一種鄰位連接技術檢測ngal的方法
【專利摘要】本發明提出了一種鄰位連接技術檢測NGAL的方法，將復雜的蛋白檢測轉換成對DNA的檢測，并通過qPCR擴增的方法將信號放大，可以檢測在體內低表達的蛋白質。我們的實驗結果也表明，鄰位連接技術具有靈敏、特異、快速、靈活、高通量和多功能等特點，能夠檢測到較低濃度的中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白。本發明將科技前沿的新型蛋白檢測技術---鄰位連接技術與亟待解決的NGAL指標相結合，為NGAL低成本高靈敏度的檢測提供新的方法，可以應用于醫學和生物學等眾多領域。
【專利說明】—種鄰位連接技術檢測呢八的方法
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明涉及一種利用鄰位連接技術檢測中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白含量的方法，屬于蛋白質分析檢測領域。
[0003]
【背景技術】
[0004]是在包括腎小管在內的一些組織器官的中性粒細胞和上皮細胞中表達的小型分泌多肽，屬于超過20個結構上相關的分泌的蛋白的脂籠蛋白超家族，也稱為脂質運載蛋白-2 (111)0081111-2)，是脂質運載蛋白家族的一個新成員。具有運輸疏水性小分子，調節明膠酶8活性等功能，并可能通過運輸作用參與了免疫炎癥反應信息的傳遞以及腫瘤的發生發展，特別是腫瘤的浸潤轉移等過程。風仏I在血清中出現與腎缺血和腎毒性的劑量和持續時間有關，是監測藥物或其他治療劑的腎毒性副作用的有用的指標。在其它人組織中，包括腎、氣管、肺、胃和結腸中以非常低的水平表達，在受損的或受刺激的上皮細胞中明顯被誘導高表達。在小鼠模型中缺血性腎損傷發生后的最初幾小時內，其基因表達上調超過10倍，這提示可能參與了抗炎癥反應，而如此寬廣的濃度范圍，對檢測試劑盒靈敏度和線性范圍均提出了較高的要求。結合配體眾多，在細胞增殖分化和腫瘤遷移等眾多生理、病理學過程中扮演著非常重要的角色。大量的研究表明，如八I可能是一種潛在的腫瘤標志物和治療的新靶點，的表達與藥物刺激相關，上調的的表達有利于某些藥物作用，可以促進細胞的凋亡；風^^在對于小分子化合物轉運方面也起到了一定的作用。
[0005]鄰位連接技術11職1:1011 88887,孔八)是一項高靈敏度的蛋白質分析技術。該方法利用一對鄰位探針(1)1-0X11111丨7 ^01368)對祀分子進行雙識別，通過連接反應產生可擴增的檢測信號，以實時？⑶進行放大和檢測，將對蛋白質的檢測轉變成為對0嫩的檢測，實現痕量蛋白的分析，具有極高的檢測靈敏度和特異性。此方法的過程是利用一對帶有化學基團修飾的單鏈0嫩與修飾后的蛋白識別因子偶聯，與抗原共孵育，特異性地進行抗原抗體反應，然后通過連接酶的作用以及連接探針的輔助將核酸序列連接起來，并加入引物、I叫1112111探針和1；^酶的反應溶液，進行實時，最后通過檢測突光信號便可知道被測蛋白的是否存在及含量多少。這種方法能夠將對蛋白的復雜檢測轉化為對0嫩的檢測。憑借其檢測靈敏度高、檢測特異性強、樣品損耗低、操作簡單、檢測設備常見等優勢，在蛋白質含量檢測、研究蛋白質間相互作用、0嫩與蛋白質間相互作用等許多蛋白質組學相關領域已經取得了很好的研究成果。其主要形式包括液相、固相和原位3種，目前，鄰位連接技術主要有液相、固相及細胞原位3種反應形式，可用于體外及體內實驗或檢測。總之，？1^技術作為一項新的蛋白質分析工具，具有很高的特異性和靈敏度，可以用于炎癥、腫瘤疾病等病理生理過程研究，可以檢測蛋白質、亞細胞結構和細胞等生物樣本，還能檢測大分子間的相互作用，甚至可用于細胞表面蛋白功能狀態的觀察，以及病毒和細菌等感染因子的檢測，在基礎研究和疾病診斷等研究領域中具有重大意義。
[0006]
【發明內容】
[0007]技術問題:本發明提供一種將蛋白檢測技術和編\1指標相結合，能在體外檢測，靈敏度高，特異性強，操作簡單易行，且成本低的鄰位連接技術檢測的方法。
技術方案:本發明的鄰位連接技術檢測的方法，包括如下步驟:
1)將單鏈0嫩紅01和紅02偶聯到如從蛋白質的多克隆抗體上，形成探針，具體流程為:將0800與如從蛋白質的多克隆抗體共孵育25— 35分鐘，加入與08(?摩爾比在1:250以上室溫孵育5 —10分鐘以終止反應，加入單鏈0嫩和紅…在41下過夜孵育，使多抗分別偶聯兩種單鏈0敗即得到探針；
2)將多克隆抗體與磁珠制成混合溶液，使多克隆抗體固定在磁珠上，然后將風仏I蛋白質加入所述混合溶液中，使多克隆抗體捕獲風XI蛋白質，通過洗滌去除樣品中未結合分子；
1*6X61*86 ^1*11116100111160^011
011^011110160^1(16^ ^ I'叫祖II 01*0)36和妒⑶溶液置入？⑶管中，形成？⑶反應溶液，其中八#0“的5~端修飾有熒光基團；將探針加入混合溶液，使探針識別固定在磁珠上的蛋白質，再洗滌去除剩余的游離探針，然后將其加入所述反應溶液中進行聚合反應，使0嫩擴增，產生信號。
[0008]本發明方法的優選方案中，所述單鏈0嫩八1*1111的序列為011801111(31601:1(1686^1161106 18 5'-060 ^10 600 0X1 66^ 01^ 06^ 0X6 ^06 ^0 060 XXX 600 16^ 0X6 ^10601 麻 106 16-3~,紅 1112 的序列為161 01^ ^6 100 6X1 ^00 1X6 ^11 000 01^八IX 0X0 1X6 麻魈I 106 60^ 106 6X6 卯111101'的序列為 5'-060001 166 ^01 ^06 4-3~，？邙 1-6^61-86 ^111161-的序列為 5'-0^ 661 ^0 66^0X1 1^6-3~ , ￠0111160^01- 011^011110160^1(16 的序列為 5'-17\?: 11^ 6^0 ^06 似 06^ XXX^61 丁丁-3'，八 I'叫 1冊卯01^6 的序列為 5'-丁(}八⑶八 ^00 601 1X6 001 以-3~。
[0009]本發明方法的優選方案中，所述步驟1)中08?:0的濃度為4禮，所述11*18-^:1的濃度為11。
[0010]有益效果:本發明與現有技術相比，具有以下優點:
本發明提出了利用一種高靈敏度的蛋白質檢測技術-鄰位連接技術
11^1011 88887, 結合多抗檢測血清生物標記---中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(116111:101)1111 ^61^1:111886 88800181:6(1 11^0081111,八I)含量的新方法。目前市場常見的檢測方法，有些是試劑盒，需要板式或管式固定包被抗原或抗體，有一定的局限性，不利于免疫反應的進行，且價格高，其結果只能夠定性或者是半定量；多數利用熒光物質標記抗體，發光物質穩定性差，發光效率低、時間短；有些會造成環境污染；有些操作復雜、較難保證結果的重復性；有些檢測靈敏度低，且成本上也不具有優勢。而鄰位連接檢測方法靈敏度高，特異性強，操作簡單易行，且成本低。它將傳統的蛋白質對蛋白質的檢測轉化為0嫩對蛋白質的檢測，利用驢⑶的方法將信號級聯放大，所以這種方法能夠檢測到較低濃度的風仏匕與傳統的方法相比靈敏度高很多，？“能夠在1微升的樣品中最低檢測到細01級的蛋白質分子，其靈敏度為211“的1000倍。通過化學鍵的作用形成多克隆抗體和0嫩的偶聯物非常穩定。每個檢測就是一個反應，體系小，通量大，可進行重復性實驗，并且在逐步實驗檢測的自動化。技術在檢測過程中對靶物質的巧妙轉換，將在各個組學間的交融中起很重要的橋梁作用。利用技術可以高靈敏性、高特異性的檢測如八I蛋白質的含量，以后也可以應用于檢測細胞內部的如八[表達量的變化，以此研究與八I蛋白質含量相關的蛋白質磷酸化的改變細胞內信號通路、小分子運輸、癌細胞轉移能力的變化。本發明將科技前沿的新型蛋白檢測技術應用于重要且成本較高的指標的檢測，并且可以應用于廣泛的生物學研究中，例如蛋白質含量的測定與評估，蛋白質之間的相互作用，蛋白質磷酸化水平的測定等各個方向。
[0011]
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1是本發明鄰位連接技術檢測的原理流程圖。
[0013]圖2是利用邱1323載體表達純化中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(^41)的考馬斯亮藍染膠圖。
[0014]圖3是制備的的羊多抗的八⑶跑膠，并用考馬斯亮藍染色制備得到的綿羊多抗的檢測圖。
[0015]圖4是多抗分別偶聯兩條不同的寡核苷酸鏈的銀染圖，從左到右依次是:(1)蛋白(2) 的多抗，(3) 多抗偶聯寡核苷酸鏈紅1111后有一個大小上的遷移，(4) 多抗偶聯另一種寡核苷酸鏈仏'1112，有一個大小上的遷移。
[0016]圖5 4是使用？1八方法體外檢測不同濃度的如八I (011^/1111,0.00511^/1111,0.05=8/此、。.? 10011^/1111.^50011^/1111.)的散點圖。
[0017]圖5 8是在10%血清中加入不同濃度的如從⑶耶/此上00511^/1111,0.051^/此、0.51^/1111^51^/1111^201^/1111^1001^/1111^5001^/1111)的散點圖。
[0018]
【具體實施方式】
[0019]下面結合實施例和說明書附圖對發明的技術方案進行詳細說明。
[0020]本發明的鄰位連接技術檢測風XI的方法，首先應用風XI蛋白進行免疫及加強免疫，收集血清，制備效價較高的羊多抗；合成鄰位連接技術所需要的偶聯0嫩、連接0嫩、擴增引物及檢測引物。首先將抗體偶聯在磁珠上，并孵育抗原以捕獲抗原、固定抗原。通過化學鍵將抗體與單鏈0嫩偶聯，用于識別抗原、檢測抗原。再加入？⑶擴增所需的反應體系和引物，以及帶熒光標記的檢測引物，將蛋白的信號轉換成0嫩的信號后級聯放大。[0021〕 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。
[0022]實施例1
表達純化中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白八I
(1)通過生物公司合成得到風仏I的基因在邱132^1質粒上；(2)將邱1323質粒通過化學轉化法轉到8121菌株中，長出的單克隆接種在5此的“培養基中371 220^111過夜培養:(3)第二天，接種1此過夜菌液到300此培養基中進行擴大培養，待00600值達到
0.6-0.8(對數期)時加入1？%誘導劑，終濃度為0.1禮，30。〇，誘導4小時“5)4。。8000卬111離心15分鐘，收集菌液:(6)棄上清，用10八0完全重懸；(7)用高壓均質機將細胞破碎，釋放蛋白:(8)將蛋白液轉移到50此離心管中，41 8000印111離心15-11:(9)將蛋白液轉移到新的50此離心管中，用鎳柱親和層析純化蛋白，加1此^12+-10^珠子，4使蛋白與珠子結合1小時；(10)為獲得高純度的抗體，采用咪唑梯度洗脫法，低濃度咪唑洗脫液(2011)1,501111)用于洗去雜帶，高濃度咪唑洗脫液(10011)1, 25011)1,5001111)將蛋白洗脫下來，最終得到純度為90%的中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白⑶(^1)。
[0023]實施例2 制備多克隆抗體選擇健康沒有免疫過的2.51?左右的綿羊，將11118 ^6八I抗原與相同體積的弗氏完全佐劑混勻并研磨后，通過皮下多點注射的方法對綿羊進行免疫；(2)初次免疫3周后，再用108抗原與相同體積的弗氏不完全佐劑混勻，在皮下多點注射；(3)以后每兩周加強免疫一次，共免疫6次。(4)免疫蛋白總量共9呢:(4)最后一次免疫后五天進行動脈取血交由公司制備的多克隆抗體，用瓊脂糖雙擴法檢測風XI的多克隆抗體的效價為1:16-1:32。
[0024]實施例3
合成寡核苷酸鏈偶聯抗體
(1) 在29 8/9 1 109 [的恥紅的多抗中力口入1 4禮的08⑶(1)1136112710701000^116, 二芐基環辛炔)室溫反應30分鐘，使其X端加上順3基團；(2)加入II 11-18-1101 (三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液)室溫孵育5分鐘以終止反應；(3)修飾有順3基團的多抗分成兩份，分別與合成的5~端修飾有疊氮基團的單鏈紅“和紅021.5 ^ I 41過夜孵育，使多抗分別偶聯兩種單鏈0嫩。
[0025]實施例4
應用？1八技術用風XI多抗檢測中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白⑶(^1)
(1)將2呢/此1 ^ I 多抗加入0.5呢的磁珠中，371旋轉過夜，使其與磁珠偶聯；
(3)第二天，加入不同濃度的如八 I (011^/1111^0.00511^/1111^0.0511^/1111^0.51^/1111、51^/1111、2011^/1111^ 100118/1111^500118/1111),進行抗原抗體特異性結合，使抗原-抗體-磁珠偶聯在一起以起到固定抗原的作用:(4)在過夜偶聯的紅1111-多抗和紅1112多抗中加入50^ 1？83，再從中取出到新的管中，并加入39^1 ？83，將其稀釋到25111，然后各取2微升加到上述抗原抗體反應溶液中，室溫旋轉孵育900111:(5)取出5^ [，加入45^1 1111^ (10^1擴增引物 1、擴增引物 2、連接 0嫩，8 I'叫 1冊 1)1-0136,0.081111 八丁？，0.0021/9 I 醫，0.011/111 14 11^86,0.03^/111 I叫即匕郵以此)；(6)用汕I7700進行驢⑶反應，反應程序依次為:951 2-11,45個循環:951 158，60。。加化；(6)分析結果顯示，檢測限為0.111^/1111,0
[0026]實施例5
檢測血清中中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(風仏1)含量
(1)將不同濃度的如從抗原加入10%血清中混勻，模擬不同如從含量的實際樣本；(2)具體過程與實施例4 一致；(3)在人為加入10%血清，模擬體內檢測環境，結果發現，這并不影響方法對于的檢測，能夠檢測到不同濃度的靈敏度和特異性與實驗一致。
[0027]以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬【技術領域】的技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干等同替代或明顯變型，這些對本發明權利要求進行改進和等同替換后的技術方案，都應當視為屬于本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種鄰位連接技術檢測NGAL的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 1)將單鏈DNAArml和Arm2偶聯到NGAL蛋白質的多克隆抗體上，形成探針，具體流程為:將DBCO與NGAL蛋白質的多克隆抗體共孵育25— 35分鐘，加入與DBCO摩爾比在1:250以上Tris-HCl室溫孵育5 —10分鐘以終止反應，加入單鏈DNA Arml和Arm2在4°C下過夜孵育，使多抗分別偶聯兩種單鏈DNA，即得到探針； 2)將多克隆抗體與磁珠制成混合溶液，使多克隆抗體固定在磁珠上，然后將NGAL蛋白質加入所述混合溶液中，使多克隆抗體捕獲NGAL蛋白質，通過洗滌去除樣品中未結合分子； 3)將單鏈DNA PCR forward primer> PCR reverse primer、 Connectoroligonucleotide、A TaqMan probe和qPCR溶液置入PCR管中，形成PCR反應溶液，所述ATaqMan probe的5'端修飾有FAM熒光基團；將探針加入混合溶液，使探針識別固定在磁珠上的NGAL蛋白質，再洗滌去除剩余的游離探針，然后將其加入所述PCR反應溶液中進行聚合反應，使DNA擴增，產生信號。
2.根據權利要求1所述的鄰位連接技術檢測NGA的方法，其特征在于，所述單鏈DNAArml 的序列為 5'-CGC ATC GCC CTT GGA CTA CGA CTG ACG AAC CGC TTT GCC TGA CTG ATCGCT AAA TCG TG-3'，Arm2 的序列為 5'-TCG TGT CTA AAG TCC GTT ACC TTG ATT CCC CTAACC CTC TTG AAA AAT TCG GCA TCG GTG A_3'，PCR forward primer 的序列為 5'-CAT CGCCCT TGG ACT ACG A_3'，PCR reverse primer 的序列為 5'-GGG AAT CAA GGT AAC GGACTT TAG-3', Connector oligonucleotide 的序列為 5'_TAC TTA GAC ACG ACA CGA TTTAGT TT-3'，A TaqMan probe 的序列為 5'- TGA CGA ACC GCT TTG CCT GA_3'。
3.根據權利要求1或2所述的鄰位連接技術檢測NGAL的方法，其特征在于，所述步驟I)中DBCO的濃度為4mM，所述Tris-HCl的濃度為1M。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313157SQ201410583892
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月27日 優先權日:2014年10月27日
【發明者】萬亞坤, 母亞雯 申請人:東南大學