產(chǎn)生乳制品的方法

產(chǎn)生乳制品的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用具有乳糖酶活性的酶產(chǎn)生乳制品的方法。
【專利說明】產(chǎn)生乳制品的方法
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2008年12月2日，申請(qǐng)?zhí)枮?200880125837. 1"（國(guó)際申請(qǐng)?zhí)?為"PCT/EP2008/066624"），名稱為"產(chǎn)生乳制品的方法"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 涉及序列表
[0003] 本申請(qǐng)包含序列表。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004] 本申請(qǐng)涉及使用具有乳糖酶活性的酶產(chǎn)生乳制品的方法。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 乳糖耐受性可能是美國(guó)和世界上其它地區(qū)最廣為人知的食物敏感性。據(jù)估計(jì)，世 界人群中約70%具有遺傳控制的受限的消化乳糖的能力。因此，為了幫助不能消化乳品的 人食用乳制食品，對(duì)于不包含乳糖或只包含較低水平乳糖的乳制食品的需要一直在增長(zhǎng)。
[0007] 乳糖酶在商業(yè)上用于分解乳中的乳糖以產(chǎn)生乳制品，該乳制品適合于乳糖不耐受 的人們和/或具有更甜的口味。因?yàn)槠咸烟呛桶肴樘潜热樘歉?，所以乳糖酶產(chǎn)生的口味 更好。乳糖酶也用于冰激凌的生產(chǎn)中。乳糖在冰激凌的低溫結(jié)晶，而葡萄糖和半乳糖保持 為液體并使質(zhì)地更光滑。乳糖酶也用于將乳清變成糖漿轉(zhuǎn)化中。乳糖酶也用于生產(chǎn)煉乳 (condensedmilk)〇
[0008] 已經(jīng)從各種生物體，包括微生物中分離到了乳糖酶。乳糖酶經(jīng)常是微生物如克 魯維酵母屬（Kluyveromyces)和芽孢桿菌屬（Bacillus)的胞內(nèi)成分?？唆斁S酵母，特別 是脆壁克魯維酵母（K.fragilis)和乳酸克魯維酵母（K.Iactis)，和其它真菌如念珠菌 屬（Candida)、圓酵母屬（Torula)和球擬酵母屬（Torulopsis)的真菌，是真菌乳糖酶的 通常來源，而凝結(jié)芽孢桿菌（B.coagulans)和環(huán)狀芽孢桿菌（B.circulans)是細(xì)菌乳糖 酶的公知來源。提供源自這些生物體的幾種商業(yè)乳糖酶制備物，如Lactozym? (可由 Novozymes,Denmark獲得），HA-乳糖酶（可由Chr.Hansen,Denmark獲得）和Maxilact?1 (可由DSM，theNetherlands獲得），其全部來自乳酸克魯維酵母。所有這些乳糖酶也稱作 中性乳糖酶，其最適pH為pH6-pH8。當(dāng)在例如低乳糖酸奶的生產(chǎn)中使用這種乳糖酶時(shí)，必 須在發(fā)酵前在單獨(dú)的步驟中進(jìn)行酶處理，或者必須使用高酶劑量，因?yàn)樗鼈兊幕钚栽诎l(fā)酵 過程中隨pH下降而下降。此外，這些乳糖酶不適于在高溫進(jìn)行的乳中乳糖的水解，在某些 情況下這對(duì)于保持低的微生物計(jì)數(shù)有益，并且因此確保良好的乳品質(zhì)。
[0009] 已經(jīng)描述了幾種最適pH更低的胞外乳糖酶，參見，例如，美國(guó)專利5, 736, 374描述 了這種乳糖酶的實(shí)例，所述酶由米曲霉（Aspergillusoryzae)產(chǎn)生。
[0010] 已經(jīng)描述了具有高轉(zhuǎn)半乳糖基活性的來自雙歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum)的乳糖酶，全長(zhǎng)形式的和特別是從C-末端截短的（參見，例如，J0rgensen等 (2001)，Appl.Microbiol.Biotechnol.，57:647-652 或EP專利 1，283, 876) 〇
[0011] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供通過使用乳糖酶產(chǎn)生具有低乳糖水平的乳制品的方法， 例如發(fā)酵乳制品，如酸奶。另一個(gè)目的是提供通過使用乳糖酶產(chǎn)生低乳糖飲料乳的方法，其 中與已知方法相比，所述方法形成的異味（off-flavour)和/或棕色（browncolor)較少。 根據(jù)本發(fā)明待使用的乳糖酶應(yīng)有效地水解乳糖，并且任選地允許幾乎完全水解乳糖。特別 地，這種乳糖酶應(yīng)具有高的乳糖酶對(duì)轉(zhuǎn)半乳糖基酶活性的比例。為了用于發(fā)酵乳制品的生 產(chǎn)，乳糖酶應(yīng)在寬的pH范圍內(nèi)有活性。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 本發(fā)明的發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，來自雙歧雙歧桿菌的胞外乳糖酶的C-末端截 短片段，其由于能由乳糖得到大量半乳寡糖（galactooligosaccharides)的能力而最初得 到分離并請(qǐng)求專利保護(hù)，它能非常成功地用于水解乳中的乳糖。當(dāng)在37°C在水+100g/l乳 糖中測(cè)試時(shí)，如現(xiàn)有技術(shù)所述，酶高效地產(chǎn)生半乳寡糖。然而，當(dāng)在乳中測(cè)試時(shí)，水解活性與 轉(zhuǎn)半乳糖基活性的比例顯著變化，導(dǎo)致有效水解并產(chǎn)生非常低水平的半乳寡糖。
[0014] 因此，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0015] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0016] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQIDNO: 1的氨基酸 28-1931或其片段至少70 %相同的氨基酸序列。
[0017] 在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0018] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0019] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQIDNO: 2的氨基酸 28-1331至少70 %相同的氨基酸序列。
[0020] 此外，發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)在使用來自雙歧雙歧桿菌的乳糖酶時(shí)，與常用于乳 處理的其它乳糖酶相比，可以獲得非常低水平的乳糖。使用來自雙歧雙歧桿菌的乳糖酶的 另一個(gè)令人預(yù)料不到的優(yōu)勢(shì)是酶在高溫有活性，允許在，例如52°c，處理乳，由此減少微生 物技術(shù)并從而改進(jìn)乳的質(zhì)量。
[0021] 因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0022] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0023] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，
[0024] 其中步驟b)在至少50 °C進(jìn)行。
[0025] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟b)在至少52°C進(jìn)行。
[0026] 此外，發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，來自雙歧雙歧桿菌的乳糖酶在寬的pH范圍內(nèi)有活 性。
[0027] 因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0028] a)提供包含乳糖的乳基的底物；和
[0029] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，其中乳糖酶活性在37°C的最適pH 為pH5以上，并且在37°C測(cè)定時(shí)，其中酶在pH5的乳糖酶活性是其在pH6的乳糖酶活性 的至少50%。
[0030] 使用在寬的pH范圍內(nèi)有活性的乳糖酶對(duì)于發(fā)酵乳制品的產(chǎn)生特別有用，其中其 允許低酶劑量，因?yàn)槊冈诎l(fā)酵過程中和之后仍有活性。此外，可以使用這種酶達(dá)到發(fā)酵乳制 品中非常低水平的乳糖。
[0031] 因此，在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生低乳糖的發(fā)酵乳制品的方法，其包 括
[0032] a)提供包含乳糖的乳基底物，
[0033] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，其中乳糖酶活性在37°C的最適pH 為pH5以上，并且在37°C測(cè)定時(shí)，其中酶在pH5的乳糖酶活性時(shí)是在pH6的乳糖酶活性 的至少50%，和
[0034] c)用微生物發(fā)酵所述底物。
[0035] 本發(fā)明的發(fā)明人還令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在貨架期（shelflife)延長(zhǎng)的低乳糖飲料乳 的生產(chǎn)中，乳糖水解優(yōu)選在高溫進(jìn)行，如在至少60°C的溫度。優(yōu)選地，這種生產(chǎn)可以包括同 時(shí)的低巴氏滅菌和乳糖酶處理。因此，在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方 法，其包括
[0036]a)提供包含乳糖的乳基底物，和
[0037] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，
[0038] 其中步驟b)在62°C-64°C的溫度進(jìn)行10分鐘-4小時(shí)。
[0039] 在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述方法中的步驟b)之后為冷卻至KTC以下而不進(jìn)行進(jìn) 一步的熱處理。這允許酶在乳冷卻后（即，在保存期間）仍然有活性。在另一個(gè)更優(yōu)選的 方面，所述方法中的步驟b)之后為UHT處理。
[0040] 優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，乳基底物中至少70%的乳糖被水解。更優(yōu)選地，乳基 底物中至少80 %，如至少85 %，至少90 %，至少95 %或至少98 %的乳糖被水解。
[0041] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0042]a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0043]b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQID NO:3或其片段 至少70%相同的氨基酸序列。
[0044] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0045]a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0046]b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQID N0:4或其片段 至少70%相同的氨基酸序列。
[0047] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0048] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0049] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQIDNO: 5或其片段 至少70 %相同的氨基酸序列。
[0050] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0051] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0052]b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQID N0:6或其片段 至少70 %相同的氨基酸序列。
[0053] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0054] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0055]b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQID N0:7或其片段 至少70 %相同的氨基酸序列。
[0056] 具體地，本發(fā)明涉及如下各項(xiàng)：
[0057]1.用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0058]a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0059] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQIDNO: 2的氨基酸 28-1331至少70 %相同的氨基酸序列。
[0060] 2.用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0061]a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0062] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQIDNO: 1的氨基酸 28-1931或其片段至少70 %相同的氨基酸序列。
[0063] 3.用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0064]a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0065]b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQIDNO: 3-4中任一 序列或這些序列中任一個(gè)的片段至少70%相同的氨基酸序列。
[0066] 4.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶源自雙歧桿菌屬（Bifidobacterium)的微 生物。
[0067] 5.用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0068]a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0069] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQIDNO: 5-7中任一 序列或這些序列中任一個(gè)的片段至少70%相同的氨基酸序列。
[0070] 6.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中在37°C乳糖酶活性的最適pH為pH5以上，并且 其中在37°C測(cè)定時(shí)，酶在pH5的乳糖酶活性為在pH6時(shí)其乳糖酶活性的至少50%。
[0071] 7.用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0072] a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0073]b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，其中在37°C乳糖酶活性的最適pH 為pH5以上，并且其中在37°C測(cè)定時(shí)，酶在pH5的乳糖酶活性為在pH6時(shí)其乳糖酶活性 的至少50%。
[0074]8.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)在至少50°C的溫度進(jìn)行。
[0075]9.用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0076]a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0077]b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，
[0078] 其中步驟b)在至少50°C的溫度進(jìn)行。
[0079] 10.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中在pH6. 5測(cè)定時(shí)，酶在52°C的溫度的乳糖酶活 性是其在38°C的溫度的乳糖酶活性的至少70%。
[0080] 11.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中向乳基底物以所述乳基底物中小于30LAU每g乳 糖的濃度加入酶。
[0081]12.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中向乳基底物以小于1000LAU每升乳基底物的濃 度加入酶。
[0082] 13.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中在水解乳基底物中的乳糖時(shí)，所述酶的乳糖酶與 轉(zhuǎn)半乳糖基酶的活性比例大于1:1。
[0083] 14.前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括如下步驟
[0084]c)用微生物發(fā)酵所述底物，
[0085] 其中所述乳制品是發(fā)酵乳制品。
[0086] 15.項(xiàng)14的方法，其中所述發(fā)酵的乳制品是酸奶。
[0087] 16.項(xiàng)14-15中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)和步驟c)基本上同時(shí)進(jìn)行。
[0088] 17.項(xiàng)14-16中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)的酶和步驟c)的微生物基本上同時(shí)加 入所述乳基底物。
[0089] 18.項(xiàng)14-17中任一項(xiàng)的方法，其中在發(fā)酵兩小時(shí)后少于80%的乳糖已被水解，并 且其中在最終的發(fā)酵乳制品中多于90%的乳糖已被水解。
[0090] 19.項(xiàng)14-18中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟C)完成時(shí)少于80%的乳糖已被水解， 并且其中在最終的發(fā)酵乳制品中多于90%的乳糖已被水解。
[0091] 20.項(xiàng)1-13中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)在至少60°C的溫度進(jìn)行。
[0092] 21.項(xiàng)20的方法，其中所述乳基底物是生乳，其在步驟b)前未進(jìn)行巴氏滅菌。
[0093] 22.項(xiàng)20-21中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)在62°C-64°C的溫度進(jìn)行10分鐘-4 小時(shí)，并且其中步驟b)之后為冷卻至KTC以下而不進(jìn)一步加熱處理。
[0094] 23.項(xiàng)20-22中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟b)完成時(shí)少于80 %的乳糖已被水解， 并且其中在一周后多于90%的乳糖已被水解。
[0095] 24.項(xiàng)20-21中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)在62°C-64°C的溫度進(jìn)行10分鐘-4 小時(shí)，并且其中步驟b)之后為UHT處理。
[0096] 發(fā)明詳述
[0097] 乳基底物
[0098] 術(shù)語"乳"，在本發(fā)明的背景中，應(yīng)理解為對(duì)任何哺乳動(dòng)物如牛、綿羊、山羊、水?；?駱駝擠奶而獲得的乳狀分泌物。
[0099] 在本發(fā)明的上下文中，"乳基底物"可以是任何生的和/或加工的乳材料。有用的 乳基底物包括，但不限于包含乳糖的任何乳或乳樣產(chǎn)品的溶液/懸浮液，如全脂或低脂乳、 脫脂乳、酪乳、復(fù)原乳粉（reconstitutedmilkpowder)、煉乳、干乳的溶液（solutionsof driedmilk)、UHT乳、乳清、乳清滲透液（wheypermeate)、酸性乳清（acidwhey)或乳脂 (cream)〇
[0100] 優(yōu)選地，乳基底物是乳或脫脂乳粉的水溶液。
[0101] 乳基底物可以比生乳更濃縮的。
[0102] 在一個(gè)實(shí)施方案中，乳基底物中蛋白質(zhì)與乳糖的比例為至少0. 2,優(yōu)選至少0. 3， 至少0. 4,至少0. 5,至少0. 6或者，最優(yōu)選地，至少0. 7。
[0103] 乳基底物可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法均質(zhì)化和巴氏滅菌。
[0104] "均質(zhì)化"在本文使用時(shí)表示充分混合以獲得可溶的懸浮液或乳液?？梢赃M(jìn)行均質(zhì) 化而將乳脂分解成更小的尺寸，使其不再與乳分離。這可以通過迫使乳在高壓通過小孔而 完成。
[0105] "巴氏滅菌"在本文使用時(shí)表示減少或消除乳基底物中活生物體（如微生物）的存 在。優(yōu)選地，通過將特定溫度保持特定時(shí)間而獲得巴氏滅菌。通常通過加熱而獲得特定的 溫度?？梢赃x擇溫度和持續(xù)時(shí)間，從而殺死或失活某些細(xì)菌，如有害的細(xì)菌，和/或失活乳 中的酶。然后可以進(jìn)行快速冷卻步驟。
[0106] 乳制品
[0107] 在本發(fā)明的上下文中，"乳制品"可以是任何食品，其中主要成分之一為乳基成分。 優(yōu)選地，主要成分為乳基成分。更優(yōu)選地，主要成分是乳基底物，其已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明的方法 用具有乳糖酶活性的酶處理。在本發(fā)明的上下文中，"主要成分之一"表示該成分具有占乳 制品總干物質(zhì)的超過20 %，優(yōu)選超過30 %或超過40 %的干物質(zhì)，而"主要成分"表示構(gòu)成該 成分具有占乳制品總干物質(zhì)的超過50 %，優(yōu)選超過60 %或超過70 %的干物質(zhì)。
[0108] 根據(jù)本發(fā)明的乳制品可以是，例如，脫脂乳、低脂乳、全脂乳、乳脂、UHT乳、具有延 長(zhǎng)的貨架期的乳品、發(fā)酵乳制品、乳酪、酸奶、奶油、乳質(zhì)涂抹料（dairyspread)、酪乳、酸化 乳飲料、酸奶油、乳清基飲料、冰激淋、煉乳、乳糖衆(zhòng)（dulcedeIeche)或調(diào)味乳飲料。乳制 品可以由本領(lǐng)域已知的任何方法生產(chǎn)。
[0109] 乳制品可以另外包括非乳成分，例如植物成分如，例如，植物油、植物蛋白和/或 植物糖。乳制品還可以進(jìn)一步包括添加劑如，例如，酶、調(diào)味劑、微生物培養(yǎng)物如益生培養(yǎng) 物，鹽、甜味劑、糖、酸、水果、果汁或本領(lǐng)域已知可作為乳制品成分或添加劑的任何其它成 分。
[0110] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種乳成分（milkcomponents)和/或乳級(jí) 分（milkfractions)占乳制品的至少50% (重量/重量），如至少70%，例如至少80%， 優(yōu)選至少90%。
[0111] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，已根據(jù)本發(fā)明的方法用具有乳糖酶活性的酶處理的 一種或多種乳基底物，占乳制品的至少50% (重量/重量），如至少70%，例如至少80%， 優(yōu)選至少90%。
[0112] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，乳制品是未通過加入半乳寡糖而富集的乳制品。
[0113] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用酶處理的乳基底物在作為乳制品的成分使用之前 未干燥。
[0114] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，乳制品是冰激凌。在本上下文中，冰激凌可以是任何 種類的冰激凌，如全脂冰激凌、低脂冰激凌或基于酸奶或其它發(fā)酵乳制品的冰激凌。冰激凌 可以通過本領(lǐng)域任何已知方法生產(chǎn)。
[0115] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，乳制品是乳或煉乳。
[0116] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，乳制品是UHT乳。在本發(fā)明的上下文中， UHT乳是已經(jīng)進(jìn)行了滅菌過程的乳品，所述滅菌過程意欲殺死所有微生物，包括細(xì)菌孢子。 UHT(超高溫）處理可以是，例如，在130°C熱處理30秒，或在145°C熱處理一秒。
[0117] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，乳制品是ESL乳。在本發(fā)明的上下文中，ESL 乳是由于微濾和/或熱處理而具有延長(zhǎng)的貨架期的乳品，并且其能在2-5°C在貨架上保持 新鮮至少15天，優(yōu)選至少20天。
[0118] 在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，乳制品是發(fā)酵乳制品，例如，酸奶。
[0119]發(fā)酵乳制品
[0120] 在本發(fā)明的上下文中，"發(fā)酵乳制品"應(yīng)理解為任何乳制品，其中任何類型的發(fā)酵 形成生產(chǎn)過程的一部分。發(fā)酵乳制品的實(shí)例是產(chǎn)品如酸奶、酪乳、鮮奶油（cr如iefraiche)、 酸奶酪（quark)和鮮奶酪（fromagefrais)。發(fā)酵乳制品可以由本領(lǐng)域任何已知的方法產(chǎn) 生。
[0121] 在本發(fā)明的方法中，"發(fā)酵"表示通過微生物的作用而將糖轉(zhuǎn)化成醇或酸。優(yōu)選地， 本發(fā)明的方法中的發(fā)酵包括將乳糖轉(zhuǎn)化成乳酸。
[0122] 在本發(fā)明的上下文中，"微生物"可以包括能發(fā)酵乳底物的任何細(xì)菌或真菌。
[0123] 用于大多數(shù)發(fā)酵乳品的微生物選自通常稱為乳酸細(xì)菌的細(xì)菌組。如本文所 使用的，術(shù)語"乳酸細(xì)菌"指革蘭氏陽性、微嗜氧或厭氧細(xì)菌，其發(fā)酵糖并產(chǎn)生酸，包 括乳酸作為主要產(chǎn)生的酸，以及乙酸和丙酸。工業(yè)上最有用的乳酸細(xì)菌可在乳桿菌 目（Lactobacillales)中找到，其中包括乳球菌屬菌種（Lactococcusspp.)、鏈球菌 屬菌種（Streptococcusspp.)、乳桿菌屬菌種（Lactobacillusspp.)、明串珠菌屬 菌種（Leuconostocspp.)、假明串珠菌屬菌種（Pseudoleuconostocspp.)、片球菌 屬菌種（Pediococcusspp.)、短桿菌屬菌種（Brevibacteriumspp.)、腸球菌屬菌種 (Enterococcusspp.)和丙酸菌屬菌種（Propionibacteriumspp.)。此外，乳酸細(xì)菌組中 通常包括屬于厭氧細(xì)菌雙歧桿菌，即雙歧桿菌屬菌種（Bifidobacteriumspp.)的組的乳酸 產(chǎn)生細(xì)菌，其常單獨(dú)用作食品培養(yǎng)物或與乳酸細(xì)菌組合。
[0124] 乳酸細(xì)菌通常以冷凍或凍干培養(yǎng)物形式供應(yīng)給乳業(yè)，用于生產(chǎn)用起子增殖（bulk starterpropagation)或者所謂的"直投式"（DVS)培養(yǎng)物，意欲直接接種入發(fā)酵容器或桶 中用于產(chǎn)生發(fā)酵乳制品。這種培養(yǎng)物通常稱作"起子培養(yǎng)物"或"起子"。
[0125] 常用的乳酸細(xì)菌的起子培養(yǎng)物菌株通常分成嗜常溫生物體（其最適生長(zhǎng)溫度 約30°C)，和嗜熱生物體（其最適生長(zhǎng)溫度在約40至約45°C的范圍內(nèi)）。屬于嗜常溫組 的典型生物體包括乳酸乳球菌（LactococusIactis)、乳酸乳球菌干酪亞種（Lactococus lactissubsp.cremoris)、腸膜狀明串珠菌干酪亞種（Leuconostocmesenteroides subsp.cremoris)、腸膜狀假明串珠菌干酷亞種（Pseudoleuconostocmesenteroides subsp.cremoris)、戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙醜 生物突變株（Lactococuslactissubsp.lactisbiovar.diacetylactis)、干酪乳桿菌 干酷亞種（Lactococuscaseisubsp.casei)和副干酷乳桿菌副干酷亞種（Lactococus paracaseisubsp.paracasei)^嗜熱乳酸細(xì)菌菌種包括例如嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus)、屎腸球菌（Enterococcusfaecium)、德氏乳桿菌乳酸亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.lactis)、瑞士 乳桿菌（Lactobacillushelveticus)、德氏乳桿 菌保加利亞亞種（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)和嗜酸乳桿菌 (Lactobacillusacidophilus)。
[0126] 屬于雙歧桿菌屬的厭氧細(xì)菌，包括雙岐雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌 (Bifidobacteriumanimalis)和長(zhǎng)雙歧桿菌（BifidobacteriumIongum)，也常用作乳品起 子培養(yǎng)物，并且通常包括在乳酸細(xì)菌組中。此外，丙酸桿菌屬的菌種可用作乳品起子培養(yǎng) 物，特別是在奶酪的生產(chǎn)中。此外，屬于雙歧桿菌屬的生物體通常用作食物起子培養(yǎng)物。
[0127] 另一組微生物起子培養(yǎng)物是真菌培養(yǎng)物，包括酵母培養(yǎng)物和絲狀真菌的培養(yǎng)物， 其特別用于某些類型的奶酪和飲料的生產(chǎn)中。真菌的實(shí)例包括婁地青霉（Penicillium roqueforti)、白青霉（Penicilliumcandidum)、白地霉（Geotrichumcandidum)、開菲爾圓 酵母（Torulakefir)、開菲爾酵母（Saccharomyceskefir)和釀酒酵母D
[0128] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用于乳基底物發(fā)酵的微生物是干酪乳桿菌或嗜熱鏈 球菌和德氏乳酸桿菌保加利亞亞種的混合物。
[0129] 本發(fā)明的方法中使用的發(fā)酵方法是公知的，并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解如何選擇 合適的工藝條件，如溫度、氧、微生物的量和性質(zhì)、添加劑如糖、調(diào)味劑、礦物質(zhì)、酶，和處理 時(shí)間。明顯地，可以選擇發(fā)酵條件以支持本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)。
[0130] 作為發(fā)酵的結(jié)果，乳基底物的pH降低。本發(fā)明的發(fā)酵乳制品的pH可以是，例如， 在3. 5-6的范圍中，如在3. 5-5的范圍中，優(yōu)選在3. 8-4. 8的范圍中。
[0131] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)酵的乳制品是酸奶。
[0132] 用于產(chǎn)牛乳制品的方法
[0133] 如上所述，本發(fā)明在一個(gè)方面涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括：
[0134]a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0135] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 1的氨基酸 28-1931或其片段至少70 %相同的氨基酸序列。
[0136] 在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括：
[0137]a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0138] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 2的氨基酸 28-1331至少70 %相同的氨基酸序列。
[0139] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括：
[0140]a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0141] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID N0:3或其片段 至少70%相同的氨基酸序列。
[0142] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括：
[0143]a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0144]b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID N0:4或其片段 至少70 %相同的氨基酸序列。
[0145] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括：
[0146]a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0147]b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID N0:5或其片段 至少70 %相同的氨基酸序列。
[0148] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括：
[0149]a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0150]b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID N0:6或其片段 至少70%相同的氨基酸序列。
[0151] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括：
[0152]a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0153] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID N0:7或其片段 至少70 %相同的氨基酸序列。
[0154] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括：
[0155]a)提供包含乳糖的乳基底物；和
[0156]b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，
[0157] 其中步驟b)在至少50 °C進(jìn)行。
[0158] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括
[0159]a)提供包含乳糖的乳基底物，
[0160] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，其中乳糖酶活性在37°C的最適pH 為pH5以上，并且在37°C測(cè)定時(shí)，其中酶在pH5的乳糖酶活性是其在pH6的乳糖酶活性 的至少50%。
[0161] 技術(shù)人員了解如何確定乳糖酶在不同pH的活性，并且從而確定酶的最適pH。通 過測(cè)定乳糖在37°C水解30分鐘，可以確定乳糖酶在不同pH的活性，優(yōu)選在包含琥珀酸、 HEPES、CHES、KC1、CaCljPMgCl2的緩沖液中，例如通過使用本申請(qǐng)的實(shí)施例中所述方法進(jìn) 行測(cè)定。為免存疑，ffiPES是緩沖劑，為4- (2-羥乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸，CHES是緩沖劑， 為N-環(huán)己基-2-氨基乙烷磺酸。
[0162] 用酶處理的乳基底物可以可選地與其它成分混合以獲得乳制品。在本發(fā)明的一個(gè) 實(shí)施方案中，用酶處理的乳基底物與其它成分混合以獲得乳制品。
[0163] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，乳制品是乳。在另一個(gè)實(shí)施方案中，乳制品是煉乳。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，乳制品是冰激凌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，乳制品是UHT乳。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，乳制品是ESL乳。在另一個(gè)實(shí)施方案中，乳制品是發(fā)酵的乳制品，例如，酸奶。
[0164] 優(yōu)選地，乳制品是低乳糖乳制品。"低乳糖"，在本發(fā)明的上下文中，表示乳制品如 發(fā)酵的乳制品中的乳糖量已經(jīng)降低至少70 %，優(yōu)選80 %，90 %，95 %，98 %，99 %或99. 5 %。
[0165] 用于產(chǎn)牛低乳糖的發(fā)酵乳制品的方法
[0166] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及用于產(chǎn)生低乳糖發(fā)酵乳制品的方法，其包括
[0167]a)提供包含乳糖的乳基底物，
[0168] b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，其中在37°C測(cè)定時(shí)，其中酶在pH 5的乳糖酶活性是其在pH6的乳糖酶活性的至少50%，和
[0169]c)用微生物發(fā)酵所述底物。
[0170] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于產(chǎn)生低乳糖發(fā)酵乳制品的方法，其包括
[0171] a)提供包含乳糖的乳基底物，
[0172]b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQIDNO: 1、SEQID NO: 2、SEQIDNO: 3、SEQIDNO:4、SEQIDNO: 5、SEQIDNO:6、SEQIDNO: 7 或這些序列中 任一個(gè)的片段至少70%相同的氨基酸序列，和
[0173]c)用微生物發(fā)酵所述底物。
[0174] 優(yōu)選地，在這些實(shí)施方案中，步驟b)和步驟c)基本上同時(shí)進(jìn)行。
[0175] 在本發(fā)明方法的上下文中，"基本上同時(shí)"表示酶處理和發(fā)酵不作為單獨(dú)的步驟進(jìn) 行，即，用酶溫育乳基底物不是在用微生物接種之前以單獨(dú)的步驟進(jìn)行。而是可以基本上在 同時(shí)向乳基底物加入酶和微生物，即，可以在即將用微生物接種之前向乳基底物中加入酶。 "即將…之前"在本文表示無用于酶水解的單獨(dú)溫育步驟?？蛇x地，可以在即將加酶之前加 入微生物，或者微生物和酶可以同時(shí)加入。在本發(fā)明方法的上下文中，"基本上同時(shí)"可以表 示酶在步驟c)的全部過程中是活性的。
[0176] "基本上同時(shí)"不表示當(dāng)發(fā)酵完成時(shí)，即當(dāng)pH降至可防止微生物起子培養(yǎng)物進(jìn)一步 發(fā)酵活性的水平時(shí)，乳基底物中乳糖的酶水解就完成。
[0177] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，酶在完成步驟c)后仍有活性。在一個(gè)更優(yōu)選的 實(shí)施方案中，與加至乳基底物時(shí)的酶活性相比，在完成步驟c)后，酶保持至少20 %，如至少 30%，至少40%，至少50%，至少60 %或至少70 %的乳糖酶活性。
[0178] 在步驟c)完成后可以表示下述條件中至少一個(gè)條件為真：
[0179]-溫度降至低于30°C
[0180] -pH達(dá)到 4. 55
[0181] -pH下降不再超過0.2單位每小時(shí)。
[0182] 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在發(fā)酵兩小時(shí)后，少于80%，如少于70%，少于60%， 少于50%，少于40%，少于30%，或者少于20%的乳糖已被水解。在本發(fā)明的上下文中，"發(fā) 酵兩小時(shí)后"表示在已經(jīng)接種微生物后，在發(fā)酵過程合適的溫度溫育乳基底物兩小時(shí)。
[0183] 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)乳基底物的pH降至pH5時(shí)，少于80%，如少于 70%，少于60%，少于50%，少于40%，少于30%，或者少于20 %的乳糖已被水解。
[0184] 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)步驟c)完成時(shí)，少于80%，如少于70%，少于60%， 少于50%，少于40%，少于30%，或者少于20 %的乳糖已被水解。
[0185] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在發(fā)酵開始后兩天，即48小時(shí)，乳基底物中超過70%， 如超過80 %，超過90 %，超過95 %，超過97 %，超過98 %或者超過99 %的乳糖已被水解。 "發(fā)酵開始"是用微生物接種乳基底物并在發(fā)酵過程適合的溫度溫育時(shí)。
[0186] 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在步驟c)完成后兩天，即48小時(shí)，乳基底物中超過 70%，如超過80%，超過90%，超過95%，超過97%，超過98%或者超過99%的乳糖已被水 解。
[0187]在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在最終的發(fā)酵乳制品中，乳基底物中的超過70 %，如超 過80 %，超過90 %，超過95 %，超過97 %，超過98 %或者超過99 %乳糖已被水解。"最終的 發(fā)酵乳制品"是作為銷售給顧客的產(chǎn)品的發(fā)酵乳制品。
[0188] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中將乳基底物發(fā)酵，優(yōu)選在發(fā)酵過程中在乳基底物的 天然pH進(jìn)行酶處理，S卩，pH將逐漸從未發(fā)酵的乳基底物的天然pH降至發(fā)酵乳基底物的pH。 在這一方面，優(yōu)選在發(fā)酵過程適合的溫度進(jìn)行酶處理。
[0189] 用于產(chǎn)牛具有延長(zhǎng)的貨架期的低乳糖飲料乳制品的方法
[0190] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及用于產(chǎn)生低乳糖乳制品的方法，其包括
[0191] a)提供包含乳糖的乳基底物，和
[0192]b)用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，
[0193] 其中步驟b)在至少60°C的溫度進(jìn)行。
[0194] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟b)在至少62°C，如至少63°C，更優(yōu)選在至少64,如 至少65°C，至少67°C或者至少70°C，并且最優(yōu)選在至少75°C的溫度進(jìn)行。
[0195] 低乳糖乳制品可以是具有比新鮮乳品更長(zhǎng)的貨架期的飲料乳，新鮮乳品通常的貨 架期為4-7天。與其它具有延長(zhǎng)的貨架期的低乳糖飲料乳制品相比，其可以具有改進(jìn)的質(zhì) 量。其可以，例如，具有更少的微生物計(jì)數(shù)，更淡的苦味和/或更淺的棕色。
[0196] 優(yōu)選地，乳制品是ESL乳。更優(yōu)選地，乳制品是UHT乳。
[0197] 在一個(gè)優(yōu)選的方面，乳基底物是生乳。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，乳基底物，優(yōu)選生乳， 在步驟b)前未經(jīng)巴氏滅菌。
[0198] 在一個(gè)優(yōu)選的方面，在步驟b)后不對(duì)經(jīng)酶處理的乳基底物進(jìn)行巴氏滅菌。
[0199]在一個(gè)優(yōu)選的方面，在步驟b)前進(jìn)行乳基底物的微濾。在這種情況下，酶應(yīng)該優(yōu) 選是無菌的。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，在步驟b)后對(duì)經(jīng)酶處理的乳基底物進(jìn)行微濾。
[0200] 在一個(gè)優(yōu)選的方面，步驟b)在62°C-64°C的溫度進(jìn)行10分鐘至4小時(shí)。在一個(gè) 更優(yōu)選的方面，步驟b)在62°C-64°C的溫度進(jìn)行20分鐘至2小時(shí)。在甚至更優(yōu)選的方面， 步驟b)在約63°C的溫度進(jìn)行20分鐘至60分鐘，如約30分鐘。對(duì)例如生乳的這種同時(shí)低 溫巴氏滅菌和乳糖酶處理所產(chǎn)生的低乳糖飲料乳與在低溫進(jìn)行乳糖酶處理（例如在5°C處 理多至24小時(shí)，如乳品業(yè)常用的）所產(chǎn)生的低乳糖飲料乳相比，具有更高的質(zhì)量。
[0201] 在一個(gè)更優(yōu)選的方面，步驟b)之后為冷卻至KTC以下而不進(jìn)一步熱處理。這將允 許酶在乳品冷卻后，即在保存期間，仍保持活性。優(yōu)選地，當(dāng)步驟b)完成時(shí)，少于80%的乳 糖已被水解，并且在一周后超過90%的乳糖已被水解。更優(yōu)選地，當(dāng)步驟b)完成時(shí)，少于 60%的乳糖已被水解，并且在一周后超過95%的乳糖已被水解。
[0202] 在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，步驟b)之后為UHT處理。
[0203] 具有乳糖酶活件的酶
[0204] 在本發(fā)明方法的步驟b)中，用具有乳糖酶活性的酶處理乳基底物。
[0205] 本發(fā)明上下文中，乳糖酶是能將二糖乳糖水解成成分半乳糖和葡萄糖單體的任何 糖苷水解酶。乳糖酶組包括但不限于指定為亞類EC3.2. 1.108的酶。指定為其它亞類如， 例如，EC3. 2. 1. 23的酶也可以是本發(fā)明上下文中的乳糖酶。本發(fā)明上下文中的乳糖酶可 以具有乳糖水解活性之外的其它活性，如轉(zhuǎn)半乳糖基活性。在本發(fā)明的上下文中，乳糖酶的 乳糖水解活性可稱為其乳糖酶活性或其0-半乳糖苷酶活性。
[0206] 本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶可以是動(dòng)物、植物或微生物來源的。優(yōu) 選的酶獲得自微生物來源，特別是來自絲狀真菌或酵母，或來自細(xì)菌。
[0207] 酶可以，例如，源自如下屬或種的菌株：蘑葫屬（Agaricus)，例如雙孢蘑葫 (A.bisporus) ;Ascovaginospora;曲霉屬，例如黑曲霉，泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉， 米曲霉；念珠菌屬（Candida);毛殼菌屬（Chaetomium);Chaetotomastia;網(wǎng)柄菌屬 (Dictyostelium)，例如盤基網(wǎng)柄菌（D.discoideum);克魯維酵母屬（Kluveromyces)， 例如脆壁克魯維酵母（K.fragilis)，乳酸克魯維酵母（K.Iactis);毛霉屬（Mucor)，例 如爪卩圭毛霉（M.javanicus)，高大毛霉（M.mucedo)，細(xì)孢毛霉（M.subtilissimus);脈 孢菌屬（Neurospora)，例如粗糙脈孢菌（N.crassa);根毛霉屬（Rhizomucor)，例如微 小根毛霉（R.pusiIlus);根霉屬（Rhizopus)，例如少根根霉（R.arrhizus)，日本根霉 (R.japonicus)，匍枝根霉（R.stolonifer);核盤霉屬（Sclerotinia)，例如白腐核盤霉 (S.Iibertiana);球擬酵母屬（Torulopsis);毛癬菌屬（Trichophyton)，例如紅色毛癬 菌（T.rubrum);維氏核盤菌屬（Whetzelinia)，例如W.sclerotiorum;芽抱桿菌屬，例 如凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，B.novalis，枯草芽孢桿菌，短小芽孢桿 菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌；雙歧桿菌屬（Bifidobacterium)，例如長(zhǎng)雙歧 桿菌，雙歧雙歧桿菌，動(dòng)物雙歧桿菌；金黃桿菌屬（Chryseobacterium);梓檬酸桿菌屬 (Citrobacter)，例如弗氏梓檬酸桿菌（C.freundii);梭菌屬（Clostridium)，例如產(chǎn)氣莢 膜梭菌（C.perfringens);色二孢屬（Diplodia)，例如棉色二孢（D.gossypina);腸桿菌屬 (Enterobacter)，例如產(chǎn)氣腸桿菌（E.aerogenes)，陰溝腸桿菌（E.cloacae);愛德華氏菌 屬（Edwardsiella)，遲鈍愛德華菌（E.tarda);歐文氏菌屬（Erwinia)，例如草生歐文氏菌 (E.herbicola);埃希氏菌屬（Escherichia)，例如大腸桿菌；克雷伯氏菌屬（Klebsiella)， 例如肺炎克雷伯氏菌（K.pneumoniae) ;Miriococcum;Myrothesium;毛霉屬；脈孢菌屬， 例如粗糙脈孢菌；變形菌屬（Proteus)，例如普通變形菌（P.vulgaris);普羅維登斯菌 屬（Providencia)，例如斯氏普羅維登斯菌（P.stuartii);密孔菌屬（Pycnoporus)，例 如朱紅密孔菌（Pycnoporuscinnabarinus)，血紅密孔菌（Pycnoporussanguineus);瘤 胃球菌屬（Ruminococcus)，例如扭鏈瘤胃球菌（R.torques);沙門氏菌（Salmonella)， 例如鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium);沙雷氏菌屬（Serratia)，例如液化沙雷氏菌 (S.Iiquefasciens)，粘質(zhì)沙雷氏菌（S.marcescens);志賀氏桿菌（Shigella)，例如弗氏 志賀菌（S.flexneri);鏈霉菌屬（Streptomyces)，例如抗生鏈霉菌（S.antibioticus)， 栗色球抱鏈霉菌（S.Castaneoglobisporus)，紫紅鏈霉菌（S.violeceoruber);檢菌屬 (Trametes);木霉屬（Trichoderma)，例如里氏木霉（T.reesei)，綠色木霉（T.viride);耶 爾森氏菌屬（Yersinia)，例如小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Y.enterocolitica)。
[0208] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶是來自細(xì)菌，例如來自雙歧桿菌科，如來自雙歧桿菌 屬，如來自雙歧雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌或長(zhǎng)雙歧桿菌的菌株的乳糖酶。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí) 施方案中，酶是來自雙歧雙歧桿菌的乳糖酶。優(yōu)選的酶是包含序列的乳糖酶，所述序列與 SEQIDNO: 1的氨基酸28-1931或其乳糖酶活性片段至少50%，如至少60%，至少70%，至 少80%，至少90%，至少95%或至少98%相同。SEQIDNO: 1的這種乳糖酶活性片段可以 是SEQIDNO: 1具有乳糖酶活性的任何片段。SEQIDNO: 1的乳糖酶活性片段可以是，例 如，SEQIDNO: 1的氨基酸28-979,氨基酸28-1170,氨基酸28-1323,氨基酸28-1331，或氨 基酸 28-1600。
[0209] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基酸 序列，所述序列與SEQIDN0:2的氨基酸28-1331至少50%相同。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方 案中，酶包含氨基酸序列，其與SEQIDN0:2的氨基酸28-1331至少60%，如至少70%，至 少80%，至少90%，至少95%或至少98%相同。
[0210] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基 酸序列，所述序列與SEQIDN0:2的氨基酸28-1331至少50%相同。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施 方案中，酶包含氨基酸序列，其與SEQIDN0:2的氨基酸28-1331至少60%，如至少70%， 至少80%，至少90%，至少95%或至少98%相同。
[0211] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基酸序 列，所述序列與SEQIDNO: 3至少50%相同。優(yōu)選地，酶包含氨基酸序列，其與SEQIDNO: 3 至少60%，如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或至少98%相同。
[0212] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基酸序 列，所述序列與SEQIDNO:4至少50%相同。優(yōu)選地，酶包含氨基酸序列，其與SEQIDNO:4 至少60%，如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或至少98%相同。
[0213] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基酸序 列，所述序列與SEQIDNO: 5至少50%相同。優(yōu)選地，酶包含氨基酸序列，其與SEQIDNO: 5 至少60%，如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或至少98%相同。
[0214] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基酸序 列，所述序列與SEQIDNO:6至少50%相同。優(yōu)選地，酶包含氨基酸序列，其與SEQIDNO:6 至少60%，如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或至少98%相同。
[0215] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基酸序 列，所述序列與SEQIDNO: 7至少50%相同。優(yōu)選地，酶包含氨基酸序列，其與SEQIDNO: 7 至少60%，如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或至少98%相同。
[0216] 就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度通過Needleman-Wunsch算法 (Needleman和Wunsch, 1970,J.Mol.Biol. 48:443-453)使用EMBOSS軟件包（EMBOSS:The EuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等（2000)TrendsinGenetics 16:276-277)的Needle程序來測(cè)定，優(yōu)選3. 0.0或更高的版本。使用的可選參數(shù)為缺口罰 分（gappenalty) 10,缺口延伸罰分（gapextensionpenalty)0. 5 和EBL0SUM62 取代矩陣 (BL0SUM62 的EMBOSS版）。使用Needle標(biāo)記為"最高同一性（longestidentity) "的輸出 結(jié)果（使用-nobrief選項(xiàng)獲得）作為同一性百分比，并計(jì)算如下：
[0217] (相同的殘基X100V(比對(duì)長(zhǎng)度一比對(duì)中缺口的總數(shù)）
[0218] 本發(fā)明的方法中使用的乳糖酶可以是胞外酶。它們可以在其N-末端包含信號(hào)序 列，所述信號(hào)序列在分泌過程中被切去。
[0219] 本發(fā)明方法中使用的乳糖酶可以源自本文所述的任何來源。術(shù)語"源自"在本上 下文中表示酶可以從天然存在所述酶的生物體分離，即酶的氨基酸序列的身份（identity) 與天然酶相同。術(shù)語"源自"還表示酶可以在宿主生物體中重組產(chǎn)生，其中重組產(chǎn)生的酶具 有與天然酶相同的身份，或具有修飾的氨基酸序列，例如，缺失、插入和/或取代一個(gè)或多 個(gè)氨基酸，即，重組產(chǎn)生的酶是天然氨基酸序列的突變體和/或片段。天然酶的意義中包含 天然變體。此外，術(shù)語"源自"包括通過例如肽合成而合成產(chǎn)生的酶。術(shù)語"源自"還包括已 經(jīng)通過例如糖基化、磷酸化等在體內(nèi)或體外修飾的酶。對(duì)于重組產(chǎn)生的酶，術(shù)語"源自"指 酶的身份而不是重組產(chǎn)生酶的宿主生物體的身份。
[0220] 可以通過使用任何合適的技術(shù)從微生物獲得乳糖酶。例如，乳糖酶制備物可通過 發(fā)酵合適的微生物和之后通過本領(lǐng)域公知的方法從所得的發(fā)酵液或微生物分離乳糖酶制 備物而獲得。乳糖酶還可以通過使用重組DNA技術(shù)而獲得。這種方法通常包括培養(yǎng)用重組 DNA載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述載體包含編碼所討論的乳糖酶的DNA序列，并且DNA序列與 合適的表達(dá)信號(hào)可操作地連接，使其能在允許酶表達(dá)的條件下在培養(yǎng)基中表達(dá)乳糖酶，并 從培養(yǎng)物回收酶。還可將DNA序列摻入宿主細(xì)胞的基因組中。DNA序列可以是基因組、cDNA 或合成來源，或它們的任何組合，并且可以按照本領(lǐng)域公知的方法分離或合成。
[0221] 可純化本發(fā)明的方法中使用的乳糖酶。本文中使用的術(shù)語"純化"包括基本上不 含來自酶的生產(chǎn)生物體的不溶成分的乳糖酶蛋白。術(shù)語"純化"還包括基本上不含來自獲 得酶的天然生物體的不溶組分的乳糖酶蛋白。優(yōu)選地，還可以從酶的來源生物體和培養(yǎng)基 的一些可溶成分分離。更優(yōu)選地，可以通過一種或多種單元操作來進(jìn)行分離：過濾、沉淀或 色譜/層析。
[0222] 因此，可純化具有乳糖酶活性的酶，即僅存在少量的其它蛋白質(zhì)。表述"其它蛋白 質(zhì)"具體涉及其它酶。本文使用的術(shù)語"純化"還指去除其它成分，特別是（存在于乳糖酶 的來源細(xì)胞中的）其它蛋白質(zhì)，最特別是存在于乳糖酶的起源細(xì)胞中的其它酶。乳糖酶可 為"基本上純的"，即，不含來自酶的生產(chǎn)生物體（即，例如，用于重組產(chǎn)生乳糖酶的宿主生 物體）的其它成分。優(yōu)選地，乳糖酶是至少40% (w/w)純，更優(yōu)選至少50%，60%，70%， 80 %或者甚至至少90 %純的酶蛋白制備物。
[0223] 術(shù)語具有乳糖酶活性的酶包括酶的催化活性必需的任何輔助化合物，如，例如，合 適的受體或輔因子，其可以或者可以不天然存在于反應(yīng)系統(tǒng)中。
[0224] 酶可以是適合于所述用途的任何形式，如，例如，為干粉或顆粒、無塵顆粒、液體、 穩(wěn)定化液體或受保護(hù)酶的形式。
[0225] 以合適的量加入酶，以在所選反應(yīng)條件下實(shí)現(xiàn)理想程度的乳糖水解。可以以 100-5000LAU每升乳基底物，優(yōu)選小于3000,如小于1500,小于1000,小于750或小于500， LAU每升乳基底物的濃度加入酶。
[0226] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以乳基底物中5-100LAU每g乳糖，優(yōu)選乳基底物中小 于50,如小于40,小于30,小于20或小于10,LAU每g乳糖酶的濃度加入酶。
[0227] 在本申請(qǐng)的上下文中，1個(gè)乳糖酶單位（ILAU)是在pH6.5和37°C，乳糖濃度為 4. 75%w/v，在M-緩沖液中每分鐘釋放1微摩爾葡萄糖的酶量。如下制備M-緩沖液：在 4 升水中溶解 3. 98gC6H5Na307-2H20,8. 31g檸檬酸，0? 9gK2S04,2. 6gK2HP04,7. 35gKH2PO4, 5. 45gK0H，4. 15gMgCl2-6H20,3. 75gCaCl2-2H20 和I. 4gNaHC03,加入 12. 5ml4NNaOH，使 用HCl調(diào)至pH6. 5,并加水至總體積為5升。
[0228] 通過在上述條件下直接測(cè)定從乳糖釋放的葡萄糖可以確定特定乳糖酶的以LAU 表示的活性。技術(shù)人員了解如何確定這種活性?？蛇x地，通過使用本申請(qǐng)實(shí)施例1中所述 的乳糖酶活性試驗(yàn)可以確定活性。在此處，通過與用已知活性的乳糖酶獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn) 行比較而獲得活性，并由此計(jì)算未知樣品的活性。已知活性的乳糖酶可，例如，是獲得自 NovozymesA/S,Denmark的Lacozym0
[0229] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中使用的具有乳糖酶活性的酶在37°C和 pH5具有的乳糖酶活性是其在37°C和pH6的乳糖酶活性的至少55%，如至少60%，至少 65%，至少70%或至少75%。
[0230] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶在37°C和 pH4. 5具有的乳糖酶活性是其在37°C和pH6的乳糖酶活性的至少10%，如至少20%，至 少30%，至少35%或至少40%。
[0231] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶在37°C的 乳糖酶活性的最適pH為pH5. 5以上。
[0232] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶在52°C和 pH6. 5的乳糖酶活性是其在38°C和pH6. 5的乳糖酶活性的至少50%，如至少55%，至少 60%，至少65%，至少70%，至少75%或至少80%。
[0233] 技術(shù)人員了解如何確定不同在pH和溫度的乳糖酶活性。優(yōu)選通過使用本申請(qǐng)的 實(shí)施例中所述的方法確定不同PH和溫度的乳糖酶活性。
[0234] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，具有乳糖酶活性的酶在5°C的Km為25mM以下， 如20mM以下，15mM以下或IOmM以下。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有乳糖酶活性的酶在 37°C的Km為25mM以下，如20mM以下或15mM以下。技術(shù)人員了解如何確定在特定的溫度 時(shí)乳糖酶活性的Km?？梢酝ㄟ^本申請(qǐng)的實(shí)施例中使用的方法確定Km。
[0235] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，水解乳基底物中的乳糖時(shí)，酶具有超過1:1，如超過 2:1或超過3:1的乳糖酶與轉(zhuǎn)半乳糖基酶活性的比例。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在酶 的乳糖酶活性高于轉(zhuǎn)半乳糖基酶活性的條件下進(jìn)行酶處理，如乳糖酶活性為轉(zhuǎn)半乳糖基酶 活性的至少兩倍高或者至少三倍高。乳基底物中乳糖酶活性與轉(zhuǎn)半乳糖基酶活性的比例可 以，例如，由HPLC分析確定。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在水解的乳糖的至少50% (w/ w%)轉(zhuǎn)化成游離半乳糖的條件下進(jìn)行酶處理。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在水解的乳糖 轉(zhuǎn)化成等量的游離葡萄糖和游離半乳糖的條件下進(jìn)行酶處理。
[0236] 實(shí)施例1
[0237] 在37°C，pH6. 5,在微量離心管（eppendorftube)中的乳糖酶活性試驗(yàn)
[0238]原理：
[0239] 乳糖酶將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。根據(jù)修正版本的普通葡萄糖氧化酶/過氧 化物酶試驗(yàn)（Werner,W?等（1970)Z.analyt.Chem. 252:224)測(cè)定葡萄糖。
[0240] LAU定義為在37°C，pH6. 5,在M-緩沖液（M-緩沖液在本專利申請(qǐng)的描述中定 義）中每分鐘釋放1微摩爾葡萄糖的酶量?？蛇x地，對(duì)于特定乳糖酶，以LAU表示的活性可 以通過本文所述方法確定。將獲得的數(shù)值與用活性已知的乳糖酶得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比 較，并且由此計(jì)算未知樣品的活性。已知活性的乳糖酶可以是，例如，獲得自NovozymesA/ S，Denmark的Lactozym0
[0241]溶液:
[0242] 試驗(yàn)緩沖液：50mM琥珀酸，50mMHEPES，50mMCHES，150mMKCl，2mMCaCl2,ImM MgCl2,0. 01%TritonX100,pH6. 5〇
[0243] GOD-Perid溶液：65mM磷酸鈉，pH7,0. 4g/l葡萄糖氧化酶，0. 013g/lHRP(辣根 過氧化物酶），0.65§/148了3(2,2'-連氮基-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2,2'- &4 n〇-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonicacid)))〇
[0244]底物:
[0245] 160mM乳糖，50mM琥珀酸，50mMHEPES，50mMCHES，150mMKCl，2mMCaCl2,ImM MgCl2,pH6. 5〇
[0246] fa準(zhǔn)品:
[0247] 將具有以LAU/g表示的已知活性的Lactozym(可由NovozymesA/S，Denmark獲 得）用作標(biāo)準(zhǔn)品，用試驗(yàn)緩沖液稀釋至〇. 09-0. 7LAU/g的范圍內(nèi)。
[0248]樣品:
[0249] 將酶樣品在試驗(yàn)緩沖液中適當(dāng)稀釋。
[0250]討稈：
[0251] 1?將375y1底物在37°C溫育5分鐘。
[0252] 2.加入在試驗(yàn)緩沖液中稀釋的25y1酶。
[0253] 3.在30分鐘后通過加入60yIIMNaOH而終止反應(yīng)
[0254] 4.將20y1轉(zhuǎn)移至96孔微量滴定板并加入200yIGOD-Perid溶液。在室溫30 分鐘后，在420nm測(cè)定吸光度。
[0255] 實(shí)施例2
[0256] 通過在91ml離子水中混合9g脫脂乳粉（Kerry)而制得具有約5%乳糖的IOOrnl 9%脫脂乳溶液。將IOml溶液轉(zhuǎn)移至包含磁力攪棒的試管中并置于37°C的水浴中。15分 鐘后加入酶。測(cè)試的酶是Lactozym，一種來自NovozymesA/S,Denmark的商業(yè)上可得到的 乳糖酶（活性為3060LAU/g)，和來自雙歧雙歧桿菌的實(shí)驗(yàn)乳糖酶，其具有SEQIDN0:2中所 示的編碼序列并且活性為295LAU/g。SEQIDNO:2的氨基酸1至27是信號(hào)序列，其據(jù)推測(cè) 可切割，并且氨基酸1332至1341是用于純化實(shí)驗(yàn)酶的標(biāo)簽。
[0257] 劑量為5640LAU/1乳的Lactozyme和2700LAU/1乳的雙歧桿菌屬乳糖酶。每隔固 定時(shí)間取乳樣品，直至4小時(shí)，并且通過在熱混合器中加熱至99°C10分鐘而使酶失活。將 樣品適當(dāng)稀釋并通過0. 20ym濾器過濾。
[0258] 使用配備有DionexPAl柱和PulsedAmperiometriskDetektor(PAD)的Dionex BioLC測(cè)定乳糖水解。通過與乳糖、葡萄糖和半乳糖的已知標(biāo)準(zhǔn)品比較而鑒定和定量峰。結(jié) 果如下。
[0259] 表1 :用Lactozym或雙歧桿菌屬乳糖酶處理后的復(fù)原脫脂乳中的乳糖、葡萄糖和 半乳糖。
[0260]

【權(quán)利要求】
1. 用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括 a) 提供包含乳糖的乳基底物；和 b) 用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID N0:2的氨基酸 28-1331至少70 %相同的氨基酸序列。
2. 用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括 a) 提供包含乳糖的乳基底物；和 b) 用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 1的氨基酸 28-1931或其片段至少70 %相同的氨基酸序列。
3. 用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括 a) 提供包含乳糖的乳基底物；和 b) 用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID N0:3-4中任一序列 或這些序列中任一個(gè)的片段至少70%相同的氨基酸序列。
4. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶源自雙歧桿菌屬（Bifidobacterium)的 微生物。
5. 用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括 a) 提供包含乳糖的乳基底物；和 b) 用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有與SEQ ID N0:5-7中任一序列 或這些序列中任一個(gè)的片段至少70%相同的氨基酸序列。
6. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在37°C乳糖酶活性的最適pH為pH 5以上，并 且其中在37°C測(cè)定時(shí)，酶在pH 5的乳糖酶活性為在pH 6時(shí)其乳糖酶活性的至少50%。
7. 用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括 a) 提供包含乳糖的乳基底物；和 b) 用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，其中在37°C乳糖酶活性的最適pH為pH 5以上，并且其中在37°C測(cè)定時(shí)，酶在pH 5的乳糖酶活性為在pH 6時(shí)其乳糖酶活性的至少 50%〇
8. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)在至少50°C的溫度進(jìn)行。
9. 用于產(chǎn)生乳制品的方法，其包括 a) 提供包含乳糖的乳基底物；和 b) 用酶處理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性， 其中步驟b)在至少50°C的溫度進(jìn)行。
10. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在pH 6. 5測(cè)定時(shí)，酶在52°C的溫度的乳糖酶 活性是其在38°C的溫度的乳糖酶活性的至少70%。
11. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中向乳基底物以所述乳基底物中小于30LAU每g 乳糖的濃度加入酶。
12. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中向乳基底物以小于1000LAU每升乳基底物的 濃度加入酶。
13. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在水解乳基底物中的乳糖時(shí)，所述酶的乳糖酶 與轉(zhuǎn)半乳糖基酶的活性比例大于1:1。
14. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括如下步驟 C)用微生物發(fā)酵所述底物， 其中所述乳制品是發(fā)酵乳制品。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述發(fā)酵的乳制品是酸奶。
16. 權(quán)利要求14-15中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)和步驟c)基本上同時(shí)進(jìn)行。
17. 權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)的酶和步驟c)的微生物基本上同時(shí) 加入所述乳基底物。
18. 權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)的方法，其中在發(fā)酵兩小時(shí)后少于80%的乳糖已被水解， 并且其中在最終的發(fā)酵乳制品中多于90%的乳糖已被水解。
19. 權(quán)利要求14-18中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟c)完成時(shí)少于80%的乳糖已被水 解，并且其中在最終的發(fā)酵乳制品中多于90%的乳糖已被水解。
20. 權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)在至少60°C的溫度進(jìn)行。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述乳基底物是生乳，其在步驟b)前未進(jìn)行巴氏滅菌。
22. 權(quán)利要求20-21中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)在62°C _64°C的溫度進(jìn)行10分鐘-4 小時(shí)，并且其中步驟b)之后為冷卻至10°C以下而不進(jìn)一步加熱處理。
23. 權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟b)完成時(shí)少于80%的乳糖已被水 解，并且其中在一周后多于90%的乳糖已被水解。
24. 權(quán)利要求20-21中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)在62°C _64°C的溫度進(jìn)行10分鐘-4 小時(shí)，并且其中步驟b)之后為UHT處理。
【文檔編號(hào)】A23C9/12GK104472683SQ201410582555
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2008年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2007年12月3日
【發(fā)明者】漢恩.V.亨里克森, 斯蒂芬.厄恩斯特, 萊因哈德.威爾廷, 杰普.W.塔姆斯, 梅特.O.朗格, 赫勒.S.古爾達(dá)格 申請(qǐng)人:諾維信公司, 克爾.漢森公司