬屬柄鎊菌（Puccinia asparag;L)、隱匿柄鎊菌（Puccinia recondita)或落花生柄鎊菌（Puccinia arachidis))、腐霉屬物種（P}fthium spp.)(例 如瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum))、核腔菌屬物種（Pyrenophora spp.)(例如偃 麥草核腔菌（Pyrenophora tritici-r巧entens)或圓核腔菌（Pyrenophora teres))、 梨抱屬物種（Pyricularia spp.)(例如稻梨抱（Pyricularia Oirzae))、腐霉屬物種 (P}fthium spp.)(例如終極腐霉（P}fthium ultimum))、Miincospo;rium secalis、絲核菌 屬物種巧hizoctonia spp.)(例如立枯絲核菌巧hizoctonia solani)、稻枯斑絲核菌 (Miizoctonia Oiyzae)或禾谷絲核菌（Miizoctonia cerealis))、根霉屬物種（Miizopus spp.)(例如華根霉（Miizopus chinensid))、Scerotium spp.(例如 Scerotium rolfsii)、 核盤菌屬物種（Sclerotinia spp.)(例如核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum))、殼針抱屬 物種（Septoria spp.)(例如番茄殼針抱（Septoria Iycopersici)、大豆殼針抱（Septoria glycines)、穎枯殼針抱（Septoria nodorum)或小麥殼針抱（Septoria tritici))、根串珠 霉屬物種（Thielaviopsis spp.)(例如根串珠霉（Thielaviopsis basicola))、腥黑粉菌 屬物種（Tilletia spp.)、木霉屬物種（Trichoderma spp.)(例如綠色木霉（Trichoderma virde))、鉤絲殼屬物種（Uncinula spp.)(例如葡萄鉤絲殼（Uncinula necator))、玉蜀 泰黑粉菌扣Stilago maydis)(例如玉蜀泰黑粉病）、黑星菌屬物種（Ven化ria spp.)(例 如蘋果黑星菌（VenUiria inaequalis)或梨黑星菌（VenUiria pirina))、或輪枝抱屬物 種（Verticillium spp.)(例如大麗花輪枝抱（Verticillium d址Iiae)或黃萎輪枝抱 (Verticillium albo-atrum))。
[0147] II.鑒定祀序列
[014引本發明提供了一種方法，用于鑒定和獲得包含用于生產dsRNA或SiRNA的核巧酸 序列的核酸。例如，此類方法包括：(a)用包含來自被祀向昆蟲的核巧酸序列或其同源物 的全部或一部分的雜交探針去探測CDNA或基因組DNA文庫；化）鑒定出與雜交探針雜交的 DNA克隆；（C)分離出步驟化）中鑒定的DNA克隆；W及（d)對包含步驟（C)中分離出的克 隆的CDNA或基因組DNA片段測序，其中，被測序的核酸分子轉錄RNA核巧酸序列或其同源 物的全部或相當大部分。
[0149] 此外，本發明包括獲得下述核酸片段的方法，所述核酸片段包含用于生產dsRNA 或SiRNA的相當大部分的核巧酸序列，所述方法包括；(a)合成第一和第二寡核巧酸引物， 其對應于來自被祀向有害生物的核巧酸序列之一的一部分；W及化）使用步驟（a)的第一 和第二寡核巧酸引物，擴增克隆載體中的CDM或基因組DNA模板，其中，被擴增的核酸分子 轉錄本發明的dsRNA或SiRNA的相當大部分。
[0150] 在對本發明的實踐中，祀基因可源自導致對作物植物的損傷并且因此導致產量損 失的任何有害生物。采用若干種標準來選擇優選的祀基因。所述基因是該樣的：其蛋白質 產物具有迅速的周轉率，使得dsRNA抑制導致蛋白質水平上的迅速減少。在某些實施方案 中，選用下述基因是有好處的，所述基因表達水平的小降低就會對受體有害生物造成有害 影響。如果想要祀向寬范圍的昆蟲物種，則例如，選擇在該些物種間高度保守的基因。相反， 為了賦予特異性的目的而言，在本發明的某些實施方案中，選用該樣的基因，其含有在各昆 蟲物種間，或昆蟲與其它生物間保守程度較低的區域。在某些實施方案中，可能想要選用在 其它生物中沒有已知同源物的基因。
[0151] 本文中使用的術語"源自"指可從特定來源或物種獲得的特定的核巧酸序列，但是 不一定要直接從該特定來源或物種獲得。
[0152] 在一種實施方案中，選用在昆蟲腸中表達的基因。祀向在腸中表達的基因避免了 對在昆蟲內部擴散dsRNA的需求。用于本發明的祀基因可包括，例如，與已知腸表達的、編 碼質膜質子V-ATPase的蛋白質組分值OW等人，1997, ；Dow，1999)，例如V-ATPase B或E 亞基的基因的核巧酸序列享有充分同源性的那些。該蛋白質復合體是上皮離子轉運的唯一 增能劑（energizer),并且負責中腸腔的堿化。V-ATPase還在馬氏管中表達，馬氏管是昆蟲 后腸的突起，其作用于液體平衡W及W類似于哺乳動物腎臟器官的方式針對外來化合物解 O
[0153] 在另一實施方案中，選用W重要方式參與昆蟲生長、發育和繁殖的基因。示例性的 基因包括但不限于；核糖體蛋白的結構亞基和目-coatamer基因，CHD3基因。核糖體蛋白如 S4(化S4)和S9(化S9)是參與蛋白質生物合成的核糖體的結構組成成分，它們是胞質小核 糖體亞基的組分，核糖體蛋白如L9和L19是參與定位到核糖體上的蛋白質生物合成的核糖 體的結構組成成分。漂亮新小桿線蟲中的目-coatamer基因編碼蛋白質，其是形成膜小泡 外殼的多聚復合體的亞基。已在不同的生物體（例如擬南芥（Ar油idopsis thaliana)、黑 尾果禍和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae))中發現了相似的序列。還在不同生物體 (例如，馬鈴墓葉甲（Leptinotarsa decemlineata)、辣根猿葉甲（Phaedon cochleariae)、 墨西哥豆瓢蟲巧pilachna varivetis)、墨西哥棉鈴象（Anthonomus grandis)、赤擬谷盜 (Tribolium castaneum)、桃蟲牙（Myzus persicae)、褐飛風（Nilaparvata Iugens)、二化頓 (Qiilo suppressalis)、菜蛾（Plutella xylostella)和居屋艾幡（Acheta domesti州S)) 中發現了相關序列。用于本發明的其它祀基因可包括，例如，在生存能力、生長、發育、繁 殖和侵染性方面具有重要作用的那些基因。該些祀基因包括，例如持家基因、轉錄因子 W及昆蟲特異性基因或新桿狀線蟲屬（Caenorhabditis)或果禍屬值roso地ila)中的 致死敲除突變。用于本發明的祀基因還可W是來自其它生物體的那些，例如，來自線蟲 (例如，根結線蟲屬物種或胞囊線蟲屬物種）、其它昆蟲或蛛形綱（例如，馬鈴墓葉甲屬物 種（Leptinotarsa spp.)、猿葉甲屬物種（Phaedon spp.)、食植瓢蟲屬物種巧pilachna spp.)、花象屬物種（Anthonomus spp.)、擬谷盜屬物種（Tribolium spp.)、瘤閩屬物種、 褐飛風屬物種（Nilaparvata spp.)、禾草頓屬物種（Chilo spp.)、菜蛾屬物種（Plutella SPP.)或Acheta SPP.)。此外，在本發明中用作為祀序列的核巧酸序列還可源自下述病毒、 細菌、真菌、昆蟲或真菌基因，所述基因的功能已從文獻中建立，其核巧酸序列與昆蟲基因 組中的祀基因共享充分相似性。
[0154] 對于可能成為本發明控制的祀的很多昆蟲來說，在關于大多數基因的序列方面 或特定基因突變導致的表型方面信息有限。因此，可基于模式生物（例如新桿狀線蟲屬 (Caenorh油ditis)或果禍屬值roso地ila))中或其它一些昆蟲物種中的相應基因的可獲 得的信息來選擇基因。還可基于其基因已被表征過的其它物種（例如線蟲或真菌物種）的 可獲得的序列信息來選擇基因。在一些情況下，可能通過使用基因名或基因序列的檢索數 據庫（例如GenBank)來獲得來自祀昆蟲的相應基因的序列。一旦獲得了序列，就可W使用 PCR來擴增昆蟲中被適當選出的基因片斷，W用于本發明。
[0155] 為獲得來自昆蟲物種的相應基因的DNA片斷，例如，可基于在漂亮新小桿線蟲或 果蟲電屬中，或其基因已被克隆的昆蟲中發現的序列，來設計PCR引物。對引物加W設計，W 擴增足夠長的DNA片斷，W用于本發明。選擇擴增條件使得即使引物并不精確匹配祀序列 但擴增仍能進行。或者，可使用已知的昆蟲基因作為探針，從制備自昆蟲有害生物物種的基 因組DNA或CDNA文庫，克隆出基因或其部分。用于進行PCR和從文庫克隆的技術是已知 的。在實施例中提供了關于基于W前從昆蟲物種中克隆出的基因序列來從祀昆蟲有害生物 物種分離出DNA片斷的工藝的詳細細節。本領域普通技術人員將認識到，可W用多種技術 來從昆蟲有害生物物種中分離出對應于W前從其它物種分離出的基因的基因片斷。
[0156] III.用于抑制或遏制祀基因的方法
[0157] 本發明提供了使用dsRNA方法抑制一種或多種祀基因在祀有害生物中的基因表 達的方法。本發明特別可用于對真核基因表達加W調節，特別是對下述有害生物中存在的 基因的表達加W調節，所述有害生物展示出大約4. 5至大約9. 5的消化系統抑水平，更優 選地，大約5. 0至大約8. 0,進一步更優選地，大約6. 5至大約7. 5。對于具有展示出上述范 圍之外的抑水平的消化系統的植物有害生物來說，可能需要使用無須攝入dsRNA分子的遞 送方法。
[015引本發明的方法包括將兩種或多種不同的雙鏈RNA或RNA構建體同時或順序提供給 同一昆蟲，使得實現對多條祀基因的下調或抑制，或者使得實現對單個祀基因的更有效的 抑制。
[0159] 或者，通過提供擊中多條祀序列的一種雙鏈RNA來擊中多個祀，W及通過對應于 祀基因的雙鏈RNA片段的超過一個拷貝的存在，來更高效地抑制單個祀。因此，在本發明的 一種實施方案中，雙鏈RNA構建體包含多個dsRNA區域，每個dsRNA區域中的至少一條鏈包 含與昆蟲祀基因的祀核巧酸序列的至少一部分互補的核巧酸序列。根據本發明，RNA構建 體中的dsRNA區域可與相同或不同的祀基因互補和/或dsRNA區域可與來自相同或不同昆 蟲物種的祀互補。由此，在植物宿主細胞中使用此類dsRNA構建體，在植物中建立對單種或 多種昆蟲物種的更為有效的抗性。在一種實施方案中，雙鏈RNA區域包括與祀基因互補的 核巧酸序列的多個拷貝。或者，dsRNA擊中同一祀基因的超過一個祀序列。本發明由此包 括下述經分離的雙鏈RNA構建體，其包含與昆蟲祀的核巧酸序列的至少一部分互補的所述 核巧酸的至少兩個拷貝。開發了擊中多于一個上述祀的dsRNA或者針對不同的上述祀的不 同dsRNA的組合，并將它們用于本發明的方法。 申請人:在W02006/046148中描述了合適的 dsRNA核巧酸和dsRNA構建體，該文獻W其全文引入本文。
[0160] 術語"擊中"及其各種時態形式是表示dsRNA的至少一條鏈與祀基因或核巧酸序 列互補（W及從而可W結合）的替換性措辭方式。
[0161] dsRNA的調節作用可應用于有害生物中表達的多種基因，例如，負責細胞代謝或細 胞轉化的內源基因，包括持家基因、轉錄因子和編碼涉及細胞代謝的多膚的其它基因。
[0162] 在本文中使用時，短語"對基因表達的抑制"或"抑制祀基因在有害生物細胞中的 表達"指來自所述祀基因的mRNA產物和/或蛋白質水平不存在（或可觀察到的減少）。特 異性指能抑制祀基因但不會對細胞的其它基因造成影響W及不會對產生所述dsRNA分子 的細胞中的任何基因造成任何影響的能力。對祀基因在昆蟲有害生物中的基因表達的抑制 可能導致昆蟲有害生物中產生新的表型性狀。
[0163] "基因遏制"指用于降低基因轉錄為mRNA的水平和/或隨后mRNA的翻譯水平的任 何公知方法。基因遏制還意欲表示來自基因或編碼序列的蛋白質表達的降低，該包括轉錄 后基因遏制和轉錄遏制。轉錄后基因遏制由從被祀向遏制的基因或編碼序列轉錄來的mRNA 的全部或部分與相應的用于遏制的雙鏈RNA之間的同源性介導，其指細胞中可獲得來與核 糖體結合的mRNA可獲得的量的充分并且可測量到的降低。轉錄的RNA可W是正義向的，實 現所謂的共遏制，或者是反義向的，實現所謂的反義遏制，或者是雙向的，產生dsRNA，實現 所謂的RNA干擾（RNAi)D
[0164] 轉錄遏制由細胞中dsRNA基因遏制劑的存在介導，所述遏制劑展示出與啟動子 DNA序列或其互補序列的充分序列同一性，W實現被稱為啟動子反式遏制的效果。基因遏 制可對與性狀相關的天然植物基因有效，例如，提供給植物降低的蛋白質（天然基因編碼 的）水平，或增強或降低的受影響代謝物水平。基因遏制還可對植物的下述有害生物中的 祀基因有效，所述有害生物可攝入或接觸含有基因遏制劑的植物材料，所述基因遏制劑具 體地設計用來抑制或遏制在有害生物細胞中一種或多種同源或互補序列的表達。在美國專 利 No. 5, 107, 065、5, 759, 829、5, 283, 184 和 5, 231,020 中公開了反義或正義方向的 RNA 進 行的轉錄后基因遏制，W調控植物細胞中的基因表達。在WO 99/53050、W0 99/49029、美國 專利申請公開No. 2003/0175965和2003/0061626、美國專利申請No. 10/465, 800和美國專 利No. 6, 506, 559和6, 326, 193中，公開了 dsRNA在植物中遏制基因的用途。
[0165] 在植物中進行轉錄后基因遏制的有益方法既利用了正義方向也利用了反義方向 的轉錄RNA，它們作為例如發夾和莖和環結構是穩定的。用于實現轉錄后基因遏制的優選 DNA構建體是該樣的；其中，第一片斷編碼展示出反義方向的RNA，其展示出與被祀向遏制 的基因片斷的充分同一性，其與正義方向的第二片斷相連，所述第二片斷編碼展示出與第 一片斷充分互補的RNA。此類構建體通過第一片斷與第二片斷的雜交W及來自連接兩條片 斷的核巧酸序列的環結構形成莖環結構（見，W094/01550、W098/05770、US 2002/0048814 和 S 2003/0018993)。
[0166] 根據本發明的一種實施方案中，提供了下述核巧酸序列，其體外表達導致下述 dsRNA序列的轉錄，所述dsRNA序列與有害生物中被祀向基因的RNA分子充分同源，所述有 害生物包含有害生物基因組中核巧酸序列編碼的RNA序列。因此，在有害生物攝入或吸收 慘入膳食中或噴霧到植物表面上的dsRNA序列后，就實現了對應于祀有害生物細胞中祀基 因的核巧酸序列下調。
[0167] 使用本發明的dsRNA技術對祀基因的抑制是序列特異性的，因為對應于RNA的雙 鏈體區域的核巧酸序列被祀向進行遺傳抑制。對于抑制而言，含有與祀基因的一部分相同 的核巧酸序列的RNA是優選的。相對于祀序列而言具有插入、缺失和單點突變的RNA序列 也被認為是有效于抑制的。在對本發明的實施中，優選地，抑制性dsRNA和祀基因的部分 至少享有大約80%的序列同一性，或者大約85%的序列同一性，或者大約90%的序列同一 性，或者大約95 %的序列同一性，或者大約99 %的序列同一性或者甚至大約100 %的序列 同一性。或者，可將RNA的雙鏈體區域功能性定義為：能與祀基因轉錄本的一部分雜交的核 巧酸序列。展示出更高同源性但短于全長的序列能夠抵補較長但同源性較少的序列。相同 核巧酸序列的長度可W為至少大約25、50、100、200、300、400、500或者至少大約1000個堿 基。通常，應當使用超過20-100個核巧酸的序列，雖然超過大約200-300個核巧酸的序列 將是優選的，并且超過大約500-1000個核巧酸的序列將是尤其優選的，該取決于祀基因的 大小。本發明具有如下優點；能耐受可能由于遺傳突變、株系多態性或進化趨異性預期的序 列變異。相對于祀基因的初級轉錄產物或經完全加工的mRNA來說，引入的核酸分子可W無 需是絕對同源的，可W無需是全長的。因此，本領域技術人員需要認識到，如本文所公開的， 為實踐本發明，RNA和祀基因之間無需100%的序列同一性。
[016引 IV.制備dsRNA的方法
[0169] 可體內或體外合成dsRNA分子。可通過單條自身互補的RNA鏈或從兩條互補的RNA 鏈來形成dsRNA。細胞的內源RNA聚合酶可介導體內轉錄，或者，可用克隆的RNA聚合酶來 用于體內或體外轉錄。可通過在器官、組織或細胞類型中的特異性轉錄；環境條件（例如， 感染、脅迫、溫度、化學誘導物）的刺激；和/或在發育期或年齡的工程轉錄（engineering transcription)來祀向抑制。RNA鏈可被聚腺巧酸化或者可不被聚腺巧酸化；RNA鏈可W 能夠通過細胞的翻譯設備翻譯為多膚，或者可W不能該樣。
[0170] 本領域技術人員可通過人工或自動反應W化學或酶促方式產生本發明的RNA、 dsRNA、siRNA或miRNA，或在另一生物體中體內產生。還可通過部分或全部的有機合成來產 生RNA ;可W通過體外酶促或有機合成引入任何經修飾的核糖核巧酸。可通過細胞RNA聚 合酶或瞻菌體RNA聚合酶（例如，T3、T7、SP6)來合成RNA。表達構建體的使用和產生都是 本領域已知的（見，例如，WO 97/32016 ;美國專利 No. 5, 593, 874、5, 698, 425、5, 712, 135、 5, 789, 214和5, 804, 693)。如果RNA是通過化學合成或者通過體外酶促合成的話，那么可 在引入細胞之前對RNA進行純化。例如，可使用溶劑或樹脂萃取、沉淀、電泳、色譜或其組合 從混合物中純化出RNA。可選地，可在不純化或盡量少純化的條件下使用RNA，W避免由于 樣品加工造成的損失。RNA可被干燥用于膽存，或者可溶解于水溶液中。溶液可含有緩沖液 或鹽，W促進雙鏈體的退火和/或穩定。
[0171] V.多核巧酸序列
[0172] 根據本發明提供了下述核巧酸序列，其表達產生了與有害生物中被祀向基因的 RNA分子（包含有害生物基因組中核巧酸序列編碼的RNA序列）充分同源的RNA序列。因 此，dsRNA序列被攝入后，可獲得對有害生物細胞中祀基因的核巧酸序列的下調，該導致對 有害生物的保持、生存能力、增殖、繁殖和侵襲來說有害的影響。
[0173] 本文示出的每條"核巧酸序列"都表示為脫氧核糖核巧酸（縮寫為A、G、C和T)序 列。但是，核酸分子或多核巧酸的"核巧酸序列"對于RNA分子或多核巧酸而言表示脫氧核 糖核巧酸的序列，但是對于RNA分子或多核巧酸而言，其表示相應的核糖核巧酸（A、G、C和 U)的序列，其中，給定的脫氧核巧酸序列中的每個胸巧脫氧核巧酸（T)被核糖核巧酸尿巧 扣）替換。
[0174] 在本文中使用時，"核酸"表示從5'到3'末端閱讀的脫氧核糖核巧酸或核糖核巧 酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物。任選地，核酸還可含有下述非天然存在的核巧酸堿基或改變 的核巧酸堿基，其允許聚合酶的正確連讀，并且不會降低所述核酸編碼的多膚的表達。"核 巧酸序列"或"核酸序列"既指核酸的正義鏈也指其反義鏈，并且無論是單個單鏈狀態或處 于雙鏈體中的。
[0175] 術語"核糖核酸"（RNA)包括RNAi (抑制性RNA)、dsRNA (雙鏈RNA)、SiRNA (小干 擾RNA)、mRNA (信使RNA)、miRNA (微小RNA)、tRNA (轉移RNA，無論是否被相應的醜基化氨 基酸加上電荷或卸掉電荷）和CRNA (互補RNA)，術語"脫氧核糖核酸"值NA)包括CDNA和 基因組DNA和DNA-RNA雜交體。
[0176] 本領域技術人員應當將詞匯一"核酸片斷"、"核巧酸片斷"或更一般性的"片 斷"理解為功能性術語，其包括基因組序列、核糖體RNA序列、轉移RNA序列、信使RNA序列、 操縱子序列W及更小的經過改造的核巧酸序列，所述核巧酸序列表達或被改造來表達蛋白 質、多膚或膚。
[0177] 因此，本發明涉及經分離的核酸分子，其包含下述多核巧酸，所述多核巧酸具有選 自沈Q ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、 183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、 473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、 601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813" 862、 863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、 1061'1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、 1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、 1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、 1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730" 2039、 2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、 2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、 2384 - 2460、2461、2466、2471、2476和2481的任何多核巧酸序列的序列。本發明還提供了 沈Q ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、 188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、 478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、 603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、 863、 868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、 1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、1099、 1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、 1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、 1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、 2040、 2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、 2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：M9、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 -2460、2461、2466、2471、2476和2481的多核巧酸序列的功能性片段。本發明還提供了569 ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、 193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、 483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、 605、607、609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、 868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、 1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、1099、1101、 1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、 1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、 1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、 2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、 2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、 2461、2466、2471、2476和2481的任何多核巧酸序列的互補核酸或其片段，W及包含至少 15 個連續堿基的核酸，其與 SEQ ID NO:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、 160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、 255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、 576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、 797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、 1046、1051、1056、1061'1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091、 1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、 1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、 1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、 1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、 2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、2354、2359、2364、2366、 2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 的任何多核巧酸序列雜交。 [017引 本發明還提供了本發明的 SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、 49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、 249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、 521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、 783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、 896、908-1040、1041'1046、1051'1056、1061'1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 的多 核巧酸序列的直向同源物序列及其互補序列和片段。因此，本發明包括下述祀基因，它們是 包含下述核巧酸序列的基因的昆蟲直向同源物，所述核巧酸序列如SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、 11、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、 215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、 503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621" 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813 -862、863、868、873、878、883、888、 890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、 1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、1099、1101'1103、1105、1107、1109、 1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、 1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、 1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、 2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、 2：344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481中任何所示。舉例而言，昆蟲直向同源物可包含SEQ ID N0:49-123、275-434、533-562、 621-738、813-852、908-1010、1161-1437、1730-1987、2120-2290、2384-2438 中任何所示的 核巧酸序列，或其至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個核巧酸的片段。包 含本發明的序列之一的至少巧bp(優選至少17bp)片段的、昆蟲或蛛形綱直向同源物基因 或序列的非限制性列表在表4中給出。
[0179] 本發明還包括下述祀基因，它們是包含下述核巧酸序列的基因的線蟲直向同 源物，所述核巧酸序列如本發明的任何SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、 49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、 249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、 521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、 783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、 896、908-1040、1041'1046、1051'1056、1061'1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1妨7、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 中所 示。舉例而言，線蟲直向同源物可包含本發明的SEQ ID N0s:124-135、435-446、563、564、 739-751、853、854、1011-1025、1438-1473、1988-2001、2291-2298、2439-2440 中任何所示的 核巧酸序列，或者其至少15、16、17、18、19、20或21個核巧酸的片段。根據另一方面，本發明 由此包括本文所述的、用于控制生物體中線蟲生長或者用于防止線蟲侵襲對線蟲感染易感 的生物體的任何方法，所述方法包括：將線蟲細胞與下述雙鏈RNA相接觸，其中，所述雙鏈 RNA包含退火的互補鏈，其中之一具有與下述祀基因的核巧酸序列的至少一部分互補的核 巧酸序列，所述祀基因包含 SEQ ID N0s:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、 160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、 255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、 576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、 797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、 1046、1051'1056、1061、1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091、 1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、 1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、 1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、 1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、 2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、 2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 所示的任何序列的至少 17、 18、19、20或21個核巧酸的片段，由此，所述雙鏈RNA被真菌攝取，并由此控制了生長或防 止了侵襲。本發明還涉及線蟲抗性轉基因植物，其包含SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、 17、19、21、23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、 225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、 515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、 773、778、783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、 894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 所示 的任何序列的至少17、18、19、20或21個核巧酸的片段。包含本發明的序列之一的至少 巧bp(優選至少17bp)的片段的、線蟲直向同源物基因或序列的非限制性列表在表5中給 出。
[0180] 根據另一實施方案，本發明包括下述祀基因，它們是包含下述核巧酸序列的基因 的真菌直向同源物，所述核巧酸序列如本發明的SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、 230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、 517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、 778、783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、 896、908-1040、1041'1046、1051'1056、1061'1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 中 任何所示。舉例而言，真菌直向同源物可包含SEQ ID N0:136-158、447-472、565-575、 752-767、855-862、1026-1040、1474-1571、2002-2039、2299-2338、2441-2460 中任何序列 所示的核巧酸序列，或者其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個核巧酸的片段。 根據另一方面，本發明由此包括本文所述的、用于控制細胞或生物體上真菌生長或者用于 防止真菌侵襲對真菌感染易感的細胞或生物體的任何方法，所述方法包括；將真菌細胞與 下述雙鏈RNA相接觸，其中，所述雙鏈RNA包含退火的互補鏈，其中之一具有與下述祀基因 的核巧酸序列的至少一部分互補的核巧酸序列，所述祀基因包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、 11、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、 215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、 503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、 890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、 1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、1099、I101、I103、1105、I107、I109、 1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、 1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、 1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、 2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、 2：M4、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481所示的任何序列的至少17、18、19、20或21個核巧酸的片段，由此，所述雙鏈RNA被真 菌攝取，并由此控制了生長或防止了侵襲。本發明還涉及真菌抗性轉基因植物，其包含SEQ ID NO:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、 193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、 483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、 605、607、609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、 868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、 1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、1099、1101、 1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、 1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、 1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、 2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、 2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、 2461、2466、2471、2476和2481所示的任何序列的至少17、18、19、20或21個的片段。包含 本發明的序列之一的至少15bp(優選至少nbp)的片段的、真菌直向同源物基因或序列的 非限制性列表在表6中給出。
[01引]在又一實施方案中，本發明的dsRNA分子包含SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、 17、19、21、23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、 225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、 515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、 773、778、783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、 894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 中的 任何序列，雖然 SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160、163、 168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、 259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、 586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、 80U813 -862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、 1056、1061、1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、 1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、 1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、 1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、 1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、 2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2：344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、 2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476和2481中示出的序列是非限制性的。本發明的 dsRNA分子可包含來自有害生物物種的任何連續的祀基因（例如，大約15至大約25或更 多，或大約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25或更多個連續的核巧酸）。
[0182]"經分離的"核酸分子表示已從其天然環境移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，就 本發明的目的而言，DNA構建體中含有的重組DNA分子就被認為是經分離的。經分離的DNA 分子的另外實例包括在異源宿主細胞中保持的重組DNA分子，或溶液中經（部分或充分） 純化的DNA分子。經分離的RNA分子包括本發明的DNA分子的體外RNA轉錄本。根據本發 明，經分離的核酸分子還包括合成生產的那些分子。
[018引本發明的核酸分子可W是RNA(例如mRNA)的形式或DNA的形式，包括，例如，cDNA 或基因組DNA，它們是通過克隆獲得的或合成產生的。DNA或RNA可W是雙鏈或單鏈的。單 鏈DNA可W是編碼鏈，其也被稱為正義鏈，或者其可W是非編碼鏈，該也被稱為反義鏈。
[0184] VI.序列分析
[0185] 除非另有指明，本文中通過對DNA分子進行測序測定的所有核巧酸序列都是用自 動DNA測序儀（例如來自應用生物系統公司（Applied Biosystems, Inc.)的373型）測定 的。因此，如本領域中關于通過該自動手段測定的任何DNA序列而言已知的那樣，本文測定 的任何核巧酸序列可能含有一些錯誤。通常，通過自動方法測定的核巧酸序列與被測序DNA 分子的實際核巧酸序列有至少大約95%同一，更通常，至少大約96%至至少大約99. 9%同 一。可W通過本領域公知的其它手段，包括手動DNA測序法，來更為精確地測定實際序列。 如本領域中還已知的那樣，測定的核巧酸序列中較之實際序列的單個插入或缺失將引起在 核巧酸序列翻譯中移碼，從而，測定的核巧酸序列編碼的預測氨基酸序列可能從此類插入 或缺失之處開始與被測序DNA分子實際編碼的氨基酸序列完全不同。
[0186] 在另一方面，本發明提供了經分離的核酸分子，其包含在嚴格雜交條件下與上文 所述的本發明核酸分子中多核巧酸的一部分雜交的多核巧酸。與多核巧酸的"一部分"雜 交的多核巧酸意指：與參照多核巧酸的至少大約15個核巧酸，更優選地，至少大約20個核 巧酸，仍更優選地，至少大約30個核巧酸，甚至更優選地，超過30個核巧酸雜交的多核巧 酸值NA或RNA)。與參照片段雜交的該些片段可用作為診斷探針和引物。就本發明的目的 而言，當兩條序列能在6XSSC，0. 5% SDS，5XDenhar化'S溶液和IOOy g非特異性運載體 (Carrier)DNA的雜交溶液中形成雙鏈復合體時，那么兩條序列就是能雜交的。見，Ausubel 等人，2. 9部分，supplement增刊27(1994)。序列可在"中等嚴格度"下雜交，其被定義為： 在6XSSC，0. 5% SDS，5XDenhar化'S溶液和IOOyg非特異性載體DNA的雜交溶液中，溫 度為6(TC。對"高嚴格度"雜交而言，溫度增加至68°C。中等嚴格度雜交反應之后，于室 溫下，在2XSSC加0.05% SDS中的溶液中對核巧酸洗涂5次，隨后在6(TC用0. IXSSC加 0. 1% SDS洗1小時。對于高嚴格度而言，洗涂溫度增加至68C。就本發明的目的而言，雜 交的核巧酸是使用Ing具有10, OOOcpm/ng的特異放射性的經放射標記的探針探測到的那 些，其中，在-7(TC暴露給X-射線膠片不超過72小時后，雜交的核巧酸清晰可見。
[0187] 本申請涉及下述核酸分子，它們與 SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、 23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、 247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、 519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、 783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、 896'908-1040、1041'1046、1051'1056'1061'1071'1073'1075'1077'1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 中任 何序列所示的核酸序列至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%、99% 或 100% 同一。但是，優選的是與 SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、 23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、 247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、 519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、 783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、 896、908-1040、1041'1046、1051'1056、1061'1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 所示 的核酸序列至少95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %同一的核酸分子。兩條核酸序列間的 差異可能發生于參照核巧酸序列的5'或3'末端的位置，或者該些末端位置之間的任何地 方，它們可W各自單獨地散布于參照序列的核巧酸中，或者散布在參照序列中的一個或多 個連續的組中。
[0188] 在實踐方面而言，任何特定核酸分子是否與參照核巧酸序列至少95%、96 %、 97%、98%或99%同一是指使用本領域公知的標準算法在兩個分子間進行的比較，該可W 使用公眾可獲得的計算機程序，例如BLASTN算法方便地測定。見，Altschul等人，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997)。
[0189] 在本發明的一種實施方案中，核酸包含具有大約15至大約30(例如，大約15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)個核巧酸的反義鏈，其中，所述反義鏈 與編碼下述蛋白質的RNA序列或其一部分互補，所述蛋白質能控制細胞周期或同源重組， 并且，其中，所述SiNA還包含具有大約15至大約30(例如，大約15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29或30)個核巧酸的正義鏈，并且，其中，所述正義鏈和所述反義 鏈是不同的核巧酸序列，其中，每條鏈中至少大約15個核巧酸與另一條鏈互補。
[0190] 在一種實施方案中，本發明提供了能介導RNA干擾基因沉默的雙鏈核酸分子。在 另一實施方案中，本發明的SiNA分子由下述雙鏈體核酸分子構成，所述核酸分子在包含大 約 15 至大約 30(例如，大約 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)個核 巧酸的寡核巧酸之間含有大約15至大約30個堿基對。在再一實施方案中，本發明的SiNA 分子包含具有大約1至大約32 (例如，大約1、2或3)個核巧酸的突出末端的雙鏈體核酸分 子，例如，大約21-核巧酸雙鏈體，其具有大約19個堿基對和3'端單核巧酸、二核巧酸或H 核巧酸突出端。在再一實施方案中，本發明的SiNA分子包含具有平端的雙鏈體核酸分子， 其中兩端均是平端，或者可選地，其末端之一是平末端。
[01W] 本發明的SiNA分子可包含經修飾的核巧酸，并且同時保留介導RNAi的能力。經 修飾的核巧酸可用于改善體外或體內特征，例如，穩定性、活性和/或生物利用性。例如，本 發明的SiNA分子可包含占SiNA分子中存在的核巧酸總數百分比的經修飾核巧酸。同樣 地，一般而言，本發明的SiNA分子可包含大約5%至大約100%的經修飾核巧酸（例如，大 約 5%、10%'15%'20%'25%'30%'35%'40%'45%'50%'55%'60%'65%'70%'75%、 80%、85%、90%、95%或100%的經修飾核巧酸）。給定的31臟分子中存在的經修飾核巧 酸的實際百分比將取決于SiNA中存在的核巧酸的總數。如果SiNA分子是單鏈的，那么百 分比修飾可基于單鏈SiNA分子中存在的核巧酸的總數。類似地，如果SiNA分子是雙鏈的， 那么，百分比修飾可基于正義鏈、反義鏈或正義和反義兩條鏈中存在的核巧酸的總數。
[0192] VII.核酸構建體
[0193] 重組核酸載體，可W例如是線性質粒或閉合環狀質粒。載體系統可W是單個載 體或質粒或一起含有將引入細菌宿主基因組中的全部核酸的兩個或多個載體或質粒。此 夕F，細菌載體可W是表達載體。例如，可在合適啟動子的控制下，將SEQ ID NO: 1、3、5、7、 9、11、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160、161、162、163、168、173、178、183、188、193、 198、203、208、215、220、225、230、240 - 246、247、249、251、253、255、257、259、275-472、 473、478、483、488、493、498、503、508-512、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、 591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、 813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、 1056、1061、1066-1070、1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091、 1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571'1572、1577、 1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、 1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、 1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、 2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2：344、2349、2354、2359、2364、2366、 2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 示出的核酸分子或其片段適 當地插入載體，所述啟動子在一種或多種微生物宿主中發揮作用，W驅動所連的編碼序列 或其它DM序列的表達。就此目的而言，很多種載體都是可獲得的，對合適的載體的選擇主 要取決于將插入載體的核酸的大小W及將用載體轉化的特定宿主細胞。每種載體都含有多 種組分，該取決于其功能（擴增DNA或表達DNA)和與其相容的特定宿主細胞。對于細菌轉 化而言，載體組分通常包括但不限于下述中的一種或多種：信號序列、復制起點、一種或多 種可選擇標記基因和誘導型啟動子，W允許外源DNA的表達。
[0194] 啟動子
[0195] 提到調控序列和結構核巧酸序列時使用的"有效地連接"表示，調控序列能使得所 連接的結構核巧酸序列受調控表達。"調控序列"或"控制元件"指位于結構核巧酸序列上 游保非編碼序列）、內部或下游保非翻譯序列）的核巧酸序列，其能影響轉錄的時間選 擇和水平或量、RNA加工或穩定性或相關聯的結構核巧酸序列的翻譯。調控序列可包括啟動 子、翻譯前導序列、內含子、增強子、莖環結構、阻抑物結合序列和聚腺巧酸化識別序列等。
[0196] 用于生產mRNA的表達載體還可含有誘導型啟動子，其可被宿主細菌生物體 識別，并且其與感興趣的核酸有效地連接，所述核酸編碼，例如，編碼玉米根蠻葉甲 (D. V. virgifera)mRNA的核酸分子或其片段。適用于細菌宿主的誘導型啟動子包括：目-內 醜胺酶啟動子、大腸桿菌A瞻菌體化和PR啟動子和大腸桿菌半乳糖啟動子、阿拉伯糖啟 動子、堿性磯酸酶啟動子、色氨酸（trp)啟動子和乳糖操縱子啟動子及其變異W及雜合啟 動子，例如tac啟動子。但是，已知的其它細菌誘導型啟動子也是合適的。
[0197] 本發明包括在不同植物物種中具有功能的啟動子。可用于在植物中表達多膚的 啟動子包括；如Odell等人（1985)所述的，誘導型啟動子、病毒啟動子、合成啟動子或組 成型啟動子，和/或受時間調控、受空間調控和受時空調控的啟動子。優選的啟動子包括 增強的CaMV35S啟動子和FMV35S啟動子。就本發明的目的而言，例如，為了對W根為食的 物種進行最優控制，實現該些基因在植物根中的最高水平表達可能是優選的。大量的根增 強啟動子已得到鑒定，它們是本領域中已知的（Lu等人，2000、美國專利No. 5, 837, 848和 6, 489, 542)。
[0198] 在一種實施方案中，植物轉化載體包含經分離的和經純化的DNA分子，其包含與 本發明的一條或多條核巧酸序列有效地連接的啟動子。所述核巧酸序列選自SEQ ID N0:1、 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160、161、162、163、168、173、178、183、188、 193、198、203、208、215、220、225、230、240 - 246、247、249、251、253、255、257、259、275-472、 473、478、483、488、493、498、503、508-512、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、 591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、 813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、 1056、1061、1066-1070、1071、1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091、 1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、 1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、 1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、 1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、 2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、2354、2359、2364、2366、 2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481。所述核巧酸序列包括編碼被 祀向的有害生物RNA轉錄本中存在的RNA的全部或部分的片斷，并且可W包含被祀向的有 害生物RNA全部或部分的倒置重復序列。包含表達載體的DNA分子還可含有位于編碼序列 上游或者甚至位于編碼序列內部的功能性內含子序列，并且還可含有位于啟動子和翻譯起 始點之間的5撇巧'）非翻譯前導序列（即，UTR或5' -UTR)。
[0199] 可選擇標記基因
[0200] 通常，本發明的重組DNA載體或構建體將包含可選擇標記，其賦予植物細胞可選 擇的表型。可選擇標記還可用于選出含有編碼本發明的多膚或蛋白質的外源核酸的植物 或植物細胞。所述標記可編碼殺生物劑抗性、抗生素抗性（例如，卡那霉素、G418、博來霉 素、潮霉素等）或除草劑抗性（例如，草甘麟等）。可選擇標記的實例包括但不限于：neo 基因，其編碼卡那霉素抗性，可使用卡那霉素、G418等來加W選擇；bar基因，其編碼雙丙氨 麟抗性；突變EPSP合酶基因，其編碼草甘麟抗性；膳水解酶基因，其賦予對漠苯膳的抗性； 突變己醜乳酸合酶基因（ALS)，其賦予對咪哇晰麗類和賴醜脈類的抗性；W及氨甲蝶嶺抗 性的DHFR基因。此類可選擇標記的實例在美國專利5, 550, 318、5, 633, 435、5, 780, 708和 6, 118,047中有所闡述。
[0201] 本發明的重組載體或構建體還可包括可篩選標記。可篩選標記可用于監測表達。 示例性的可篩選標記包括；目-葡糖酵酸糖巧酶或UidA基因佑U巧，已知有多種顯色底物可 用于其編碼的酶（Jefferson, 1987 Jefferson等人，1987) ;R-基因座基因，其編碼的產物 調控植物組織中花色素巧色素（紅色）的產生值ellaporta等人，1988);目-內醜胺酶基 因（Sutcliffe等人，1978)，已知有多種顯色底物可用于該基因編碼的酶（例如，PADAC，顯 色的頭抱菌素）；英光素酶基因（Ow等人，1986) ;xy化基因狂Ukowsky等人，1983)，其編碼 兒茶酷加雙氧酶，該酶可轉化顯色的兒茶酷；a-淀粉酶基因（Ika化等人，1990);酪氨酸 酶基因化atz等人，1983)，其編碼能將酪氨酸氧化為DOPA和多己釀（進而縮合為黑色素） 的酶；和a -半乳糖巧酶，其催化顯色的a -半乳糖底物。
[0202] 優選的植物轉化載體包括源自根癌農桿菌的Ti質粒的那些（例如，美國專利 齡.4,536,475、4,693,977、4,886,937、5,501，967和6? 0 122 791)。發根農桿菌質粒（或 "化"）也可使用，其也是本領域已知的。其它優選的植物轉化載體包括公開的那些，例如， Herrera-Estrella(1983)、Bevan(1983)、Klee(1985)和 EP 0 120 516 公開的。
[0203] 一般而言，優選將功能性重組DNA引入到植物基因組的非特異性位置上。在特定 的情況下，通過位點特異性整合來插入重組DNA構建體可能是有用的。存在若干種已知能 使植入物發揮功能的位點特異性重組系統，包括美國專利4, 959, 317公開的cre-lox和美 國專利5, 527, 695公開的FLP-FRT。
[0204] 可使用本領域中可獲得的方法，來容易地制備轉化載體。轉化載體包含一種或多 種下述核巧酸序列，所述序列能被轉錄為RNA分子并且與昆蟲基因組編碼的一種或多種核 巧酸序列充分同源和/或互補，從而，吸收所述RNA后，昆蟲基因組中分別的核巧酸序列中 的至少一種的表達被下調。
[0205] 植物轉化載體可含有來自多于一個基因的序列，由此允許產生多于一種dsRNA， W抑制祀有害生物細胞中兩種或多種基因的表達。本領域技術人員將容易認識到；其序 列對應于不同基因中存在的序列的DNA片斷可被組合為單個復合DNA片斷，用于在轉基因 植物中表達。可選地，可通過在增強子和啟動子和終止子序列之間順序插入額外的DNA片 斷，來修飾本發明的已經含有至少一種DNA片斷的質粒。在設計來抑制多種基因的本發明 的昆蟲控制劑中，將被抑制的基因可W從相同的昆蟲物種獲得，W增強昆蟲控制劑的有效 性。在某些實施方案中，基因可源自不同的昆蟲，W拓寬所述劑有效的昆蟲范圍。當為了 遏制或為了表達和遏制的組合祀向了多種基因時，可按照Fillatti,申請公開文本No. US 2004-0029283的闡述和公開，來構造多順反子DNA元件。
[0206] 轉化載體可被稱為dsDNA構建體，其還可被界定為重組分子、昆蟲控制劑、遺傳分 子或嵌合遺傳構建體。本發明的嵌合遺傳構建體可包含，例如，核巧酸序列，其編碼一種或 多種反義轉錄本、一種或多種正義轉錄本、一種或多種前述每種，其中，轉錄本的全部或部 分與下述RNA分子的全部或部分同源，所述RNA分子包含昆蟲基因組中的核巧酸序列編碼 的RNA序列。
[0207] VIII.用于遺傳工程改造的植物
[020引"植物"是植物界的多種光合、真核、多細胞生物中的任何生物，其特征性地產生 胚，含有葉綠體并且具有纖維素細胞壁。可根據本發明的方法，對植物的一部分，目r植物組 織巧日W處理，W產生轉基因植物。可根據本發明，來轉化很多合適的植物組織，其包括但不 限于；體細胞胚、花粉、葉、莖、愈傷組織、甸旬莖、微塊莖和枝條。
[0209] 因此，本發明包括對被子植物和裸子植物的轉化，所述植物例如，金合歡、首薦、蘋 果、杏、朝鮮葫、白蠟樹、天n冬、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、禪木、山毛棒、黑霉、藍霉、挪 菜、抱子甘藍、甘藍、卡諾拉油菜、甜瓜、胡蘿K木墓、花挪菜、雪松、谷類、芹菜、栗、禮、大白 菜、巧橘、克萊口氏小巧橘、H葉草、咖啡、谷物、棉、班豆、黃瓜、柏木、茄子、偷、宦賣菜、按 樹、茵香、無花果、冷杉、老鶴草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸漿、橡膠鐵杉、山核桃、羽衣甘藍、 縣猴桃、孽藍、落葉松、窩宦、韭蔥、削i、來樣、洋槐、松、鐵線藤、玉米、芒果、械樹、瓜、泰、磨 茹、白芥、堅果、橡樹、燕麥、秋葵、蔥、枯、觀賞植物或花或樹、番木瓜、蹤擱、歐芹、歐洲防風 草、魏豆、桃、花生、梨、沼澤植物、胡椒、柿樹、木豆、松、鳳梨、車前草、李、石惱、馬鈴墓、西葫 蘆、菊宦、蘿K油菜、息鉤子、稻、黑麥、高梁、柳樹、大豆、玻菜、云杉、南瓜、草霉、糖蘿K甘 藏、向日葵、甘墓、甜玉米、紅枯、茶、煙草、番茄、樹、黑小麥、草坪草、憲青、蔓生植物、核桃、 豆瓣菜、西瓜、小麥、墓葫、紅豆杉和夏南瓜。
[0210] 根據本發明，"植物組織"還包括植物細胞。植物細胞包括息浮培養物、脫腑體、胚、 分生組織區域、愈傷組織、葉、根、枝條、配子體、抱子體、花粉、種子和小抱子。植物組織可W 是多種成熟階段的，其可生長于液體或固體培養物中，或者生長于罐、溫室或田間的±壤或 合適的培養基中。植物組織還可指此類植物、種子、子代、繁殖體（無論有性還是無性產生 的）W及任何該些的后續傳代物（例如枝條或種子）的任何克隆。
[0211] 本發明的"子代"，例如，轉基因植物的子代，是由植物或轉基因植物作為母本或父 本產生的或源自其的子代。因此，"子代"植物，即"F1"代植物是本發明的方法產生的轉基 因植物的后裔或后代。轉基因植物的子代可在其至少一個、一些或全部的細胞基因組中含 有通過本文所述的方法整合進親本轉基因植物細胞的想要的多核巧酸。因此，想要的多核 巧酸被子代植物"傳遞"或"遺傳"。由此在子代植物中遺傳的想要的多核巧酸可處于T-DNA 構建體中，所述構建體也從其親本通過子代植物遺傳。本文中使用的術語"子代"還可被認 為是一組植物的后裔或后代。
[0212] "種子"可被認為是成熟的植物胚珠（含胚）W及植物的繁殖部分，例如塊莖或抱 子。可在農桿菌介導的轉化之前，在黑暗中對種子進行賠育，例如W促進萌發。還可在賠育 之前對種子滅菌，例如通過用漂白劑簡單處理。然后可將得到的幼苗暴露給想要的農桿菌 屬菌株或者其它合適的細菌，W進行轉化。
[0213] 本發明還涉及本文所述的方法，其中，所述昆蟲是馬鈴墓葉甲（馬鈴墓甲蟲），所 述植物是馬鈴墓、茄子、番茄、胡椒、煙草、酸漿或稻、谷物或棉。
[0214] 本發明還涉及本文所述的方法，其中，所述昆蟲是辣根猿葉甲（白芥葉甲蟲），所 述植物是芥末、大白菜、憲青葉（turnip greens)、綠色芥藍菜（collard greens)或白菜。
[0215] 本發明還涉及本文所述的方法，其中，所述昆蟲是墨西哥豆瓢蟲（墨西哥豆甲）， 所述植物是菜豆、蕓豆、四季豆、食芙菜豆、利馬豆、綠豆、青豆、牛眼豆、絨毛豆（velvet bean)、大豆、班豆、木豆、H葉草或首薦。
[0216] 本發明還涉及本文所述的方法，其中，所述昆蟲是墨西哥棉鈴象（棉鈴象蟲甲）， 所述植物是棉。
[0217] 本發明還涉及本文所述的方法，其中，所述昆蟲是赤擬谷盜（赤擬谷盜），所述植 物是膽藏谷類（grain)產品，例如，面粉、谷物、餐食、餅干、豆類、香料、食用面食、蛋糕混合 料、干寵物食品、干花、巧克力、堅果、種子甚至干的博物館標本。
[021引本發明還涉及本文所述的方法，其中，所述昆蟲是桃閩（桃閩），所述植物是樹， 例如李屬（Prunus),特別是桃、杏和李；茄科（Solanaceae)、黎科（Chenopodiaceae)、菊科 (Compositae)、十字花科（Cruciferae)和葫蘆科（Qicurbitaceae)的蔬菜作物，其包括但 不限于，朝鮮葫、天口冬、菜豆、甜菜、挪菜、抱子甘藍、甘藍、胡蘿K花挪菜、甜瓜、芹菜、谷 物、黃瓜、茵香、羽衣甘藍、孽藍、憲青、茄子、窩宦、白芥、秋葵、歐芹、歐洲防風草、魏豆、胡 椒、馬鈴墓、蘿K玻菜、南瓜、番茄、憲青、豆瓣菜和西瓜；田間作物，例如但不限于，煙草、糖 蘿h和向日葵；花弁作物或其它裝飾植物。
[0219] 本發明還涉及本文所述的方法，其中，所述昆蟲是褐飛風，所述植物是稻種n。
[0220] 本發明還涉及本文所述的方法，其中，所述昆蟲是二化頓（稻二化頓），所述植物 是稻植物、大麥、高梁、玉米、小麥或草。
[0221] 本發明還涉及本文所述的方法，其中，所述昆蟲是菜蛾（菜蛾），所述植物是蕓苔 屬炬rassica)物種，其例如但不限于，甘藍、大白菜、抱子甘藍、羽衣甘藍、油菜、挪菜、花挪 菜、憲青、白芥或蘿h。
[0222] 本發明還涉及下述本文所述的方法，其中，所述昆蟲是居屋艾幡（家幡蜂），所述 植物是本文所述的任何植物或任何有機物質。
[0223] IX.用于遺傳工程的方法
[0224] 本發明包括將核巧酸序列引入植物，W使得一種或多種dsRNA分子W能抑制有害 生物的水平表達。可通過本領域已知用來將重組序列引入祀宿主細胞的標準流程，來將本 發明的多核巧酸和多膚引入宿主植物細胞。此類流程包括但不限于：轉染、感染、轉化、天 然攝取、磯酸巧、電穿孔、顯微注射生物射彈和微生物介導的轉化方案。見，例如，Miki等 人，1993, "Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants", In:Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick 和 Thompson,編著，CRC Press, Inc. , Boca Raton, pages 67-88。選用的方法隨宿主植物而變化。
[0225] 微生物介導的基因轉移指使用微生物將外源基因引入宿主植物。雖然農桿菌屬 Olorsch等人，Science 227:1229-31,1985)已廣泛用于將基因轉移進植物，但是其并非唯 一的能轉化植物的細菌。例如，已經顯示，除農桿菌屬之外的若干細菌物種可被修飾，W介 導基因轉移進不同的植物。來自兩個科H個屬的細菌--根瘤菌屬物種巧hizobium SP.) NGR234、首薦中華根瘤菌和百脈根生慢生根瘤菌可通過獲得卸甲Ti質粒和二元載體而能 進行基因轉移。化OOthaedSiW.等人化Uire Feb 10, 433(7026) :629-633(2005)。使用葉 盤、源自盾片的愈傷組織或浸花法（floral dip),用該些非農桿菌屬物種，實現了對H種植 物物種一煙草、稻和擬南芥的穩定轉化。因此，當攜帶有卸甲Ti質粒和二元載體（或推 測來說，共整合或整個Ti質粒）時，與不同植物相關聯的細菌能夠易于向植物轉移T-DNA， 其可根據本發明使用。
[0226] 本發明的轉基因植物是該樣的植物，其包含其中已穩定整合了外源核酸的至少一 個細胞基因組。根據本發明，轉基因植物是包含僅一個經遺傳修飾的細胞和細胞基因組的 植物，或者是包含一些經遺傳修飾的細胞的植物，或者是其中所有細胞都被遺傳修飾的植 物。本發明的轉基因植物可W是包含想要的多核巧酸（即，外源核酸）在植物的僅某些部 分表達的植物。因此，轉基因可W僅在其結構的某些部分包含經遺傳修飾的細胞。
[0227] 用于產生轉基因植物W及在植物中表達異源核酸的方法是特別已知的，其可與本 文提供的核酸一起使用，W制備展示出對祀有害生物的進食的易感性降低的轉基因植物。 例如，可通過將本文公開的產生dsRNA的核酸插入植物轉化載體來制備植物轉化載體，并 且將它們引入植物。一種已知的載體系統源自對根癌農桿菌的天然基因轉移系統的修飾。 該天然系統包含大Ti (腫瘤誘導）質粒，其中含有已知為T-DNA的大片斷，其被轉移進經轉 化植物。Ti質粒的另一片斷一Vir區域負責T-DNA轉移。T-DNA區域的邊界是末端重復 序列。在經修飾的二元載體中，腫瘤誘導基因已被缺失，Vir區域的功能被用來轉移T-DNA 邊界序列作邊界的外源DNA。T-區域還可含有可選擇標記（用于高效回收轉基因植物和細 胞）W及多克隆位點（用于插入序列，W轉移編碼dsRNA的核酸）。
[022引通常，使用農桿菌屬或其它微生物介導的轉化方法形成的轉基因植物含有插入一 個染色體中的重組核巧酸序列，其被稱為轉基因事件。此類轉基因植物可被認為對于插入 的外源序列是雜合的。可通過將獨立的分離子轉基因植物自交，產生Fl種子，來獲得轉基 因純合的轉基因植物。產生的Fl種子中有四分之一是對于轉基因而言純合的。令Fl種子 萌發，產生植物，可針對雜合性或純合性對該些植物加W測試，通常，使用允許區分開雜合 子和純合子的SNP測定或熱擴增測定（即，接合性測定）來進行。
[0229] 因此，本發明還提供了包含本發明的多核巧酸或多膚的植物或植物細胞。在一種 實施方案中，植物是被子植物或裸子植物。除了植物的常規含義，術語"植物"還意欲表示 植物的果實、種子、花、球花等。本發明的植物可W是直接的轉染子，意思是載體直接引入植 物，例如通過農桿菌，或者，植物可W是經轉染植物的子代。還可通過經轉染植物的無性繁 殖來獲得子代。第二代或后續世代的植物可W或可W不通過有性繁殖（即，受精）產生。此 夕F，植物可W是配子體（單倍體階段）或抱子體（二倍體階段）。
[0230] X.傳統育種/雜交
[0231] 除了用重組核酸構建體直接轉化植物之外，可W通過將具有重組核酸構建體的第 一植物與缺乏該構建體的第二植物雜交來制備轉基因植物。例如，可將用于基因遏制的重 組核酸引入第一植物系，其可被轉化，W產生可與第二植物系雜交的轉基因植物，W將用于 基因遏制的重組核酸漸滲入第二植物系。
[0232] 在雄性不育植物中表達重組核酸構建體可能是有好處的，例如作為用于降低對轉 基因流向周圍植物的關注的手段。
[0233] 實踐中，本發明可與植物中的其它昆蟲控制性狀組合，W實現想要的性狀，用于增 強對昆蟲侵襲的控制。將利用不同作用模式的昆蟲控制性狀組合起來可提供被保護免受昆 蟲侵襲的轉基因植物，其較之攜帶單個昆蟲控制性狀的植物而言具有更好的耐久性，因為 在田間抗性發展有降低的可能性。
[0234] 某些dsRNA構建體與一種或多種有害生物控制蛋白質基因的組合可能導致協同 性，其能增強轉基因植物的有害生物控制表型。利用人工膳食或整個植物組織對有害生物 進行的生物測定可用于：例如定義對使用dsRNA和有害生物控制蛋白質時幼蟲死亡率或生 長抑制的劑量應答。本領域技術人員可在生物測定中對dsRNA分子和有害生物控制蛋白質 的混合物加W測試，W鑒定出活性組合，所述活性是協同的并且是在受保護免遭有害生物 侵襲的植物中配置所希望的（T油ashn化，1992)。已報道了不同昆蟲控制蛋白質之間殺死有 害生物的協同性（綜述見Schnepf等人，1998)。應當預見到，協同性將存在于某些dsRNA 之間，W及存在于某些dsRNA和某些昆蟲控制蛋白質之間。
[0235] XI.定量對祀基因表達的抑制
[0236] 可通過測量內源祀RNA或通過祀RNA的翻譯產生的蛋白質，來定量對祀基因表達 的抑制，并且可W通過檢查細胞或生物的外部性質來驗證抑制的結果。用于對RNA和蛋白 質進行定量的技術是本領域普通技術人員公知的。可獲得賦予對氨予青霉素、博來霉素、氯 霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、氨甲蝶嶺、麟絲菌素、嘿嶺霉素、壯觀霉素、利 福霉素和四環素等的抗性的多種可選擇標記。
[0237] 在某些實施方案中，基因表達被抑制至少10 %，優選地，至少33 %，更優選地，至 少50%，還更優選地，至少80%。在本發明的特別優選的實施方案中，有害生物的細胞中， 基因表達被抑制至少80 %，更優選地，至少90 %，更優選地，至少95 %，或者至少99 %，所W 發生顯著的抑制。顯著的抑制意欲指該樣的顯著抑制，其產生可探測到的表型（例如，幼蟲 生長的停止、痛疾或死亡等）或可探測到的、對應于被抑制的祀基因的RNA和/或蛋白質的 減少。雖然在本發明的某些實施方案中，抑制在昆蟲的幾乎所有細胞中發生，但是在其它一 些優選的實施方案中，抑制僅在表達該基因的細胞亞群中發生。例如，如果將被抑制的基因 在昆蟲消化道的細胞中發揮重要作用，那么對該些細胞中基因的抑制就足W向昆蟲施加有 害作用。
[023引 XII.產物
[0239] 本發明還提供了含有本發明的一種或多種序列、W及從含有一種或多種本發明核 巧酸序列的重組植物或種子生產的商品產品。含有本發明的一種或多種序列的商品產品意 欲包括但不限于；餐食、油、經磨碎的或完整的植物種粒或種子、任何食物產品（包括任何 的餐食、油或重組植物或種子的經磨碎的或完整的谷粒）或任何青膽飼料、纖維、紙或源自 含有本發明的一種或多種序列的本發明植物的其它產品。對商品產品中本發明序列的探測 提供了切實的證據：即商品包含表達本發明序列的轉基因植物或其部分，所述本發明序列 使用dsRNA介導的基因遏制方法控制有害生物侵襲。
[0240] 水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水
[0241] 下文提供了關于鑒定包含至少一種或多種雙鏈RNA分子的祀序列，W及將所述祀 序列引入植物的方法的特定實施例，所述雙鏈RNA分子在本文示例出，用于遏制有害生物 中重要特性或功能。它們僅作示例用，而非對本發明加W限制。
[0242] 實施例1 ;在高通量篩選中沉默漂亮新小桿線蟲中的漂亮新小桿線蟲祀基因
[0243] 在PGN9A載體（WO 01/88121)中制備漂亮新小桿線蟲全基因組文庫，其處于兩個 相同的T7啟動子和終止子之間，在T7聚合酶表達（被IPTG誘導）的情況下驅動其在正義 和反義方向上的表達。
[0244] 將該文庫轉化進96孔板形式中的細菌菌株AB301-105(DE3)中。為進行全基因組 篩選，將該些細菌細胞喂飼給核酸酶缺陷型漂亮新小桿線蟲nuc-1 (el392)株系。
[0245] 按照下文所述，在96孔板形式中將細菌菌株AB301-105 (DE3)產生的dsRNA喂飼 給漂亮新小桿線蟲nuc-1 (el392)蟲：將nuc-1卵轉移至單獨的板上，令其同時在2(TC賠 化，W使得Ll世代同步。向96孔板中裝入100 y L包含IPTG的液體培養基W及10 y L漂 亮新小桿線蟲dsRNA文庫的AB301-105(DE3)細菌細胞培養物（ODe。。為1)，所述文庫每個都 攜帶有具漂亮新小桿線蟲基因組片段的載體，用于表達dsRNA。向每個孔中加入4只同步的 Ll蟲，在25C賠育至少4至5天。該些實驗都采用一式四份來進行。在篩選中使用6個對 昭.
[0246] pGN29 =陰性對照，野生型
[0247] pGZl = unc-22 =顫搖者表型
[024引 pGZlS =幾下質合酶=胚胎致死
[0249] pGZ25 = pos-1 =胚胎致死
[0 巧 0] pGZ59 = bli-4D =急性致死
[0巧1 ] ACC =己醜輔酶A駿化酶=急性致死
[0巧2] 5天后，將用產生dsRNA的細菌喂飼的漂亮新小桿線蟲nuc-1 (el392)蟲的表型與 用空載體（PGN29)和其它對照喂飼的蟲的表型相比較。針對致死性（急性或幼蟲），親本 (Po)世代的致死性，第一子代（Fl)世代的（胚胎）致死性，或者針對化的生長延緩，對用 dsRNA喂飼的蟲加W篩選，該按照下文所述來進行；（i)化的急性致死性；Ll蟲沒有發育并 且死亡，該表型沒有產生子代，孔看起來相當地空；（ii)化的（幼蟲）致死性：化在Ll之后 的期死亡，該表型也沒有產生子代。在孔中發現了死亡的幼蟲或死亡的成蟲；（iii)Fl的致 死性；Ll蟲發育到成年期，并且仍然活著。該表型沒有子代。該可能是由于不育、胚胎致死 性（在孔底有死亡的卵）、胚胎停止或幼蟲停止（最終死亡）；（iv)生長停止或生長延緩/ 延遲；與具有正常發育或正常子代#的孔比較。
[0巧3] 對于表IA中示出的祀序列而言，我們推斷出，dsRNA介導的線蟲（例如漂亮新小 桿線蟲）中漂亮新小桿線蟲祀基因的沉默對于蟲的生長和生存能力具有致命影響。
[0巧4] 上述dsRNA沉默實驗之后，在24孔板上，W高通量模式，在漂亮新小桿線蟲中進行 了更為詳細的表型實驗。按照下文所述，將上文所述的細菌菌株AB301-105(DE3)中產生 的dsRNA文庫喂飼給24孔板上的漂亮新小桿線蟲nuc-1 (el392)蟲：將nuc-1卵轉移至單 獨的板上，令其同時在2(TC賠化，W使得Ll世代同步。隨后，將100只同步的Ll蟲浸泡于 500 y L S-完全喂飼培養基（包含5 y g/mL膽固醇、4 y L/mL PEG和ImM IPTG)和500 y L 漂亮新小桿線蟲dsRNA文庫的AB301-105(DE3)細菌細胞培養物（ODe。。為1)中，所述文庫 每個都攜帶有具漂亮新小桿線蟲基因組片段的載體，用于表達dsRNA。在25C對浸泡的Ll 蟲進行2小時搖晃。
[0巧日]離也并除去950 y L上清液之后，將5 y L剩余的且重息的沉淀（包含大約10至15 只蟲），轉移進24孔板的每個孔的中部，所述孔裝有瓊脂LB肉湯層。在25C對經接種的板 進行2天賠育。在成年期，單獨選出1只成蟲并在25C賠育2天，W觀察其子代。對其它成 蟲的觀察在原來的24孔板上原位進行。該些實驗一式四份進行。
[0巧6] 用第二批蟲重復進行該種詳細的表型篩選，唯一的不同在于，第二批蟲在2(TC賠 育3天。
[0257] 將用漂亮新小桿線蟲dsRNA喂飼的蟲的表型與用空載體喂飼的漂亮新小桿線蟲 nuc-l(el392)蟲的表型相比較。
[025引基于該實驗推斷出；對表IA中示出的漂亮新小桿線蟲祀基因的沉默對于蟲的生 長和生存能力有致命影響，該祀基因對線蟲生存能力來說是重要的。因此，該些基因是通過 dsRNA介導的基因沉默控制（殺死或防止其生長）線蟲的良好祀基因。因此，本發明包括上 述漂亮新小桿線蟲祀基因的線蟲直向同源物控制線蟲侵襲，例如植物的線蟲侵襲的用途。
[0259] 實施例2 ;對黑尾果禍直向同源物的鑒定
[0260] 如上文實施例1中所述，鑒定出了多種漂亮新小桿線蟲致死序列，它們可用于鑒 定其它物種和屬中的直向同源物。例如，可用漂亮新小桿線蟲致死序列來鑒定直向同源的 黑尾果禍序列。目P，可用每條漂亮新小桿線蟲序列就黑尾果禍中的直向同源序列去檢索公 共數據庫，例如GenBank。選出可能的黑尾果禍直向同源物，其享有高度序列同源性巧值 優選小于或等于1E-30)，并且序列是blast相互最佳擊中化it)，后者表明來自不同生物體 (例如漂亮新小桿線蟲和黑尾果禍）的序列是彼此最高的blast擊中。例如，使用BLAST， 將來自漂亮新小桿線蟲的序列C與黑尾果禍中的序列相比。如果黑尾果禍序列D是序列C 的最佳擊中，并且當將D與漂亮新小桿線蟲的所有序列進行比較時也得到序列C，那么D和 C就是相互最佳擊中。該標準通常用于定義直向同源性，該表示不同物種中具有相似功能的 相似序列。黑尾果禍序列標識符示于表IA中。
[0261] 實施例3 ;馬鈴墓葉甲（馬鈴墓甲蟲）
[0262] A.從馬鈴墓葉甲克隆部分基因序列
[026引按照廠商說明書，使用TRIzol試劑（目錄化.15596-026/15596-018,英杰生命 科學公司（Invitrogen), Rockville, Maryland, USA),從馬鈴墓葉甲（馬鈴墓甲蟲的來源： Jeroen van Schaik,Entocare CV Biologische Gewasbescherming, Postbus 162,6700AD Wageningen，荷蘭）的四種不同幼蟲期分離高質量的完整RNA。按照廠商說明書（目錄 化.1700,普洛麥格公司（Promega))，通過面ase處理，除去RNA制備中存在的基因組DNA。 按照廠商說明書，使用可商購試劑盒（Superscript ? III逆轉錄酶，目錄化.18080044， 英杰生命科學公司（Invitrogen), Rockville, Ma巧land, USA)，產生 cDNA。
[0264] 為分離出包含 LDOOl、LD002、LD003、LD006、LD007、LDOlO、LDOlI、LD014、LD015、 LD016和LD018基因的部分的cDNA序列，按照廠商說明書，使用Amplitaq Gold(目錄 化.N8080240,應用生物系統公司（Applied Biosystems)),用簡并引物進行一系列PCR反 應。
[0265] 用于擴增每條基因的簡并引物的序列給于表2-LD中，該表展示了馬鈴墓葉甲祀 基因，包括引物序列和獲得的CDNA序列。該些引物用于各PCR反應中，其中采用如下條 件；95°C 10分鐘，接著進行40個95°C 30砂、55°C I分鐘和72°C I分鐘的循環，接著在 72C 10分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR片段，將其純化（QIAquick凝膠提取試劑盒 (QIAquick Gel Extraction kit),目錄化.28706,快而精公司（Qiagen)),克隆進 pCR8/ GW/topo載體（目錄化.K250020,英杰生命科學公司（Invitrogen))，并測序。得到的PCR 產物的序列由表2-LD給出的各SEQ ID NO示出，它們被稱為部分序列。相應的部分氨基酸 序列由表3-LD中給出的各SEQ ID NO示出，其中，讀框的起點用括號示出。
[0266] B.馬鈴墓葉甲基因的dsRNA產生
[0267] 使用可商購試劑盒T7I?ibomax? Express RNAi系統（目錄化.P1700,普洛麥格 公司（Promega))，合成毫克級的dsRNA。首先，在兩個分別的PCR反應中產生兩種分別的單 5'T7RNA聚合酶啟動子模板，每個反應含有相對T7啟動子而言不同方向的祀序列。
[026引就每種祀基因而言，使用特異性的T7正向引物和特異性的反向引物來產生正義 T7模板。用于擴增每種祀基因的正義模板的各引物的序列給于表8-LD中。PCR反應條件 如下所述；95°C 4分鐘，接著是35個95C 30砂、55C 30砂和72C 1分鐘的循環，接著 在72C 10分鐘。在采用與上述相同的條件的PCR反應中，使用特異性正向引物和特異性 T7反向引物來產生反義T7模板。用于擴增每種祀基因的反義模板的各引物的序列給于 表8-LD中。在瓊脂糖凝膠上分析得到的PCR產物，通過PCR純化試劑盒（Qiaquick PCR Purification Kit,目錄化.28106,快而精公司（Qiagen))對其進行純化，并進行化Cl化 沉淀。將產生的T7正向和反向模板混合起來W被轉錄，將得到的RNA鏈退火，用面ase和 RNase進行處理，并且通過己酸軸純化，該都按照廠商說明書來進行。針對每種祀基因得到 的dsRNA的正義鏈示于表8-LD中。表8-LD展示了用于制備馬鈴墓葉甲祀序列的dsRNA片 段和多聯體序列的序列，包括引物序列。
[0269] C.將馬鈴墓葉甲基因克隆進植物載體地7GWIWG2DQI)
[0270] 鑒于RNA干擾的機制是通過dsRNA片段起作用的，因此W反義和正義方向克隆上 文選出的祀基因的祀核巧酸序列，其通過內含子-CmR-內含子分開（其中CmR是氯霉素抗 性標記），W形成dsRNA發夾構建體。在含attL的進入克隆（見實施例1)和含attR的目 的載體（=地7GWIWG2D(II))間使用LR重組反應來產生該些發夾構建體。通過材料運送協 議（Material Transfer Agreement)從VIB/植物系統生物（VIB/Plant Systems Biology) 獲得植物載體地7GWIWG2DQI)。按照廠商說明書，使用LR Clonase? II酶混合物（目錄 化.11791-020,英杰生命科學公司（Invitrogen))來進行LR重組反應。該些克隆實驗產生 了針對LD002、LD006、LD007、LD010、LD011、LD014和LD016基因中每種的發夾構建體，它們 具有啟動子-正義-內含子-CmR-內含子-反義方向，或者啟動子-反義-內含子-CmR-內 含子-正義方向，其中，啟動子是植物的可操作的35S啟動子。具有35S啟動子的二元載體 PK7GWIWG2D(II)適于進行向根癌農桿菌中的轉化。
[027U 對于LD002而言，在克隆進pCR8/GW/topo的LD002上用限制性酶BsoBI和PvuI進 行雙消化（見實施例3A)。對于LD006而言，在克隆進pCR8/GW/topo的LD006上用限制性 酶BsoBI進行消化（見實施例3A)。對于LD007而言，在克隆進pCR8/GW/topo的LD007上 用限制性酶BsoBI進行消化（見實施例3A)。對于LD007而言，在克隆進pCR8/GW/topo的 LD007上用限制性酶BsoBI進行消化（見實施例3A)。對于LDOlO而言，在克隆進PCR8/GW/ topo的LDOlO上用限制性酶PvuI和Pvun進行雙消化（見實施例3A)。對于LD014而言， 在克隆進pCR8/GW/topo的LD014上用限制性酶BsoBI進行消化（見實施例I)。對于LD016 而言，在克隆進pCR8/GW/topo的LD016上用限制性酶BsoBI進行消化（見實施例3A)。使 用Qiaquick凝膠提取試劑盒（目錄化.28706,快而精公司（Qiagen))來純化含有感興趣 基因（側翼有attL位點）的條帶。將150ng量的經純化片段和15化甜K7GWIWG2DQI)與 LR克隆酶（Clonase) II酶加到一起，在25C溫育至少1小時。蛋白酶K溶液處理（37C 10 分鐘）之后，將整個重組混合物轉化進Top 10化學感受態細胞。通過限制性消化分析選出 陽性克隆。對于下述發夾構建體的完全序列：
[027引-對LD002(反義-內含子-CmR-內含子-正義）而言，示于SEQ ID NO:: 240中； [027引-對LD006 (正義-內含子-CmR-內含子-反義）而言，不于SEQ ID NO: : 241中； [0274]-對LD007(正義-內含子-CmR-內含子-反義）而言，示于SEQ ID NO:: 242中； [027引-對LDOlO (正義-內含子-CmR-內含子-反義）而言，不于SEQ ID NO: : 243中；
[0276] -對LDOll (反義-內含子-CmR-內含子-正義）而言，示于SEQ ID NO:: 244中；
[0277] -對LD014(正義-內含子-CmR-內含子-反義）而言，示于SEQ ID NO:: 245中； [027引-對LD016(反義-內含子-CmR-內含子-正義）而言，在SEQ ID NO:: 246中給 出；
[0279] 表9-LD提供了針對每種發夾構建體的完全序列。
[0280] D.使用人工膳食，就對馬鈴墓葉甲的活性來篩選dsRNA祀
[0281] 用于馬鈴墓甲蟲的人工膳食如下文所述來制備（對Gelman等人，2001，J. Ins. Sc.,卷1，號7, 1-10做了一些改變）；對水和瓊脂進行高壓滅菌，當溫度降到55C時加入 剩余的成分（如下表2所示）。在該溫度，將成分很好地混合起來，之后將膳食等分到24孔 板（納恩克公司（Nunc)),每孔的量為Iml膳食。通過在室溫冷卻，令人工膳食固化。將膳 食膽存于4C，可膽存多達3周。
[0282] 表2;人工膳食的成分
[0283]

【權利要求】
1. 經分離的雙鏈RNA分子，其包含退火的互補鏈，其中至少一條所述退火的互補鏈包 含選自以下的多核苷酸： (a) 與如下任意所示的靶基因的至少21個連續核苷酸互補的多核苷酸：SEQ ID N0:3、 795、890、1073、1684、2366、1、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、159、160、161、162、247、249、 251、253、255、257、259、513、515、517、519、521、601、603、605、607、609、793、797、799、801、 888、892、894、896、1071、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、 1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1115、1682、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、2100、2102、2104、2106、2108、2364、2368、2370 和 2372 ; (b) 與編碼如下任意所示的氨基酸序列的靶基因的至少21個連續核苷酸互補的多 核苷酸：SEQ ID N0:4、796、891、1074、1685、2367、2、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、248、 250、252、254、256、258、260、514、516、518、520、522、602、604、606、608、610、794、798、800、 802、889、893、895、897、1072、1076、1078、1080、1082、1084、1086、1088、1090、1092、1094、 1096、1098、1100、1102、1104、1106、1108、1110、1112、1114、1116、1683、1687、1689、1691、 1693、1695、1697、1699、1701、1703、1705、2101、2103、2105、2107、2109、2365、2369、2371 和 2373,以及 (c) 與（a)或（b)的多核苷酸具有至少85%序列同一性的多核苷酸， 其中所述多核苷酸接觸有害生物抑制與所述多核苷酸基本互補的所述有害生物的多 核苷酸的表達。
2. 權利要求1的雙鏈RNA分子，其中有害生物接觸所述多核苷酸抑制所述有害生物的 生長、發育或繁殖。
3. 編碼權利要求1或2的雙鏈RNA分子的分離的多核苷酸或多核苷酸組。
4. 編碼權利要求1或2的雙鏈RNA分子的載體系統。
5. 用權利要求3的多核苷酸或多核苷酸組或權利要求4的載體系統轉化的細胞，所述 細胞不是植物細胞。
6. 用權利要求3的多核苷酸或多核苷酸組或權利要求4的載體系統轉化的植物細胞， 所述細胞不是繁殖性植物細胞。
7. 用權利要求3的多核苷酸或多核苷酸組或權利要求4的載體系統轉化的植物組織， 所述組織不是繁殖材料。
8. 從用權利要求3的多核苷酸或多核苷酸組或權利要求4的載體系統轉化的植物組織 產生的產品，其中所述產品包含權利要求1或2的雙鏈RNA分子，所述產品不是繁殖材料。
9. 權利要求8的產品，其中所述產品選自食品和飼料。
10. 權利要求8的產品，其中，所述產品選自纖維、紙、餐食、蛋白質、淀粉、面粉、青貯飼 料、咖啡、茶和油。
11. 用于控制有害生物侵襲的方法，所述方法包括向所述有害生物提 供包含權利要求1或2的雙鏈RNA分子的植物材料。
12. 用于控制有害生物侵襲的方法，所述方法包括： a) 向有害生物的宿主植物引入權利要求3的多核苷酸或多核苷酸組或權利要求4的載 體系統， b) 種植所述宿主植物以允許權利要求1或2的雙鏈RNA分子的表達；和 C)向所述有害生物提供所述植物或植物材料。
13. 減少作為有害生物的宿主植物的作物由于有害生物侵襲導致的產量損失的方法， 包括： a) 向所述宿主植物引入權利要求3的多核苷酸或多核苷酸組或權利要求4的載體系 統，和 b) 種植所述宿主植物以允許權利要求1或2的雙鏈RNA分子的表達； 其中所述表達抑制所述有害生物的進食并且減少由于有害生物侵襲導致的產量損失。
14. 權利要求12或13的方法，其中在所述有害生物攝入所述植物的部分時，所述雙鏈 RAN分子遏制參與所述有害生物生長、發育或繁殖的靶基因。
15. 權利要求1或2的雙鏈RNA分子、權利要求3的多核苷酸或多核苷酸組、權利要求 4的載體系統、權利要求5或6的細胞、權利要求7的植物組織或權利要求8-10的任一項的 產品用于處理植物的有害生物侵襲的用途。
16. 用于產生包含權利要求1或2的雙鏈RNA分子的植物的方法，包括 a) 向所述植物引入權利要求3的多核苷酸或多核苷酸組或權利要求4的載體系統，和 b) 種植所述植物以允許所述雙鏈RNA分子的表達。
17. 包含權利要求1或2的雙鏈RNA分子的植物用于在所述植物中處理有害生物侵襲 或用于減少由于有害生物侵襲導致的所述植物的產量損失的用途，其中所述植物是所述有 害生物的宿主植物。
【文檔編號】C12N15/82GK104357446SQ201410589369
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2006年9月18日 優先權日:2005年9月16日
【發明者】R·拉馬克斯, P·菲爾德曼, G·普萊廷克, I·諾仁, E·范布勒, F·佩克爾, T·博蓋爾特 申請人:德福根有限公司