一種高特異性14個(gè)位點(diǎn)多個(gè)耳聾易感基因的多重pcr-ldr檢測(cè)試劑盒的制作方法

一種高特異性14個(gè)位點(diǎn)多個(gè)耳聾易感基因的多重pcr-ldr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種同時(shí)檢測(cè)14個(gè)耳聾易感基因的PCR-LDR檢測(cè)試劑盒，包括包裝盒體(1)，PCR擴(kuò)增和LDR反應(yīng)試劑(2)-(5)；包括8對(duì)PCR引物、16組探針其中包括2組通用探針和14組檢測(cè)探針。該方法靈敏度高，判讀清晰準(zhǔn)確；相對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)，本試劑盒能完成一次性獲得14個(gè)關(guān)鍵耳聾基因突變?cè)\斷結(jié)果的高通量篩查，具有經(jīng)濟(jì)、高效和高準(zhǔn)確率等優(yōu)勢(shì)。
【專利說明】-種高特異性14個(gè)位點(diǎn)多個(gè)耳聾易感基因的多重PCR-LDR 檢測(cè)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及DNA分子檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種14個(gè)耳聾易感基因的多重 PCR-LDR檢測(cè)試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 耳聾是一種嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量的常見先天性疾病，它可以由單一基因突變或 不同基因的復(fù)合突變引起，也可由環(huán)境因素（如醫(yī)療因素，環(huán)境暴露，創(chuàng)傷，藥物等）或基因 和環(huán)境兩者共同作用而致。我國(guó)現(xiàn)有聽力殘疾人群2780萬，居各類殘疾之首（33%)。有 研究發(fā)現(xiàn)GJB2、SLC26A4、線粒體基因是導(dǎo)致中國(guó)大部分非綜合征性耳聾的3個(gè)最常見的致 病基因。
[0003] GJB2基因是第一個(gè)被克隆和鑒定的遺傳性耳聾致病基因，也是導(dǎo)致非綜合性耳聾 最常見的致病基因。在非綜合征性耳聾中，約有20%是GJB2基因突變導(dǎo)致的。GJB2基因 編碼的Cx26蛋白在耳蝸內(nèi)呈高水平表達(dá)，與相鄰細(xì)胞的縫隙連接蛋白組成一個(gè)完整的縫 隙連接通道。這些通道在信息傳遞和物質(zhì)交換中起重要作用，是電解質(zhì)、第二信使和代謝 產(chǎn)物在細(xì)胞間轉(zhuǎn)換的重要通道。GJB2基因突變后，使鉀離子回流進(jìn)入內(nèi)淋巴的循環(huán)受到影 響，導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾。GJB2基因最常見的突變類型是235delC，其次是299-230delA > T和176-191dell6,其等位基因頻率分別為11. 90%、2. 22%和0. 65%。病理性235delC突 變導(dǎo)致移碼突變，產(chǎn)生無功能的蛋白質(zhì)，使縫隙連接缺損，從而影響離子通道的正常開閉。 299-300delAT突變導(dǎo)致Cx26多肽的CL區(qū)大部分缺失，TM3、EC2和TM4區(qū)完全缺失，可能喪 失對(duì)縫隙連接通道PH值的調(diào)控，降低縫隙連接對(duì)異型蛋白的辨別能力。176-191dell6指 176位后16個(gè)堿基丟失，從59號(hào)密碼子開始移碼，使得終止密碼提前至75號(hào)，產(chǎn)生無功能 的蛋白質(zhì)。
[0004] 間隙連接蛋白家族中GJB3是編碼間隙連接蛋白31 (Cx31)，其功能主要以連接子 復(fù)合體的形式融入膜間隙連接通道，參與細(xì)胞通訊。已有的耳聾群體分子流行病學(xué)資料表 明，GJB3基因 c. 538C > T點(diǎn)突變導(dǎo)致其編碼的Cx31蛋白的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生變化，可以通 過影響細(xì)胞間隙連接的形成，從而導(dǎo)致遺傳性耳聾的發(fā)生。
[0005] SLC26A4 基因?qū)儆陔x子轉(zhuǎn)運(yùn)體 26A 家族（solute carder family26A。SLC26A)，編 碼離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白。在機(jī)體離子成分平衡的維持中發(fā)揮重要作用。SLC26A4基因突變可 導(dǎo)致常染色體隱性耳聾DFNB4和Pendred綜合征（前庭水管擴(kuò)大或伴內(nèi)耳畸形、神經(jīng)性聾 和甲狀腺腫）。SLC26A4基因最常見突變類型是IVS7-2A > G，此外還包括2168A > G，1226G > A，1174A > T，1975G > C，2027T > A 等熱點(diǎn)突變。
[0006] WSFl基因定位于人類染色體的4pl6上，其編碼產(chǎn)物是一種對(duì)糖苷內(nèi)切酶敏感的 膜糖蛋白，其功能與擔(dān)任細(xì)胞內(nèi)、外離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能的微管網(wǎng)狀組織密切相關(guān)，直接影響內(nèi)耳 的生理功能。研究證明，WSFl基因的突變被證實(shí)是導(dǎo)致低頻感音神經(jīng)性聽力損失的主要原 因之一。主要表現(xiàn)為兩處突變：2158A > G、2596G > A，WFS1基因的突變雜合子可以引起常 染色體顯性遺傳病低頻感音神經(jīng)性聽力損失的突變雜合子可以引起常染色體顯性遺傳病 低頻感音神經(jīng)性聽力損失。
[0007] 線粒體DNA突變是引起聽力損傷的重要原因之一。其中，線粒體12SrRNA基因突 變與綜合征型耳聾和非綜合征型耳聾相關(guān)，位于12SrRNA解碼區(qū)的1555A > G和1494C > T突變是造成氨基糖甙類抗生素耳毒性和非綜合征型耳聾常見的分子機(jī)制。這些突變可能 造成12SrRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，破壞了線粒體蛋白的合成，降低細(xì)胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生，是細(xì)胞 內(nèi)外離子濃度失衡，耳蝸毛細(xì)胞凋亡，由此引起的線粒體功能障礙導(dǎo)致耳聾。
[0008] 目前常用的基因突變檢測(cè)技術(shù)主要包括：直接測(cè)序技術(shù)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (RFLP)、DNA芯片技術(shù)（Micro array)、變性高效液相色譜（DHPLC)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP) 和變性梯度凝膠電泳（DGGE)等。這些方法分別存在著成本高、準(zhǔn)確率低、操作繁瑣和重復(fù) 性差等問題。
[0009] 本試劑盒采用一種通用熒光探針的多重PCR-LDR基因多態(tài)性檢測(cè)方法。本發(fā)明旨 在設(shè)計(jì)2套不同堿基序列的通用熒光探針組合即2條通用模板及對(duì)應(yīng)2種不同熒光修飾通 用探針，進(jìn)行多重PCR-LDR反應(yīng)和毛細(xì)管電泳技術(shù)，同時(shí)可檢出耳聾14個(gè)基因位點(diǎn)并對(duì)其 進(jìn)行基因分型。本發(fā)明方法包括以下步驟：引物及探針設(shè)計(jì)，多重PCR體系反應(yīng)、多重LDR 連接反應(yīng)、測(cè)序儀結(jié)果檢測(cè)。本試劑盒由于測(cè)序結(jié)果的直接性，解決了結(jié)果的假陽性和假陰 性；3730x1測(cè)序平臺(tái)的樣本高通量性，可同時(shí)進(jìn)行94例樣本的檢測(cè)；利用3730x1測(cè)序儀的 5色熒光檢測(cè)系統(tǒng)，一個(gè)泳道檢出14個(gè)耳聾基因位點(diǎn)，加快了檢測(cè)速度。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供一種同時(shí)檢測(cè)14個(gè)耳聾易感基因 GJB2:235delC、 299-230delA > T、176-191dell6, SLC26A4 :IVS7-2A > G、2168A > G、1226G > A、1174A > T、1975G > C、2027T > A，線粒體 12SrDNA :1555A > G\1494C > T，GJB3 基因：538C > I'和 WSFl基因的2158A > G、2596G > A共計(jì)14個(gè)耳聾易感基因位點(diǎn)的PCR-LDR檢測(cè)試劑盒。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，該試劑盒包括PCR擴(kuò)增試劑和LDR連接反應(yīng)試劑、基因分型試 劑及質(zhì)控品。
[0012] 所述PCR擴(kuò)增試劑包括：PCR緩沖液、MgC12, dNTPs的混合物Remix，EX-Taq酶，2 組引物混合物（Primerl包含GJB2、GJB3、線粒體12SrDNA及WSFl基因共4對(duì)引物；Primer2 包含2168、1975-2027、IVS7-2、1174-1226及WSFl基因位點(diǎn)共5對(duì)引物）以及超純水；
[0013] 所述LDR連接反應(yīng)試劑包括：2組通用熒光探針及14組檢測(cè)探針混合物，DNA連接 酶，IOX緩沖液及超純水。
[0014] 所述基因分型試劑包括：R0X-300內(nèi)標(biāo)，用于基因分型的14個(gè)耳聾基因突變位點(diǎn) 對(duì)應(yīng)的基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。
[0015] 所述質(zhì)控品包括：陰性質(zhì)控品為滅菌的雙蒸水，野生型質(zhì)控品為經(jīng)測(cè)序鑒定 14個(gè)位點(diǎn)均為野生型的基因組DNA，陽性質(zhì)控品為GJB2 :235delC、299-230delA > T、 176-191dell6，SLC26A4 :IVS7-2A > G、2168A > G、1226G > A、1174A > T、1975G > C、2027T > A，線粒體 12SrDNA :1555A > G\1494C > T，GJB3 基因：538C > T 和 WSFl 基因的 2158A > G，2596G > A共計(jì)14個(gè)耳聾易感基因位點(diǎn)的突變質(zhì)粒。
[0016] 使用所述的試劑盒進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件：PCR擴(kuò)增體系的PH值為 8. 3-8. 9,鎂離子濃度為I. 5-3mM，4種dNTP的終濃度為200-300uM，Taq酶的用量為 0. 5-1U，2組引物混合物中單對(duì)引物終濃度為0. 5-5uM，LDR探針混合物中，通用探針終濃度 0. 1-0. 5uM，14組檢測(cè)探針終濃度為l-5uM。
[0017] 使用所述試劑盒進(jìn)行LDR-PCR反應(yīng)時(shí)，擴(kuò)增階段反應(yīng)及LDR連接反應(yīng)分別在一個(gè) 復(fù)合體系中進(jìn)行，同時(shí)擴(kuò)增連接 GJB2 :235delC、299-230delA > T、176-191dell6，SLC26A4 : IVS7-2A > G、2168A > G、1226G > A、1174A > T、1975G > C、2027T > A，線粒體 12SrDNA : 1555A > G\1494C > T，GJB3 基因：538C > T 和 WSFl 基因的 2158A > G，2596G > A 共計(jì) 14 個(gè)耳聾易感基因位點(diǎn)。
[0018] 本發(fā)明14個(gè)耳聾易感基因位點(diǎn)PCR-LDR檢測(cè)試劑盒，其特征在于PCR復(fù)合擴(kuò)增使 用2組多重引物混合物，LDR復(fù)合體系使用16組探針，其中包括2組通用探針，14組檢測(cè)探 針。
[0019] 用于GJB2基因235delC、299_300delAT、176_191dell63個(gè)基因位點(diǎn)檢測(cè)的上下游 引物目的片段長(zhǎng)度為1136bp，其序列分別為 ：
[0020] SEQ NO. I ：G2F, GCCTTTCAGCTAACGAGAAGTTT
[0021] SEQ NO. 2 ：G2R, GAATCTATGTGTTGGGATATGGT
[0022] 用于IVS7-2A > G位點(diǎn)檢測(cè)的上下游引物目的片段長(zhǎng)度為450bp，其序列分別為 為：
[0023] SEQ NO. 3 ：IVS7-2F, CACTGCTGGATTGCTCTC
[0024] SEQ NO. 4 ：IVS7-2R, CAAATGGCTTGACGTTTGT
[0025] 用于2168A > G位點(diǎn)檢測(cè)的上下游引物目的片段長(zhǎng)度為700bp，其序列分別為為：
[0026] SEQ NO. 5 ：2168F, ATCACTTGAACTTGGGACAC
[0027] SEQ NO. 6 ：2168R, CTGGGCTTCTTTGTGGCCT
[0028] 用于1226G > A、1174A > T位點(diǎn)檢測(cè)的上下游引物目的片段長(zhǎng)度為885bp，其序列 分別為為：
[0029] SEQ NO. 7 :1226-1174F，GTAGTTAAATGGTTAGTAATCAAGCACGA
[0030] SEQ NO. 8 :1226-1174R，GAAAATAGAATAGCTCCTAAAGCCCAG
[0031] 用于1975G > C、2027T > A位點(diǎn)檢測(cè)的上下游引物目的片段長(zhǎng)度為287bp，其序列 分別為為：
[0032] SEQ NO. 9 ：1975-2027F, TCTTCGTTTAGAATGGCAGCA
[0033] SEQ NO. 10 ：1975-2027R, ATTGCCAAAGCTCCAAACGT
[0034] 用于線粒體12SrDNA基因1555A > G、1494C > T位點(diǎn)檢測(cè)的上下游引物目的片段 長(zhǎng)度為923bp，其序列分別為為：
[0035] SEQ NO. 11 ： 1555-1492F, GATACCCCACTATGCTAGCCCTAA
[0036] SEQ NO. 12 :1555-1492R，GGTAGGTTTGTCGCCTCTACCTATAA
[0037] 用于GJB3基因538C > T位點(diǎn)檢測(cè)的上下游引物目的片段長(zhǎng)度為600bp，其序列分 別為為：
[0038] SEQ NO. 13 ：GJB3F, CGTGTGGGGGGATGAGCAG
[0039] SEQ NO. 14 ：GJB3R, GCAGCGGCAGGTGGAAGC
[0040] 用于WSFl基因2158A > G、25966 > A位點(diǎn)檢測(cè)的上下游引物目的片段長(zhǎng)度為 671bp，其序列分別為為：
[0041] SEQ NO. 15 ：WSF1F, CTGACCTGGCAGCAGTATCG
[0042] SEQ NO. 16 ：WSF1R, AGGAATGGGAAGAAAAAGAACGC
[0043] 本試劑盒使用16組LDR探針，其中包括2組通用探針，14組檢測(cè)探針
[0044] LDR 通用模板 I :CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG
[0045] 通用熒光探針 I :P-GCATCACTCAGAGGG-FAM
[0046] LDR 通用模板 2 :GGCCAGTTAAGCTAAGTTACTGCCGGACAT
[0047] 通用熒光探針 2 :P-TTAGCTTAACTGGCC-HEX
[0048] 176_191dell6檢測(cè)探針序列為：
[0049] GJB2_176_M :P-TGGCTGCAGGGTGTTGCATTTTCGCAAACCTGTACTC
[0050] GJB2_176_de I ： TTTGCTAACTTCCCCTCTGACCCA
[0051] GJB2_176_N0de I ： TTTATCGTAGCACACGTTCTTGCAGCC
[0052] 235delC位點(diǎn)檢測(cè)探針序列為
[0053] GJB2_235_M :P-GGCCCATAGCCGGATGTGGTTTTTTCGCAAACCTGTACTC
[0054] GJB2_235_delC ：TTTTTGCGTGGACACGAAGATCAGCTGCA
[0055] GJB2_235_C ：TTTTTTTGCGTGGACACGAAGATCAGCTGCAG
[0056] 299_230delAT位點(diǎn)檢測(cè)探針序列為
[0057] GJB2_299_M :P-GTCTCCGGTAGGCCACGTGTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC
[0058] GJB2_299_de IAT ： TTTTTTTTTTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTC
[0059] GJB2_299_AT ： TTTTTTTTTTTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTCAT
[0060] 用于SLC26A4基因1975G > C的檢測(cè)探針序列為：
[0061] 1975_M :P-AAGGCTATGGATTGGCACTTTTATGTCCGGCAGTAAC
[0062] 1975_C ：TAAAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAG
[0063] 1975_G ：TTTAAAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAC
[0064] 用于SLC26A4基因2027T > A的檢測(cè)探針序列為
[0065] 2027_M :P-GTGATCTCACTCCAACAACTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
[0066] 2027_T ：TTTTTTAAAACCAGAACCTTACCACCCGCA
[0067] 2027_Α ：TTTTTTTTTAAAACCAGAACCTTACCACCCGCT
[0068] 用于SLC26A4基因1174Α > T的檢測(cè)探針序列為：
[0069] 1174_M :P-GCTGATCCCAAAGGCAATGAATTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
[0070] 1174_A ：TTTTTTTCAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATGTT
[0071] 1174_T ：TTTTTTTTTTCAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATGTA
[0072] 用于SLC26A4基因1226G > A的檢測(cè)探針序列為：
[0073] 1226_M :P-GGGAAAGAGCAGTGGTGGCCACTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
[0074] 1226_G ：TTTTTTTTTCCAGTGCTCTCCTGGACGGCCGTGC
[0075] 1226_A ：TTTTTTTTTTTTCCAGTGCTCTCCTGGACGGCCGTGT
[0076] 用于SLC26A4基因 IVS7-2A > G的檢測(cè)探針序列為：
[0077] IVS7-2_M :P-GAAATAAAACAAAAGATGTTAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
[0078] IVS7-2_A ：TTTTTTTTTTTGAAATGGCAGTAGCAATTATCGTCT
[0079] IVS7-2_G ：TTTTTTTTTTTTTTGAAATGGCAGTAGCAATTATCGTCC
[0080] 用于SLC26A4基因2168A > G的檢測(cè)探針序列為：
[0081] 2168_M ：P-GGACCGTCAAAAAGAATGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
[0082] 2168_A ：TTTTTTTTTTTTTTTGGTTCTGTAGATAGAGTATAGCATCAT
[0083] 2168_G ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTCTGTAGATAGAGTATAGCATCAC
[0084] 用于12srRNA基因的1494C > T的的檢測(cè)探針序列為：
[0085] 1494_M :P-GTGACGGGCGGTGTGTACGCGCTTTTTTTTTTTTCGCACCTCTGTACTC
[0086] 1494_C ：TTTTTTTTTTTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGG
[0087] 1494_T ：TTTTTTTTTTTTTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGA
[0088] 用于12srRNA基因的1555G > A的的檢測(cè)探針序列為：
[0089] 1555_M ：P-CTCCTCTATATAAATGCGTATTTTTTTTTTTTTTTCGAATTCATCACTC
[0090] 1555_G ：TTTTTTTTTTTTTTAGTACACTTACCATGTTACGACTTGG
[0091] 1555_A ：TTTTTTTTTTTTTTTTTAGTACACTTACCATGTTACGACTTGT
[0092] 用于GJB3基因的538C > T的檢測(cè)位點(diǎn)的探針序列如下：
[0093] 538_M :P-TTGTCGTACAGCTTGGCGCACTGGTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC
[0094] 538_C ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTCCGTGCTTCTTGCCTGCG
[0095] 538_T ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTCCGTGCTTCTTGCCTGCA
[0096] 用于WSFl基因的2158Α > G，2596G > Α，2個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的探針序列分別為：
[0097] 2158_M :P-GGCAGACTCGGCGCTGTTGTCGATTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC
[0098] 2158_Α ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGAAGAACGGGAGCATGTTGAT
[0099] 2158_G ： TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGAAGAACGGGAGCATGTTGAC
[0100] 2596_M ：P-GTGCTCGATCTTCACGTGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
[0101] 2596_G ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGCCATGCACGGTGCTGCGCCAGTC
[0102] 2596_A ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGCCATGCACGGTGCTGCGCCAGTT
[0103] 所述16組探針，其中2條通用探針5'端需進(jìn)行磷酸化修飾，3'端進(jìn)行熒光染料標(biāo) 記，所用的熒光染料為不同的熒光素。
[0104] 使用所述試劑盒時(shí)，所檢測(cè)的材料為人類基因組DNA，選用磁珠或Chelex-100法 提取基因組DNA提取對(duì)來源樣本進(jìn)行處理得到的DNA ;所述的來源樣本為：來源于人類的血 液、組織、羊水、濾紙片血斑、口腔拭子樣本、FTA卡血斑等。
[0105] 使用所述試劑盒進(jìn)行PCR-LDR反應(yīng)時(shí)，可在任何型號(hào)的PCR儀進(jìn)行，PCR條件 為 ：95°3111丨11;95°308,60°308,72°608,30個(gè)循環(huán)；72°10111丨11 ;〇)1?連接反應(yīng)條件： 95。2min;95。30S，60° 2min，30 個(gè)循環(huán)。
[0106] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，使用本試劑盒判定檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)是：每次都同時(shí)檢測(cè) 陰性質(zhì)控品、野生型質(zhì)控品和突變型質(zhì)控品，檢測(cè)結(jié)果陰性質(zhì)控品為陰性，野生型質(zhì)控品為 野生型，突變型質(zhì)控品為陽性時(shí)，實(shí)驗(yàn)才有效。
[0107] 有益效果：
[0108] 本試劑盒首次采用復(fù)合PCR-LDR連接酶檢測(cè)反應(yīng)，同時(shí)對(duì)GJB2 :235delC、 299-230delA > T、176-191dell6, SLC26A4 :IVS7-2A > G、2168A > G、1226G > A、1174A > T、1975G > C、2027T > A，線粒體 12SrDNA :1555A > G、1494C > T，GJB3 基因：538C > I'和 WSFl基因的2158A > G、2596G > A進(jìn)行PCR-LDR擴(kuò)增，而后經(jīng)毛細(xì)管電泳后分析片段大小， 即可實(shí)現(xiàn)對(duì)14個(gè)耳聾位點(diǎn)的同時(shí)檢測(cè)。高溫連接酶（LDR)技術(shù)是利用高溫連接酶實(shí)現(xiàn)對(duì) 基因多態(tài)性位點(diǎn)的識(shí)別。高溫連接酶一旦檢測(cè)到DNA與互補(bǔ)的兩條寡聚核苷酸接頭對(duì)應(yīng)處 存在著基因點(diǎn)突變類型的堿基錯(cuò)配，則連接反應(yīng)就不能進(jìn)行，所以該方法特異性極強(qiáng)，我們 給予測(cè)序分型技術(shù)的LDR試劑盒是針對(duì)臨床應(yīng)用設(shè)計(jì)，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外基因分型及DNA多態(tài) 性檢測(cè)在遺傳性耳聾分子診測(cè)應(yīng)用上的空白。相對(duì)傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)，本試劑盒具有以下顯 著優(yōu)勢(shì)：
[0109] 降低成本：測(cè)序反應(yīng)的所有相關(guān)試劑BigDye完全由ABI這樣的型國(guó)外企業(yè)掌握， 試劑成本昂貴，但必需使用無法替代，而PCR-LDR技術(shù)所使用得探針引物及試劑都可以在 國(guó)內(nèi)公司合成訂購，可大幅度降低成本。
[0110] 通量高=DNA序列的測(cè)定只是針對(duì)某一區(qū)段進(jìn)行，而選中的區(qū)段可能只是一個(gè)位 點(diǎn)，而基于LDR技術(shù)的檢測(cè)系統(tǒng)可以進(jìn)行多為點(diǎn)的SNP分型，本試劑盒采用復(fù)合PCR-LDR體 系，一次可以同時(shí)檢測(cè)14個(gè)耳聾基因位點(diǎn)信息，同時(shí)檢測(cè)上百例樣品，不僅提高了檢測(cè)效 率，也很大程度上節(jié)約成本費(fèi)用。
[0111] 靈敏度高：傳統(tǒng)的測(cè)序法（Sanger法）檢測(cè)靈敏度低，無法檢測(cè)低滴度樣本（突變 比率小于15% );基于PCR-LDR的14位點(diǎn)耳聾易感基因檢測(cè)方案能夠突破傳統(tǒng)核酸突變檢 測(cè)技術(shù)的局限，對(duì)多個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度達(dá)到1 %
[0112] 操作簡(jiǎn)單流程短：從DNA制備開始，僅需要5個(gè)小時(shí)，而傳統(tǒng)測(cè)序需要10個(gè)小時(shí)， 大大節(jié)約了人力物力和時(shí)間、防止多步驟操作而產(chǎn)生污染。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0113] 圖1是本發(fā)明的試劑盒針對(duì)GJB2基因：235delC突變個(gè)體血斑來源DNA檢測(cè)分型 后結(jié)果；
[0114] 圖2是本發(fā)明的試劑盒針對(duì)GJB2基因299-230delA > T突變個(gè)體血斑來源DNA 檢測(cè)分型后結(jié)果；
[0115] 圖3是本發(fā)明的試劑盒針對(duì)GJB2基因：176-191dell6突變個(gè)體血斑來源DNA檢 測(cè)分型后結(jié)果；
[0116] 圖4是本發(fā)明的試劑盒針對(duì)SLC26A4 :IVS7-2A > G突變個(gè)體血斑來源DNA測(cè)序分 型后結(jié)果；
[0117] 圖5是本發(fā)明的試劑盒針對(duì)SLC26A4 :2168A > G突變個(gè)體血斑來源DNA檢測(cè)分型 后結(jié)果；
[0118] 圖6是本發(fā)明的試劑盒針對(duì)SLC26A4 :1226G>A突變個(gè)體血斑來源DNA檢測(cè)分型 后結(jié)果；
[0119] 圖7是本發(fā)明的試劑盒針對(duì)SLC26A4 :1174A > T突變個(gè)體血斑來源DNA檢測(cè)分型 后結(jié)果；
[0120] 圖8是本發(fā)明的試劑盒針對(duì)SLC26A4 :1975G>C突變個(gè)體血斑來源DNA檢測(cè)分型 后結(jié)果；
[0121] 圖9是本發(fā)明的試劑盒針對(duì)SLC26A4 :2027T > A突變個(gè)體血斑來源DNA檢測(cè)分型 后結(jié)果；
[0122] 圖10是本發(fā)明的試劑盒針對(duì)線粒體12SrDNA :1494C > T突變個(gè)體血斑來源DNA 檢測(cè)分型后結(jié)果；
[0123] 圖11是本發(fā)明的試劑盒針對(duì)線粒體12SrDNA :1555A > G突變個(gè)體血斑來源DNA 檢測(cè)分型后結(jié)果。
[0124] 圖12是本發(fā)明的試劑盒針對(duì)GJB3基因：538C > T位點(diǎn)突變個(gè)體血斑來源DNA檢 測(cè)分型后結(jié)果。
[0125] 圖13是本發(fā)明的試劑盒針對(duì)WSFl基因的2158A > G位點(diǎn)突變個(gè)體血斑來源DNA 檢測(cè)分型后結(jié)果。
[0126] 圖14是本發(fā)明的試劑盒針對(duì)WSFl基因的2596G > A位點(diǎn)突變個(gè)體血斑來源DNA 檢測(cè)分型后結(jié)果。
[0127] 圖15是本發(fā)明的試劑盒突變率靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)以1494位點(diǎn)為例說明的DNA檢測(cè) 結(jié)果
[0128] 圖16為野生型檢測(cè)結(jié)果
[0129] 圖17是本發(fā)明確定的最優(yōu)引物單重?cái)U(kuò)增及多重PCR產(chǎn)物凝膠圖像，17-1從左至右 Marker，GJB2、線粒體 12SrDNA、2168、1975-2027、IVS7-2、1174-1226、WSF1、及 GJB3 基因的 引物對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，Marker。17-2為多重PCR產(chǎn)物凝膠圖像，多重PCR體系-1包含GJB2、 GJB3、線粒體12SrDNA及WSFl基因的PCR產(chǎn)物；多重PCR體系-2包含2168、1975-2027、 IVS7-2、1174-1226及WSFl基因位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物。

【具體實(shí)施方式】
[0130] 實(shí)施例1 :14個(gè)耳聾易感基因位點(diǎn)的PCR-LDR檢測(cè)試劑盒及其使用
[0131] 1.試劑盒組成：PCR擴(kuò)增試劑包括：PCR緩沖液、MgC12, dNTPs的混合物Remix， EX-Taq酶，2組引物混合物（Primerl包含GJB2、GJB3、線粒體12SrDNA及WSFl基因共4對(duì) 引物；Primer2 包含 2168、1975-2027、IVS7-2、1174-1226 及 WSFl 基因位點(diǎn)共 5 對(duì)引物） 以及超純水；LDR連接反應(yīng)試劑包括：2組通用熒光探針及14組檢測(cè)探針混合物，DNA連 接酶，IOX緩沖液及超純水；基因分型試劑包括：R0X-300內(nèi)標(biāo)，用于基因分型的14個(gè)耳聾 基因突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因分型標(biāo)準(zhǔn)物；質(zhì)控品包括：陰性質(zhì)控品為滅菌的雙蒸水，野生型 質(zhì)控品為經(jīng)測(cè)序鑒定14個(gè)位點(diǎn)均為野生型的基因組DNA，陽性質(zhì)控品為GJB2 :235delC、 299-230delA > T、176-191dell6, SLC26A4 :IVS7-2A > G、2168A > G、1226G > A、1174A > T、1975G > C、2027T > A，線粒體 12SrDNA :1555A > G\1494C > T，GJB3 基因：538C > I'和 WSFl基因的2158A > G，2596G > A共計(jì)14個(gè)耳聾易感基因位點(diǎn)的突變質(zhì)粒。
[0132] 2.基因組DNA準(zhǔn)備：待檢樣品選用磁珠或Chelex-IOO法提取基因組DNA，提取的 樣品基因組DNA定量在約lng/ul-10ng/ul。
[0133] 3.多重PCR反應(yīng)：PCR緩沖液、MgC12, dNTPs的混合物Remix，EX-Taq酶，8對(duì)引物 混合物以及超純水，按如下過程實(shí)驗(yàn)：
[0134] 體系：25ul
[0135]

【權(quán)利要求】
1. 一種同時(shí)檢測(cè)14個(gè)耳聾易感基因的PCR-LDR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑 盒包括包裝盒體（I)，PCR擴(kuò)增試劑（2)，LDR連接反應(yīng)試劑（3)，基因分型試劑（4)，質(zhì)控品 (5)； 所述PCR擴(kuò)增試劑包括：PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs的混合物Remix，EX-Taq酶，8對(duì)引 物混合物以及超純水； 所述LDR連接反應(yīng)試劑包括：2組通用熒光探針及14組檢測(cè)探針混合物，DNA連接酶， IOX緩沖液及超純水； 所述基因分型試劑包括：ROX-300內(nèi)標(biāo)，用于基因分型的14個(gè)耳聾基因突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng) 的基因分型標(biāo)準(zhǔn)物； 所述質(zhì)控品包括：陰性質(zhì)控品為滅菌的雙蒸水，野生型質(zhì)控品為經(jīng)測(cè)序鑒定14個(gè)位 點(diǎn)均為野生型的基因組DNA，陽性質(zhì)控品為GJB2 :235delC、299-230delA > T、176-191 del 16，SLC26A4 :IVS7-2A > G、2168A > G、1226 G > A、1174A > T、1975G > C、2027T > A，線粒 體 12SrDNA :1555A > G\1494C > T，GJB3 基因：538C > T 和 WSFl 基因的 2158A > G，2596G > A共計(jì)14個(gè)耳聾易感基因位點(diǎn)的突變質(zhì)粒； 使用所述的試劑盒進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件：PCR擴(kuò)增體系的PH值為8. 3-8. 9,鎂 離子濃度為I. 5-3mM，4種dNTP的終濃度為200-300uM，Taq酶的用量為0. 5-1U，8對(duì)引物混 合物中單對(duì)引物終濃度為0. 5-5uM，LDR探針混合物中，通用探針終濃度0. 1-0. 5uM，14組檢 測(cè)探針終濃度為l_5uM ; 使用所述試劑盒進(jìn)行LDR-PCR反應(yīng)時(shí)，擴(kuò)增階段反應(yīng)及LDR連接反應(yīng)分別在一個(gè)復(fù) 合體系中進(jìn)行，同時(shí)擴(kuò)增連接 GJB2 :235delC、299-230delA > T、176-191 dell6, SLC26A4 : IVS7-2A > G、2168A > G、1226G > A、1174A > T、1975G > C、2027T > A，線粒體 12SrDNA : 1555A > G\1494C > T，GJB3 基因：538C > T 和 WSFl 基因的 2158A > G，2596G > A 共計(jì) 14 個(gè)耳聾易感基因位點(diǎn)； 所述試劑盒中包括PCR復(fù)合擴(kuò)增使用8對(duì)引物，LDR復(fù)合體系使用16組探針，其中包 括2組通用探針，14組檢測(cè)探針； 用于GJB2基因235delC、299_300delAT、176_191dell6 3個(gè)基因位點(diǎn)檢測(cè)的上下游引 物目的片段長(zhǎng)度為1136bp，其序列分別為： SEQ NO. I ：G2F. GCCTTTCAGCTAACGAGAAGTTT SEQ NO. 2 ：G2R. GAATCTATGTGTTGGGATATGGT 用于IVS7-2A > G位點(diǎn)檢測(cè)的上下游引物目的片段長(zhǎng)度為450bp，其序列分別為： SEQ NO. 3 ：IVS7-2F, CACTGCTGGATTGCTCTC SEQ NO. 4 ：IVS7-2R. CAAATGGCTTGACGTTTGT 用于2168A > G位點(diǎn)檢測(cè)的上下游引物目的片段長(zhǎng)度為700bp，其序列分別為： SEQ NO. 5 ：2168F, ATCACTTGAACTTGGGACAC SEQ NO. 6 ：2168R. CTGGGCTTCTTTGTGGCCT 用于1226G > A、1174A > T位點(diǎn)檢測(cè)的上下游引物目的片段長(zhǎng)度為885bp，其序列分別 為： SEQ NO. 7 ：1226-1174F, GTAGTTAAATGGTTAGTAATCAAGCACGA SEQ NO. 8 ：1226-1174R, GAAAATAGAATAGCTCCTAAAGCCCAG 用于1975G > C、2027T > A位點(diǎn)檢測(cè)的上下游引物目的片段長(zhǎng)度為287bp，其序列分別 為： SEQ NO. 9 ：1975-2027F, TCTTCGTTTAGAATGGCAGCA SEQ NO. 10 ：1975-2027R,ATTGCCAAAGCTCCAAACGT 用于線粒體12SrDNA基因1555A > G、1494C > T位點(diǎn)檢測(cè)的上下游引物目的片段長(zhǎng)度 為923bp，其序列分別為： SEQ NO. 11 ：M-F, gataccccactatgcttagccctaa SEQ NO. 12 ：M-R.ggtaggtttgtcgcctctacctataa 用于GJB3基因538C > T位點(diǎn)檢測(cè)的上下游引物目的片段長(zhǎng)度為600bp，其序列分別 為： SEQ NO. 13 ：GJB3F, CGTGTGGGGGGATGAGCAG SEQ NO. 14 ：GJB3R, GCAGCGGCAGGTGGAAGC 用于WSFl基因2158A > G、2596G > A位點(diǎn)檢測(cè)的上下游引物目的片段長(zhǎng)度為671bp， 其序列分別為： SEQ NO. 15 ：WSF1F, CTGACCTGGCAGCAGTATCG SEQ NO. 16 ：WSF1R, AGGAATGGGAAGAAAAAGAACGC 所述試劑盒使用16組LDR探針，其中包括2組通用探針，14組檢測(cè)探針 LDR 通用模板 I :CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGITTGCG 通用熒光探針 I :P-GCATCACTCAGAGGG-FAM LDR 通用模板 2 :GGCCAGTTAAGCTAAGTTACTGCCGGACAT 通用熒光探針 2 :P-TTAGCTTAACTGGCC-HEX 176-191 dell6檢測(cè)探針序列為： GJB2_176_M ：P-TGGCTGCAGGGTGTTGCATTTTCGCAAACCTGTACTC GJB2_176_deI ：TTTGCTAACTTCCCCTCTGACCCA GJB2_176_N0deI ： TTTATCGTAGCACACGTTCTTGCAGCC 235delC位點(diǎn)檢測(cè)探針序列為 GJB2_235_M :P-GGCCCATAGCCGGATGTGGTTTTTTCGCAAACCTGTACTC GJB2_235_delC ：TTTTTGCGTGGACACGAAGATCAGCTGCA GJB2_235_C ：TTTTTTTGCGTGGACACGAAGATCAGCTGCAG 299-230delAT位點(diǎn)檢測(cè)探針序列為 GJB2_299_M :P-GTCTCCGGTAGGCCACGTGTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC GJB2_299_deIAT : TTTTTTTTTTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTC GJB2_299_AT ：TTTTTTTTTTTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTCAT 用于SLC26A4基因1975G > C的檢測(cè)探針序列為： 1975_M ：P-AAGGCTATGGATTGGCACTTTTATGTCCGGCAGTAAC 1975_C ：TAAAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAG 1975_G ：TTTAAAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAC 用于SLC26A4基因2027T > A的檢測(cè)探針序列為 2027_M ：P-GTGATCTCACTCCAACAACTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC 2027_T ：TTTTTTAAAACCAGAACCTTACCACCCGCA 2027_A ：TTTTTTTTTAAAACCAGAACCTTACCACCCGCT 用于SLC26A4基因1174A > T的檢測(cè)探針序列為： 1174_M ：P-GCTGATCCCAAAGGCAATGAATTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC 1174_A ：TTTTTTTCAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATGTT I174_T ：TTTTTTTTTTCAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATGTA 用于SLC26A4基因1226G > A的檢測(cè)探針序列為： 1226_M ：P-GGGAAAGAGCAGTGGTGGCCACTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC 1226_G ：TTTTTTTTTCCAGTGCTCTCCTGGACGGCCGTGC 1226_A ：TTTTTTTTTTTTCCAGTGCTCTCCTGGACGGCCGTGT 用于SLC26A4基因IVS7-2A > G的檢測(cè)探針序列為： IVS7-2_M ：P-GAAATAAAACAAAAGATGTTAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC IVS7-2_A ：TTTTTTTTTTTGAAATGGCAGTAGCAATTATCGTCT IVS7-2_G ：TTTTTTTTTTTTTTGAAATGGCAGTAGCAATTATCGTCC 用于SLC26A4基因2168A > G的檢測(cè)探針序列為： 2168_M ：P-GGACCGTCAAAAAGAATGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC 2168 A ：TTTTTTTTTTTTTTTGGTTCTGTAGATAGAGTATAGCATCAT 2168_G ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTCTGTAGATAGAGTATAGCATCAC 用于12srRNA基因的1494C > T的的檢測(cè)探針序列為： 1494_M ：P-GTGACGGGCGGTGTGTACGCGCTTTTTTTTTTTTCGCACCTCTGTACTC 1494_C ：TTTTTTTTTTTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGG 1494_T ：TTTTTTTTTTTTTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGA 用于12srRNA基因的1555G > A的的檢測(cè)探針序列為： 1555_M ：P-CTCCTCTATATAAATGCGTATTTTTTTTTTTTTTTCGAATTCATCACTC 1555_G ：TTTTTTTTTTTTTTAGTACACTTACCATGTTACGACTTGG 1555_A ：TTTTTTTTTTTTTTTTTAGTACACTTACCATGTTACGACTTGT 用于GJB3基因的538C > T的檢測(cè)位點(diǎn)的探針序列如下： 538_M ：P-TTGTCGTACAGCTTGGCGCACTGGTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC 538_C ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTCCGTGCTTCTTGCCTGCG 538_T ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTCCGTGCTTCTTGCCTGCA 用于WSFl基因的2158A > G，2596G > A，2個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的探針序列分別為： 2158_M ：P-GGCAGACTCGGCGCTGTTGTCGATTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC 2158_A ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGAAGAACGGGAGCATGTTGAT 2158_G ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGAAGAACGGGAGCATGTTGAC 2596_M ：P-GTGCTCGATCTTCACGTGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC 2596_G ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGCCATGCACGGTGCTGCGCCAGTC 2596_A ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGCCATGCACGGTGCTGCGCCAGTT 所述16組探針，其中2條通用探針5'端需進(jìn)行磷酸化修飾，3'端進(jìn)行熒光染料標(biāo)記， 所用的熒光染料為不同的熒光素。
2. 權(quán)利要求1所述所述試劑盒，其特征在于，所檢測(cè)的材料為人類基因組DNA，選用磁 珠或Chelex-100法提取基因組DNA提取對(duì)來源樣本進(jìn)行處理得到的DNA ;所述的來源樣本 為：來源于人類的血液、組織、羊水、濾紙片血斑、口腔拭子樣本、FTA卡血斑等。
3. 權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，使用所述試劑盒進(jìn)行PCR-LDR反應(yīng)時(shí)，可在 任何型號(hào)的PCR儀進(jìn)行，PCR條件為：95° 3min;95° 30s，60° 30s，72° 60s，30個(gè)循環(huán)； 72° 10min;LDR 連接反應(yīng)條件：95° 2min;95° 30S，60。2min，30 個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104313159SQ201410586158
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】步迅, 張全芳, 劉艷艷 申請(qǐng)人:步迅