一種耳聾易感基因突變檢測試劑盒及其制備方法與應用的制作方法

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一種耳聾易感基因突變檢測試劑盒及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】一種耳聾易感基因突變檢測試劑盒及其制備方法與應用，涉及基因突變檢測。試劑盒設有盒體、盒蓋、隔板、HHL PCR混合液A瓶、HHL PCR混合液B瓶、HHL PCR混合液C瓶、HHL PCR混合液D瓶、HHL酶混合液瓶、HHL標準對照瓶、HHL陰性對照瓶。先制備擴增試劑和對照試劑，將擴增試劑和對照試劑設在瓶內，即得耳聾易感基因突變檢測試劑盒。所述試劑盒可在臨床進行遺傳性耳聾基因篩查、致聾基因類型的識別中的應用，從而預防耳聾疾病的發生。
【專利說明】一種耳聾易感基因突變檢測試劑盒及其制備方法與應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因突變檢測，尤其是涉及一種耳聾易感基因突變檢測試劑盒及其制備方法與應用。

【背景技術】
[0002] 據統計表明，目前已知的遺傳性疾病有4000多種，包括地中海貧血、先天愚型、耳聾等。其中，耳聾是一種嚴重影響人類生活質量的常見疾病，是交流障礙最常見的病因。在所有致聾因素中，遺傳因素是導致聾兒出生的主要原因，比例高達50%?60%，其具有較高的遺傳異質性。另外，在大量的遲發性聽力下降患者中，亦有許多患者是由于自身的基因缺陷所致，或由于基因缺陷和多態性造成對致聾環境因素易感性增加所致。
[0003] 近年來，隨著人類基因組計劃的實施與完成，大量與耳聾相關的基因被定位及克隆，耳聾基因檢測也隨之得以快速發展。迄今為止，與耳聾相關的基因座位有122個，其中僅有64個基因被克隆出來。耳聾易感基因的突變位點多樣化，且具有明顯的種族及區域差異，在不同國家或不同種族，甚至在同一國家的不同地區，其突變的類型和頻率也存在較大差異。大量流行病學調查數據表明，GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA以及GJB3基因是中國人群最常見的易感基因。這些基因在中國人群中的攜帶率商達5%?6%。由此可見，耳聾疾病的防控具有重要的優生學意義。
[0004] 目前耳聾篩查普遍采用的是傳統的物理學聽力缺陷篩查方法，存在著確診時間過長（2年）和漏檢（尤其是遲發性耳聾）的缺陷，從而造成耳聾悲劇的不斷發生。耳聾的基因檢測能夠將耳聾的發生由傳統的被動治療轉向主動預防，做到早發現、早干預，從而避免耳聾的發生，因此耳聾易感基因檢測有非常重要的意義。目前對耳聾易感基因進行檢測的方法主要是基于PCR技術的一系列分子生物學方法，包括限制性片段長度多態性分析 (RFLP)、變性高效液相色譜（DHPLC)技術、等位特異性PCR、SNaPshot測序技術、高通量測序技術、基因芯片以及DNA直接測序等，這些方法為耳聾易感基因的發現及鑒定做出了巨大的貢獻，但由于其耗時費力，所需設備和耗材昂貴，尤其是難以同時對不同基因多個突變位點進行檢測，一直未能被臨床廣泛接受。同時，我國分子診斷市場近年來也陸續出現了多種可用于臨床檢測的耳聾基因檢測試劑，其中最具影響力的是北京博奧生物技術有限公司開發的可同時檢測上述4個耳聾相關基因中的9個國人熱點突變的遺傳性耳聾基因診斷芯片。該產品將等位基因特異性引物延伸PCR與通用芯片相結合，可以達到靈敏、準確檢測的目的，但因其儀器設備昂貴，且操作步驟多、需要PCR后處理、檢測位點較少，使其無法更好地滿足臨床耳聾基因診斷的需求。此外，也有國內其他企業開發針對個別位點的實時PCR 檢測試劑，這些試劑針對性強，操作簡便，適合特殊位點的快速檢測，但是顯然不適合作為篩查目的使用。由此可見，目前我國尚缺乏一種操作簡便、成本低、檢測基因數目多、覆蓋突變位點全面的遺傳性耳聾高通量篩查試劑，這也極大制約了耳聾疾病的防控。
[0005] 烙解曲線（Dissociation Curve)是指隨溫度升高反映 DNA的雙螺旋結構解鏈的曲線。DNA雙螺旋結構解鏈一半的溫度稱為熔解溫度，即熔點（Tm)，熔點是雙鏈DNA固有的屬性，不同序列的雙鏈〇嫩，其Tm值不同，這與雙鏈DNA的序列長度、堿基組成相關。在實時PCR(Real-time PCR)技術推出來之后，熔解曲線技術常用來分析基于熒光染料的實時PCR擴增的特異性，根據PCR產物的Tm值的大小判定產物是目標產物還是非特異擴增產物。隨著生物技術的發展，儀器設備分辨率的改進，目前基于熒光染料的熔解曲線技術已經發展成的高分辨烙解曲線（High Resolution Melting Curve)技術，該技術可以識別單個喊基的突變，Chen 等人（Neng Chen, etc. Mutation Analysis of SLC26A4for Pendred Syndrome and Nonsyndromic Hearing Loss by High-Resolution Melting. The Journal of Molecular Diagnostics，2011，13:416-426.)將該技術用于SLC26A4基因突變的快速檢測，但由于該技術本身的局限性，只能對基因突變進行掃描，同時需要對突變樣本進行測序驗證，以確定突變的類型，且對DNA樣本質量要求非常高，不太適合在各臨床實驗室的推廣應用。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于針對現有技術中存在的操作繁瑣、耗時長、檢測成本高、易污染及通量較低等缺點，提供簡便快捷、靈敏度高、可靠性強、成本較低的基于多色探針熔解曲線技術的一種耳聾易感基因突變檢測試劑盒及其制備方法。
[0007] 本發明的另一目的在于提供耳聾易感基因突變檢測試劑盒在臨床進行遺傳性耳聾基因篩查、致聾基因類型的識別中的應用，從而預防耳聾疾病的發生。
[0008] 所述耳聾易感基因突變檢測試劑盒設有盒體、盒蓋、隔板、HHL PCR混合液A瓶、HHL PCR混合液B瓶、HHL PCR混合液C瓶、HHL PCR混合液D瓶、HHL酶混合液瓶、HHL標準對照瓶、HHL陰性對照瓶；HHL PCR混合液A瓶中裝有HHL PCR混合液A，HHL PCR混合液B瓶中裝有HHL PCR混合液B，HHL PCR混合液C瓶中裝有HHL PCR混合液C，HHL PCR混合液D 瓶中裝有HHL PCR混合液D，HHL酶混合液瓶中裝有HHL酶混合液，HHL標準對照瓶中裝有 HHL標準對照，HHL陰性對照瓶1中裝有HHL陰性對照，隔板設在盒體內，盒蓋與盒體連接， HHL PCR混合液A瓶、HHL PCR混合液B瓶、HHL PCR混合液C瓶、HHL PCR混合液D瓶、HHL 酶混合液瓶、HHL標準對照瓶、HHL陰性對照瓶設在隔板上。
[0009] 所述HHL PCR混合液A、HHL PCR混合液B、HHL PCR混合液C、HHL PCR混合液D 和HHL酶混合液組成擴增試劑；所述HHL PCR混合液A包括I XPCR緩沖液，3. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP 各 0· 2mM，0· 04mM GJB2 基因擴增引物 Fl，0· 04 μ M GJB3 基因擴增引物F2,0. 4 μ M GJB2基因擴增引物Rl，0. 4 μ M GJB3基因擴增引物R2,0. 2 μ M熒光探針Ρ1，0. 2μΜ熒光探針Ρ2,0. 2μΜ熒光探針Ρ3,0. 2μΜ熒光探針Ρ4,0. 2μΜ熒光探針Ρ5 ;
[0010] 所述 HHL PCR 混合液 B 包括 I XPCR 緩沖液，3. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP、dTTP、 dUTP各0.2mM，0.04mM用于擴增線粒體12S rRNA基因的1494和1555位點的引物F3， 0. 04 μ M用于擴增線粒體12S rRNA基因的961位點的引物F4,0. 04 μ M用于擴增線粒體TS 基因的7444和7445位點的引物F5,0. 4 μ M用于擴增線粒體12S rRNA基因的1494和1555 位點的引物R3，0. 4 μ M用于擴增線粒體12S rRNA基因的961位點的引物R4，0. 4 μ M用于擴增線粒體MT-TS基因的7444和7445位點的引物R5,0. 2 μ M熒光探針Ρ6,0. 2 μ M熒光探針Ρ7,0. 2 μ M熒光探針Ρ8,0. 2 μ M熒光探針Ρ9 ;
[0011] 所述 HHL PCR 混合液 C 包括 I XPCR 緩沖液，3. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP、dTTP、 dUTP各0. 2mM，0. 04 μ M用于擴增SLC26A4基因的IVS7-2位點的引物F6,0. 04 μ M用于擴增 SLC26A4基因的2162和2168位點的引物F7,0. 04μΜ用于擴增SLC26A4基因的1174、1226 和1229位點的引物F8，0. 4 μ M用于擴增SLC26A4基因的IVS7-2位點的引物R6，0. 4 μ M用與擴增SLC26A4基因的2162和2168位點的引物R7，0. 4 μ M用于擴增SLC26A4基因的1174、 1226和1229位點的引物R8,0. 2 μ M熒光探針Ρ10,0. 2 μ M熒光探針Pll，0. 2 μ M熒光探針 Ρ12,0. 2μΜ熒光探針 Ρ13 ;
[0012] 所述 HHL PCR 混合液 D 包括 I XPCR 緩沖液，3. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP、dTTP、 dUTP各0. 2mM，0. 04 μ M用于擴增SLC26A4基因的IVS15+5位點的引物F9,0. 04 μ M用于擴增SLC26A4基因的1975和2027位點的引物F10,0. 04μΜ用于擴增SLC26A4基因的749和 754位點的引物Rl 1，0. 4 μ M用于擴增SLC26A4基因的IVS15+5位點的引物R9，0. 4 μ M用于擴增SLC26A4基因的1975和2027位點的引物R10,0. 4μΜ用于擴增SLC26A4基因的749 和754位點的引物F11，0. 2μΜ熒光探針Ρ14,0. 2μΜ熒光探針Ρ15,0. 2μΜ熒光探針Ρ16， 0. 2 μ M熒光探針Ρ17 ;所述HHL酶混合液包括5U/ μ L Taq DNA聚合酶、0. IU/ μ L UNG酶。
[0013] 上述各基因擴增引物的長度為15?40bp的寡核苷酸鏈，Tm (熔點）為50?70°C。
[0014] 優選的，各基因擴增引物序列見表1。
[0015] 上述各熒光探針可為與靶序列雜交能生成特征熔解曲線峰并給出熔點的熒光探針，包括但不限于自淬滅探針、相鄰探針、容忍型分子信標等。
[0016] 優選的，熒光探針可為5'末端和3'末端分別標記熒光基團和淬滅基團的自淬滅探針。
[0017] 優選的，熒光基團可為 ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold 540、JOE、HEX、 CAL Flour Orange 560、TAMRA、Cal Fluor Red 590、ROX、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、 CAL Flour Red 635、Quasar 670、CY3、CY5、CY5. 5、Quasar 705 等中的一種。
[0018] 優選的，淬滅基團可為DABCYL、BHQ系列、ECLIPSE、TAMRA等中的一種。
[0019] 優選的，熒光探針的長度可為15?40bp的寡核苷酸鏈，Tm為50?80°C，GC含量 40%?70%。
[0020] 優選的，所述各位點及其相應檢測探針序列見表2。
[0021] 表1優選的基因擴增引物序列信息表
[0022]

【權利要求】
1. 一種耳聾易感基因突變檢測試劑盒，其特征在于設有盒體、盒蓋、隔板、HHL PCR混合液A瓶、HHL PCR混合液B瓶、HHL PCR混合液C瓶、HHL PCR混合液D瓶、HHL酶混合液瓶、 HHL標準對照瓶、HHL陰性對照瓶；HHL PCR混合液A瓶中裝有HHL PCR混合液A，HHL PCR混合液B瓶中裝有HHL PCR混合液B，HHL PCR混合液C瓶中裝有HHL PCR混合液C，HHL PCR 混合液D瓶中裝有HHL PCR混合液D，HHL酶混合液瓶中裝有HHL酶混合液，HHL標準對照瓶中裝有HHL標準對照，HHL陰性對照瓶1中裝有HHL陰性對照，隔板設在盒體內，盒蓋與盒體連接，HHL PCR混合液A瓶、HHL PCR混合液B瓶、HHL PCR混合液C瓶、HHL PCR混合液D瓶、HHL酶混合液瓶、HHL標準對照瓶、HHL陰性對照瓶設在隔板上。
2. 如權利要求1所述一種耳聾易感基因突變檢測試劑盒，其特征在于所述HHL PCR混合液 A 包括 1 XPCR 緩沖液，3. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP 各 0· 2mM，0· 04mM GJB2基因擴增引物F1，0. 04μ M GJB3基因擴增引物F2,0. 4μ M GJB2基因擴增引物Rl， 0. 4 μ M GJB3基因擴增引物R2,0. 2 μ Μ熒光探針Pl，0. 2 μ Μ熒光探針P2,0. 2 μ Μ熒光探針 Ρ3, (λ 2 μ Μ熒光探針Ρ4, (λ 2 μ Μ熒光探針Ρ5 ; 所述 HHL PCR 混合液 Β 包括 1 XPCR 緩沖液，3· OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP 各0. 2mM，0. 04mM用于擴增線粒體12S rRNA基因的1494和1555位點的引物F3,0. 04μΜ 用于擴增線粒體12S rRNA基因的961位點的引物F4,0.04 μ Μ用于擴增線粒體TS基因的 7444和7445位點的引物F5,0. 4 μ Μ用于擴增線粒體12S rRNA基因的1494和1555位點的引物R3,0. 4μΜ用于擴增線粒體12S rRNA基因的961位點的引物R4,0. 4μΜ用于擴增線粒體MT-TS基因的7444和7445位點的引物R5,0. 2 μ Μ熒光探針Ρ6,0. 2 μ Μ熒光探針Ρ7， 0· 2 μ Μ熒光探針Ρ8,0· 2 μ Μ熒光探針Ρ9 ; 所述 HHL PCR 混合液 C 包括 1 XPCR 緩沖液，3· OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP、dTTP、 dUTP各0. 2mM，0. 04 μ M用于擴增SLC26A4基因的IVS7-2位點的引物F6,0. 04 μ M用于擴增 SLC26A4基因的2162和2168位點的引物F7,0. 04μΜ用于擴增SLC26A4基因的1174、1226 和1229位點的引物F8，0. 4 μ Μ用于擴增SLC26A4基因的IVS7-2位點的引物R6，0. 4 μ Μ用與擴增SLC26A4基因的2162和2168位點的引物R7，0. 4 μ Μ用于擴增SLC26A4基因的1174、 1226和1229位點的引物R8,0. 2μΜ熒光探針Ρ10,0. 2μΜ熒光探針Ρ11，0. 2μΜ熒光探針 Ρ12,0. 2μΜ熒光探針 Ρ13 ; 所述 HHL PCR 混合液 D 包括 1 XPCR 緩沖液，3. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP、dTTP、 dUTP各0. 2mM，0. 04 μ M用于擴增SLC26A4基因的IVS15+5位點的引物F9,0. 04 μ M用于擴增SLC26A4基因的1975和2027位點的引物F10,0. 04μ Μ用于擴增SLC26A4基因的749和 754位點的引物R11，0. 4 μ Μ用于擴增SLC26A4基因的I VS 15+5位點的引物R9，0. 4 μ Μ用于擴增SLC26A4基因的1975和2027位點的引物R10，0. 4 μ Μ用于擴增SLC26A4基因的749 和754位點的引物F11，0. 2μΜ熒光探針Ρ14,0. 2μΜ熒光探針Ρ15,0. 2μΜ熒光探針Ρ16， 0. 2 μ Μ熒光探針Ρ17 ;所述HHL酶混合液包括5U/ μ L Taq DNA聚合酶、0. 1U/ μ L UNG酶；所述HHL標準對照為正常人基因組DNA，即為野生型人基因組DNA ; 所述HHL陰性對照不含目的基因片段，優選無菌水或Tris-HCl緩沖液。
3. 如權利要求1所述一種耳聾易感基因突變檢測試劑盒，其特征在于各基因擴增引物的長度為15?40bp的寡核苷酸鏈，Tm為50?70°C。
4. 如權利要求3所述一種耳聾易感基因突變檢測試劑盒，其特征在于各基因擴增引物序列如表1所示。
5. 如權利要求1所述一種耳聾易感基因突變檢測試劑盒，其特征在于各熒光探針為與靶序列雜交能生成特征熔解曲線峰并給出熔點的熒光探針，包括但不限于自淬滅探針、相鄰探針、容忍型分子信標。
6. 如權利要求5所述一種耳聾易感基因突變檢測試劑盒，其特征在于所述熒光探針為 5'末端和3'末端分別標記熒光基團和淬滅基團的自淬滅探針；熒光基團為 ALEX-350、FAM、VIC、TET、CALFluorGold 540、J0E、HEX、CALFlour0range 560、TAMRA、Cal Fluor Red 590、R0X、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Flour Red 635、 Quasar 670、CY3、CY5、CY5. 5、Quasar 705 中的一種；淬滅基團為DABCYL、BHQ系列、ECLIPSE、TAMRA中的一種；熒光探針的長度可為15?4(^?的寡核苷酸鏈，1'"1為50?801：，6(：含量40%?70%。
7. 如權利要求2所述一種耳聾易感基因突變檢測試劑盒，其特征在于各位點及其相應檢測探針序列如表2所示。
8. 如權利要求1?7中任一所述耳聾易感基因突變檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1)制備擴增試劑，所述擴增試劑包括HHL PCR混合液A、HHL PCR混合液B、HHL PCR混合液C、HHL PCR混合液D和HHL酶混合液；所述HHL PCR混合液A包括1 X PCR緩沖液，3. OmM MgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP 各 0· 2mM，0. 04mM GJB2 基因擴增引物 F1，0. 04μ M GJB3 基因擴增引物F2，0. 4 μ Μ GJB2基因擴增引物R1，0. 4 μ Μ GJB3基因擴增引物R2，0. 2 μ Μ熒光探針？1，0.2以1熒光探針？2,0.2以1熒光探針？3,0.2以1熒光探針？4,0.2以11熒光探針 Ρ5 ；所述 HHL PCR 混合液 Β 包括 1 XPCR 緩沖液，3· OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP 各0. 2mM，0. 04mM用于擴增線粒體12S rRNA基因的1494和1555位點的引物F3,0. 04μΜ 用于擴增線粒體12S rRNA基因的961位點的引物F4,0.04 μ Μ用于擴增線粒體TS基因的 7444和7445位點的引物F5,0. 4 μ Μ用于擴增線粒體12S rRNA基因的1494和1555位點的引物R3,0. 4μΜ用于擴增線粒體12S rRNA基因的961位點的引物R4,0. 4μΜ用于擴增線粒體MT-TS基因的7444和7445位點的引物R5,0. 2 μ Μ熒光探針Ρ6,0. 2 μ Μ熒光探針Ρ7， 0· 2 μ Μ熒光探針Ρ8,0· 2 μ Μ熒光探針Ρ9 ; 所述 HHL PCR 混合液 C 包括 1 XPCR 緩沖液，3· OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP、dTTP、 dUTP各0. 2mM，0. 04 μ M用于擴增SLC26A4基因的IVS7-2位點的引物F6,0. 04 μ M用于擴增 SLC26A4基因的2162和2168位點的引物F7,0. 04μΜ用于擴增SLC26A4基因的1174、1226 和1229位點的引物F8，0. 4 μ Μ用于擴增SLC26A4基因的IVS7-2位點的引物R6，0. 4 μ Μ用與擴增SLC26A4基因的2162和2168位點的引物R7，0. 4 μ Μ用于擴增SLC26A4基因的1174、 1226和1229位點的引物R8,0. 2 μ Μ熒光探針Ρ10,0. 2 μ Μ熒光探針Ρ11，0. 2 μ Μ熒光探針 Ρ12,0. 2μΜ熒光探針 Ρ13 ; 所述 HHL PCR 混合液 D 包括 1 XPCR 緩沖液，3. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP、dTTP、 dUTP各0. 2mM，0. 04 μ M用于擴增SLC26A4基因的IVS15+5位點的引物F9,0. 04 μ M用于擴增SLC26A4基因的1975和2027位點的引物F10,0. 04μΜ用于擴增SLC26A4基因的749和 754位點的引物R11，0. 4 μ Μ用于擴增SLC26A4基因的I VS 15+5位點的引物R9，0. 4 μ Μ用于擴增SLC26A4基因的1975和2027位點的引物R10,0. 4μΜ用于擴增SLC26A4基因的749 和754位點的引物F11，0. 2μΜ熒光探針Ρ14,0. 2μΜ熒光探針Ρ15,0. 2μΜ熒光探針Ρ16， 0. 2 μ Μ熒光探針Ρ17 ;所述HHL酶混合液包括5U/ μ L Taq DNA聚合酶、0. 1U/ μ L UNG酶；各基因擴增引物的長度為15?40bp的寡核苷酸鏈，Tm為50?70°C ; 2) 制備對照試劑，所述對照試劑包括HHL標準對照和HHL陰性對照； 3) 將步驟1)制備的擴增試劑和步驟2)制備的對照試劑設在盒體內，即得耳聾易感基因突變檢測試劑盒。
9. 如權利要求1?8任一所述耳聾易感基因突變檢測試劑盒在臨床進行遺傳性耳聾基因篩查、致聾基因類型的識別中應用。
10. 如權利要求9所述應用，其特征在于其具體操作步驟如下： 1. PCR擴增和熔解曲線分析，具體方法如下： (1) 試劑準備--配液區 ① 首先將擴增試劑從冰箱取出并平衡至室溫；PCR反應液配液標準為：取η X 19. 8 μ L HHL PCR Mix Α和nXO. 2yL HHL酶混合液加入到1.5mL離心管中，振蕩混勻數秒，然后瞬時離心；取nX19.8yL HHL PCR Mix B和nX0.2yL HHL酶混合液加入到1.5mL離心管中，振蕩混勻數秒，然后瞬時離心；取nX19. 8yL HHL PCR Mix C和nXO. 2yL HHL酶混合液加入到1. 5mL離心管中，振蕩混勻數秒，然后瞬時離心；取nX19. 8μ L HHL PCR Mix D 和ηΧ0.2μ? HHL酶混合液加入到1.5mL離心管中，振蕩混勻數秒，然后瞬時離心；PCR反應液應即配即用，隔夜使用需-18°C以下貯存；所述η根據反應管數確定；各次離心均可為 3000rpm 離心 5s ; ② PCR反應液的分裝：PCR反應液分別以每管20 μ L分裝于PCR薄壁反應管； ③ 將配制好的PCR反應管轉移至提取間，貯存于-18°C以下冰箱儲存直至樣本提取完； (2) 樣品的加樣--模板間 ① 用微量加液器向每支PCR薄壁反應管中加入5 μ L相應的待檢DNA樣本、HHL標準對照和HHL陰性對照，并立即蓋嚴管蓋； ② 將已加入模板的PCR薄壁反應管轉移至PCR擴增區； (3) PCR擴增和熔解曲線分析--擴增區 ① PCR擴增程序為：第一步：50°C 2min，95°C lOmin ; 第二步：95°C 15s - 65 ?56°C 15s - 76°C 20s，10 個循環，其中 65 ?56°C 15s 每個循環下降rc ; 第三步：95°C 15s - 55°C 15s - 76°C 20s，50 個循環； ② 熔解曲線分析程序為： 95°C lmin - 35°C 3min - 45?85°C，其中45?85°C以0· 5°C /5s的升溫速率進行熔解曲線分析，且在此階段采集探針所對應通道FAM、HEX、ROX、CY5的熒光信號； ③ 程序運行完畢，將PCR薄壁反應管取出放入凹凸袋，將封口封嚴，按污染源處理；所述PCR薄壁反應管可采用閉管； 2) 結果判讀：根據多色探針熔解曲線分析結果中，待檢測樣本與標準對照在各通道熔解峰的Tm值的變化進行判斷待檢樣本是否含有相應基因突變，以及基因突變的類型；其具體方法可為： (1) 讀取標準對照在各檢測通道的熔解峰的Tm值； (2) 讀取待檢測樣本在各檢測通道的^值； (3) 將待檢測樣本在各檢測通道的Tm值減去標準對照在各檢測通道對應的Tm值，得到各通道的△!' 111值，判斷待檢是否含有突變，以及突變的類型；所述標準對照可采用野生型對照。
【文檔編號】C12M1/00GK104263848SQ201410583806
【公開日】2015年1月7日申請日期:2014年10月24日優先權日:2014年10月24日
【發明者】黃秋英, 李慶閣, 王旭東申請人:廈門大學

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