高血壓易感性相關基因的變異位點及其檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一個與原發性高血壓易感性相關的單核苷酸位點，并公開了一種檢測原發性高血壓相關基因-線粒體融合基因2（Mfn2）/增殖抑制基因（HSG）單核苷酸多態性的方法，它包括檢測個體的線粒體融合基因2（Mfn2）/增殖抑制基因（HSG）5’端非編碼區-35位點的基因型。本發明還公開了相應的檢測試劑盒。
【專利說明】高血壓易感性相關基因的變異位點及其檢測方法
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明涉及分子生物學和醫學領域。更具體地說，涉及人線粒體融合基因2(Mitofusin 2，Mfn2 gene)的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點5’端非編碼區_35bp的檢測。本發明還涉及檢測這個SNP位點的試劑盒。
【背景技術】
[0003]原發性高血壓(essential hypertens1n, EH)是一種常見而多發的、由環境與遺傳因素共同致病的多因素、多基因疾病，對人類健康造成了極大的影響。隨著分子醫學的發展，目前已經發現的高血壓相關基因已經有150余種，但是的發病機制仍然不完全清楚，高血壓的早期診斷和預防問題仍然未能完全解決。EH是遺傳因子和環境共同作用的結果，血壓的變化30%-60%歸因于遺傳。由于環境因素是可以控制和確認的，而高血壓遺傳學因素卻是固定不變的。因此，對可變因素的控制，如對高血壓危險因素的預防，可以在一定程度上延緩和防止高血壓的發病，但是對固定不變的遺傳因素的認識不足卻在一定程度上嚴重影響著對高血壓發病、診斷和治療。因此對高血壓遺傳學的研究十分必要(王佐廣，溫紹君，吳兆蘇.高血壓、易感基因與單核苷酸多態性[J].高血壓雜志，2001，9:259-264)。
[0004]近二十余年來，有關高血壓治療的研究更多地集中在對血壓的控制和對靶器官的保護，并已取得突飛猛進的發展。但是，這些手段并不能從根本上控制血壓，目前對人類內源性抗高血壓基因的研究還很少，因此，研究內源性抗高血壓機制是今后高血壓防治研究的主要方向之一，具有重要的研究價值和應用前景，如果通過調節內源性抗高血壓機制治療高血壓病，將會促進我國生物醫療技術的發展，并為我國每年節省巨大的醫療費用。
[0005]目前所發現的高血壓相關基因，歸結起來可以概括為促高血壓基因和抗高血壓基因，Mfn2屬于后者。Mfn2的前身是我國學者陳光慧等[Chen GH，Zhang CH, Zhu YQ, et al.Express1n of a novel gene related to hypertens1n[J].Natl Med J China, 1997,77: 823-828.]于1997年對培養的自發性高血壓大鼠(SHR)和正常Wistar Kyoto (WKY)大鼠的血管平滑肌細胞進行差異顯示，克隆出一個新基因一增殖抑制基因(hyperplasiasuppressor gene，HSG)。它包含有4160bp的喊基對，共編碼661個氨基酸(NM_014874,GeneBank Access U41803)。后經一系列體內、體外實驗發現[Chen KH, Guo XM, DalongMa, et al.Dysregulat1n of HSG triggers vascular proliferative disorders[J].Nature Cell B1l, 2004, 6，872-883.]，HSG 可以明顯地抑制 ras-raf 蛋白-絲裂素活化蛋白激酶基因表達，并且可以激活抗癌基因的表達，有效地阻遏細胞周期和抑制多種細胞的增殖，且這種抑制作用是通過細胞凋亡的方式實現的。因此HSG基因是原發性高血壓的候選基因之一，后經基因功能研究表明，HSG基因參與線粒體融合，因此正式命名為線粒體融合基因 2 (mitofusin 2, Mfn2)。
[0006]由于Mfn2基因在原發性高血壓患者和自發性高血壓大鼠血管和白細胞中主要的特點是出現表達下降，這應該是其表達調控出現了異常，但是目前對Mfn2基因轉錄調控方面的研究較少。5’端非編碼區是處于基因轉錄起始位點上游，2000bp以內是啟動子和主要轉錄因子存在部位，5’端非編碼區-35bp (從起始密碼子的“A”起向上第35位的位置，在SEQ ID NO:1中為第17位核苷酸)變異正好處于這個位置。而且我們在進行序列的生物信息學分析時發現該位點位于Mfn2基因5’端非編碼區轉錄起點2000bp內，且該變異位點正好位于一個啟動子內，且處于相對保守的區域。另外，該變異位點是一個非常重要的轉錄調控因子-乙醇脫氧酶基因調節子(alcohol dehydrogenase gene regulator I, ADRlMA結合部位，從轉錄調控角度而言，具有非常重要的價值，因而可能具有非常重要的意義。
[0007]綜上所述，為了最終實現根治原發性高血壓，本領域迫切需要深入研究原發性高血壓的發病機制，尋找原發性高血壓易感基因，篩選出具有高風險的原發性高血壓患者，開發檢測原發性高血壓易感基因的方法、試劑盒，以及相關的治療藥物等。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是提供一種檢測高血壓易感基因Mfn2多態性位點的方法及檢測試劑盒。
[0009]本發明提供了一種可以通過高血壓易感性基因的檢測預測高血壓發病風險的方法，即檢測Mfn2基因5’端非編碼區-35位點的基因型。5’端非編碼區-35位點為G基因型的個體其高血壓的發病風險遠高于普通人群。
[0010]所述的5’端非編碼區-35，位于Mfn2的5’端非編碼區中(1ρ36.22:NC_000001.10位置11980146 A/G)。其中，脫氧核糖核酸(DNA)序列編號:5’端非編碼區-35位置基于SEQ ID NO:1 ;引物I基于SEQ ID NO:2 ;引物2基于SEQ ID NO:3 ;擴增產物基于SEQ IDNO:4。
[0011]具體而言，該方法包括步驟:(a)抽提樣品的基因組DNA，擴增獲得Mfn2基因5’端非編碼區；(b)通過特異性的引物擴增獲得Mfn2基因包含5’端非編碼區-35位點的區域，擴增產物為SEQ ID NO:4 ; (c)檢測步驟(b)產物中單核苷酸多態性位點5’端非編碼區-35的基因型。
[0012]所述的擴增Mfn2基因5’端非編碼區的引物序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。
[0013]上述方法中涉及的測序、擴增、抽提基因組DNA等技術均可采用本領域的常規操作方法。
[0014]本發明提供了一種檢測高血壓易感基因的試劑盒，它含有可以包括特異性擴增Mfn2基因5’端非編碼區中包含5’端非編碼區-35位點的區域的引物。
[0015]在本發明的一個實施例中，與特異性擴增Mfn2基因5’端非編碼區中包含5’端非編碼區-35位點的區域的引物的序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
[0016]本發明經研究顯示，首次證明了 Mfn2基因單核苷酸多態性位點5’端非編碼區-35(位于Mfn2 5’端非編碼區中，1ρ36.22:NC_000001.10位置11980146 A/G)與高血壓密切相關，而且發現了它的新功能:Mfn2基因單核苷酸多態性位點5’端非編碼區-35位于Mfn2，5’端非編碼區中(1ρ36.22:NC_000001.10位置11980146 A/G)基因型的改變將導致高血壓的發病風險升高。其中關聯研究結果顯示，在Mfn2基因5’端非編碼區-35 A — G在病例和對照組中的分布存在顯著性差異(P〈0.05)，即在原發性高血壓患者中該基因型主要表現為G，而在正常對照組中該基因型主要為A，該SNP變化可改變轉錄因子結合位點。在此基礎上完成了本發明。
[0017]本發明提供了一種對個體的高血壓易感性進行診斷的方法，它包括步驟:檢測該個體的Mfn2基因5’端非編碼區-35位點的基因型，以此判斷該個體患高血壓的發病風險是否高于普通人群。
[0018]在一優選例中，所述的差異是選自5’端非編碼區-35的單核苷酸多態性。5’端非編碼區-35位于Mfn2基因5，端非編碼區中(1ρ36.22:NC_000001.10位置11980146 A/G)。其中，5’端非編碼區-35位置基于SEQ ID N0:1。
[0019]本發明提供了一種檢測樣品是否存在Mfn2基因的單核苷酸多態性的方法，包括步驟:
(a)用Mfn2基因5’端非編碼區特異性引物擴增樣品的基因組DNA，得到擴增產物；和
(b)檢測擴增產物中單核苷酸多態性位點5’端非編碼區-35的基因型。
[0020]Mfn2基因的詳細序列可參見登錄號為(NG_007945.1) 5’端非編碼區-35的核苷酸序列(可參見網址 http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)。
[0021]本發明人對Mfn2基因中的5’端非編碼區中(1ρ36.22:NC_000001.10位置11980146 A/G)區域進行了測序。
[0022]Mfn2基因的5’端非編碼區-35的基因型可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。
[0023]本發明公開了一個與原發性高血壓易感性相關的位點。提供了一種檢測原發性高血壓易感性基因Mfn2多態性的方法，它包括檢測線粒體融合基因2 (Mfn2)的5’端非編碼區-35位點的基因型。本發明還公開了相應的檢測試劑盒，該試劑盒含有擴增5’端非編碼區-35位點的引物，還可以包括擴增Mfn2基因5’端非編碼區的引物。利用本發明檢測5’端非編碼區-35位點的基因型，方法簡單易行，快速高效，成本低廉，為該基因多態性位點的檢測和原發性高血壓患病風險的預測提供了一個簡捷的新途徑。
[0024]
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1是經過使用本專利的引物通過PCR擴增后所得產物測序結果截圖。顯了 5’端非編碼區-35的一種SNP基因型的測序結果。5’端非編碼區-35位于Mfn2基因5’端非編碼區中(1ρ36.22:NC_000001.10位置11980146 A/G)。其中A為正常對照組正向測序圖，B為原發性高血壓患者組正向測序圖，C為正常對照組反向測序圖，D為原發性高血壓患者組反向測序圖。從正向測序圖中可以看出，正常對照組的A堿基變異為原發性高血壓組的G堿基；而在與之相對應的反向測序圖中，正常對照組的T堿基變異為原發性高血壓組的C喊基。
[0026]
【具體實施方式】
[0027]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人,分子克隆；實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0028]實施例1
用測序法檢測原發性高血壓易感基因MFn2基因的5’端非編碼區-35位點。挑選上述高血壓病例-對照組樣本各30例進行測序判斷5’端非編碼區-35的基因型。
[0029]一、實驗方法
PCR測序引物仍采用上述PCR用引物，擴增的產物經純化后直接測序。測序的儀器是ABI公司的3130x1遺傳分析儀,用sequence analysis 5.2分析軟件進行分析，結果用chromas也可以查看。
[0030]二、實驗結果
測序結果截圖如圖1所示。
[0031]在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用做參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講述內容之后，本領域技術人員可以對本發明做各種改動或修改，這些形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
【權利要求】
1.一種與原發性高血壓密切相關的DNA片段，其特征在于所述DNA片段包含如SEQ IDN0.1所示的序列。
2.線粒體融合基因2( Mfn2) 5’端非編碼區-35位點多態性在制備檢測高血壓易感性的試劑中的用途。
3.如權利要求2所述的用途，其特征在于所述Mfn2基因5’端非編碼區_35位點位于1ρ36.22:NC_000001.10 位置 11980146 A/G。
4.如權利要求2或3所述的用途，其特征在于所述Mfn2基因5’端非編碼區-35位點A — G的突變增加原發性高血壓的患病風險。
5.一種用于檢測高血壓易感性的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中包括能夠特異性擴增Mfn2基因包含5’端非編碼區-35位點的區域的引物。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述Mfn2基因5’端非編碼區_35位點位于 1ρ36.22:NC_000001.10 位置 11980146 A/G。
7.如權利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于所述引物序列如SEQID NO:2和SEQID NO:3 所示。
8.如權利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于通過所述引物特異性擴增獲得Mfn2基因包含5’端非編碼區-35位點的DNA片段；并檢測獲得的DNA片段中5’端非編碼區-35位點的核苷酸,所述位點A — G的突變增加原發性高血壓的患病風險。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于檢測Mfn2基因5’端非編碼區-35位點的核苷酸的方法選自=Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450884SQ201410586913
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年10月28日 優先權日:2014年10月28日
【發明者】王佐廣, 魏永祥, 李梅, 劉雅, 牛秋麗, 彭曉云, 劉潔琳, 馬曉海, 李繼勇, 溫紹君, 曾榮 申請人:首都醫科大學附屬北京安貞醫院